Cómo estabilizar proteínas: pantallas estabilidad térmica cambio ensayos y diferencial de Nano fluorimetría en el proyecto de Virus X

Muchas enzimas útiles biotechnologically originan de fuentes virales, tales como el tabaco etch virus (TEV) proteasa¹ y rinovirus humano tipo 3 C (HRV 3C) proteasa². El proyecto (figura 1) Horizon2020 Virus-X³. El objetivo de este programa es (a) extender el rango de las propiedades de las familias de la enzima conocida y (b) caracterizar nuevas enzimas de función aún desconocida (enzima X). Determinación de la estructura cristalográfica desempeña un papel fundamental en la caracterización de la proteína objetivo, particularmente en aquellos casos en donde las secuencias de proteínas han evolucionado más allá de reconocimiento⁴. Estabilidad de la proteína es un factor clave en el proceso de cristalización; las muestras deben ser conformationally homogénea y estructuralmente durante un período de tiempo a forma de alta calidad, cristales de diffracting. Además, es esencial para los ensayos de actividad que las proteínas existen en su conformación activa, que también puede ser facilitado por un favorable entorno molecular.

A pesar del desarrollo en la tecnología disponible para cristalógrafos, cristalización de proteínas sigue siendo un proceso largo y requiere mano de obra empírica⁵. Experimentos preliminares biofísicos para mejorar la estabilidad de la proteína en solución dan claramente un punto de partida mejor para la cristalización de proteínas y generalmente consuman sólo una cantidad comparativamente pequeña de proteína muestra^{6,7, 8,9}. La gran cantidad de proteínas de la blanco que se estudiarán en este proyecto también requiere un análisis de estabilidad, escalable, de alto rendimiento. Uno de los métodos más populares para la caracterización biofísica de la cristalización de las proteínas es el ensayo de cambio térmico (también conocido como TSA o diferencial de fluorimetría, DSF)^10,11.

TSAs emplean un colorante fluorescente ambientalmente sensible a la desnaturalización térmica de las muestras de proteína. Muchos colorantes utilizados comúnmente tienen actividad de fluorescencia variable dependiendo de la polaridad de su entorno, a menudo mostrando una salida de alta fluorescencia en entornos hidrófobos pero sometidos a enfriamiento rápido en ambientes polares¹². Proteínas generalmente causan aumentos pronunciados en la fluorescencia del tinte como sus corazones hidrofóbicos verse expuestos durante la desnaturalización, a menudo seguida por una disminución de la fluorescencia del tinte a muy altas temperaturas como las proteínas comienzan a agregados (figura 2).

Mientras que un tinte sensible a la hidrofobicidad es a menudo una buena opción para un tinte TSA de uso general, puede ser inadecuado para proteínas con regiones hidrofóbicas grandes, expuestos al solvente, que a menudo muestran fluorescencia del fondo perjudicialmente altos. Fluoróforos con modos alternativos de acción existen (ver discusión), pero en cambio puede ser deseable para seguir la desnaturalización a través de la fluorescencia intrínseca de proteínas con nanoDSF.

Residuos de triptófano que están enterrados en las regiones no polares de una proteína es fluorescente con un máximo de emisión de 330 nm. Como una muestra de la proteína se despliega y estos residuos se convierten en expuesto a un solvente polar, su máximo de emisión somete a un cambio bathochromic a 350 nm¹³. nanoDSF aprovecha este cambio de emisión máxima para el despliegue de una muestra de proteína sin necesidad de fluoróforos extrínsecos¹⁴.

Derretir las curvas que muestra pasos de desnaturalización solo pueden analizarse introduciendo datos a un modelo sigmoidal de Boltzmann. La temperatura en el punto de inflexión de la transición de despliegue (T_m) se utiliza como una medida cuantitativa de estabilidad térmica de la proteína y un punto de referencia para comparar la favorabilidad de diversas condiciones.

Curvas de fusión de la misma proteína en diferentes condiciones a veces poseen un grado de heterogeneidad que puede hacer inviable un ajuste sigmoidal de Boltzmann. Para discernir los valores de_m de T de los datos que se desvía de la topología clásica curva, pueden utilizarse métodos numéricos tales como los empleados en NAMI, un programa open source TSA datos análisis¹¹. Marcos termodinámicos alternativos también pueden utilizarse para analizar curvas más complejas con múltiples pasos de desnaturalización, como la metodología de ProteoPlex¹⁵.

Las pantallas de estabilidad fueron diseñadas para su uso en experimentos de TSA y nanoDSF para identificar rápidamente las condiciones favorables para una proteína diana (figura 3, composiciones de pantalla están disponibles en la información complementaria). Información recogida con las pantallas se puede utilizar en muchas etapas de la pipeline cristalográfico, incluyendo: muestra de almacenamiento; purificación, minimizando la pérdida de rendimiento a través de la proteína desplegar durante el proceso de purificación; ensayo diseño, reforzar la funcionalidad de la proteína en los ensayos de actividad con estabilización térmica almacenadores intermediarios y finalmente la cristalización, guía ensayos de cristalización racionalmente diseñado.

Elegir una base de sistema tampón adecuado para una muestra de la proteína es vital; valores de pH incompatibles pueden conducir a la desactivación o la desnaturalización de una proteína. Sin embargo, la presencia de moléculas de co cristalizado búfer resuelto en un gran número de estructuras cristalinas de la radiografía (tabla 1) también podría ser indicativa de un efecto estabilizador que está separado a la regulación de pH simple y en lugar de ello se deriva la química características de la molécula de búfer.

Formulado utilizando varios buffers^17,18,19 junto a otros sistemas comúnmente biológicamente compatible con buffer de buenos, la pantalla de pH está diseñada para deconvolucionar el efecto químico de una molécula de tampón en estabilidad de la proteína desde el pH real de la solución resultante. Proporciona tres valores de pH para cada sistema buffer e incorporando redundancia del valor de pH entre los diferentes sistemas, la pantalla de pH puede identificar valores favorables de pH y sistemas buffer favorable para una proteína de la blanco.

La pantalla de sal contiene comúnmente sales de laboratorio así como chaotropes, chelants, metales pesados y agentes reductores. La pantalla puede dar una indicación general de la afinidad de una muestra de proteína a los entornos con alta fuerza iónica, pero cada subgrupo de los compuestos también puede proporcionar información sobre la posible estructura de una proteína. Por ejemplo, un fertilizantes quelatados significativamente desestabilizar una proteína podrían ser indicativo de metales estructurales importantes dentro de la muestra. Si la muestra es también fuertemente estabilizada por un catión metálico dentro de la pantalla, esto puede proporcionar un punto de partida prometedor para experimentos estructurales adicionales.

Osmolitos son compuestos solubles que afectan las propiedades osmóticas de su medio ambiente. En la naturaleza, pueden ser utilizados como "chaperonas químicas", aplicar el plegamiento de proteínas desordenadas y estabilización, especialmente en condiciones de estrés^20,21,22. Estas características hacen atractivas aditivos en Cristalografía de la proteína; utilizable como crioprotectores durante la cosecha de cristal, montaje y almacenamiento procesos²³. Uso potencial de osmolitos se extiende también a la purificación de proteínas. Una proporción significativa de las proteínas recombinantes expresadas en e. coli puede ser insoluble y difícil de recuperar en el estado nativo usando métodos de purificación estándar. Osmolitos pueden utilizarse para estabilizar y salvar fracciones insolubles de proteínas, purificación cada vez mayor rinde²⁴.

La pantalla del osmolyte fue diseñada usando establecidos compuestos presentes en el Protein Data Bank entradas²⁵ y la base de datos de Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vías (DEOP)²⁶ y había optimizado iterativamente usando proteínas estándar. La pantalla está construida alrededor de ocho subclases de osmolyte: glicerol, azúcares y polioles, detergente no sulfobetaines (NDSBs), betaínas y sus análogos, organofosforados, dipéptidos, aminoácidos y sus derivados y un último grupo misceláneo. Cada osmolyte está presente en concentraciones múltiples basadas en su solubilidad y rangos de concentración efectiva para comparación.

1. preparación de la muestra de proteína

1. Formular las pantallas estabilidad como 500 alícuotas μL en bloques de 96 pocillos y sello para el almacenamiento. Transferir 10 μl de cada condición de una pantalla de estabilidad a los correspondientes de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal para ahorrar tiempo (figura 4A).
2. Preparar 1 mL de una solución de proteína aproximadamente 1, mg mL^-1 en un sistema apropiado. Mientras que la composición de un tampón apropiado varía con cada muestra de proteína, un buen buffer primera intentar es fosfato de sodio 10 mM con 100 mM NaCl, pH 7.2.
   Nota: Concentraciones de proteínas aceptable varían caso por caso, pero los rangos de concentración de 0.5 - 5 mg mL^-1 suelen producen curvas analizables. Tampones diluidos se recomiendan para el uso con las pantallas de estabilidad para evitar enmascarar los efectos de cada condición. Composiciones típicas buffer son aproximadamente 10 mM de tampón con alrededor de 100 mM de NaCl.
3. Si se realiza un experimento TSA, añadir colorante SYPRO Orange a la muestra de proteína a una concentración final de 20 x. Mezclar bien por inversión o Vortex breve.
4. Transferir 10 μl de la solución de proteína en cada pocillo de la placa de 96 pocillos preparada en el paso 1.1 (figura 4B).
5. Sello y centrifugar la placa de 96 pocillos por 2 min a 600 x g para el componente proteico de la muestra y la pantalla se mezclan (figura 4C).
6. Volver a cerrar la pantalla de estabilidad bloque pozo profundo y guarde la pantalla a 4 ° C hasta por 4 meses. Guarde la pantalla sal en la oscuridad, ya que algunos componentes son fotosensibles.
7. Si se realiza un experimento de nanoDSF, continuar al paso 2. Si se realiza un experimento TSA, vaya al paso 4.

2. preparación de un experimento de nanoDSF

1. Asegúrese de que el equipo esté limpio, prestando especial atención a cualquier polvo cerca de la gradilla de muestras. Si el sistema tiene un espejo de retrodispersión, limpiar con etanol y una pelusa.
2. Abrir el cajón de muestra pulsando el botón de Cajón abierto . (Figura 5A).
3. Cargar los capilares con aproximadamente 10 μl de cada pocillo de la placa de 96 pocillos por tocar un extremo del tubo capilar en la solución, luego colocarlos en los correspondientes soportes capilares de la gradilla de muestras (figura 5B). Tenga cuidado de no contaminar el medio de los capilares con las huellas dactilares, etcetera., ya que esto podría interferir con la lectura de fluorescencia durante todo el experimento.
4. Inmovilizar los capilares con la tira del lacre magnético (figura 5C).

3. programar un nanoDSF experimento

1. Iniciar una exploración preliminar para detectar la posición y la intensidad de cada capilar presionando el botón Iniciar exploración de descubrimiento en la ficha de Descubrimiento exploración aumento o disminución de la fuerza de excitación incidente de una potencia inicial de 10% hasta el máxima de cada análisis capilar está entre 4.000-12.000 unidades(figura 5).
2. Para asegurar la muestra es doblada y suficientemente concentrada, se recomienda una exploración de la fusión inicial con un escarpado gradiente de la temperatura. En la ficha De fusión escanear , programa un derretimiento analizar la opción de Temperatura cuesta de 7,0 ° C min^-1, Iniciar la temperatura a 25 ° C y la Temperatura final a 95 ° C, luego lanzar el nanoDSF experimentar pulsando el Iniciar fusión botón. Si la resultante del derretimiento curvas no muestran un punto de inflexión detectable, considere concentrando la muestra más o comprobar si la proteína se dobla correctamente.
3. Repita los pasos 2.1-2.4 para preparar las muestras para un experimento completo.
4. En la ficha De fusión escanear , programa un derretimiento analizar la opción de Pendiente de la temperatura de 1.0 ° C min^-1, Iniciar la temperatura a 25 ° C y la Temperatura final a 95 ° C, luego lanzar el nanoDSF experimentar pulsando el botón de Inicio de fusión .

4. realizar un experimento TSA

1. Abrir el cajón de muestra presionando firmemente el guión en el lado derecho del cajón. Coloque la bandeja de 96 pocillos en el sistema de RT-PCR con A1 bien a la izquierda detrás (figura 4D).
2. Pulsa el botón Nuevo experimento para empezar a configurar un experimento TSA.
3. En la ficha del Experimento de propiedades , haga clic en la opción Curva fundir cuando se le preguntó ¿Qué tipo de experimento quieres configurar? y la otra opción cuando se le preguntó reactivos que desea utilizar para detectar la secuencia Diana?
4. En la instalación de placa / definir objetivos y muestras ficha, escriba un nombre de destino entonces establecer reportero como ROX y extintor como ninguno.
5. En la instalación de placa / asignar objetivos y muestras pestaña, asignar a cada pocillo de la placa de 96 pocillos para el nombre del destino en el paso anterior. En la misma ficha, establezca Seleccione el tinte a utilizar como referencia pasiva como ninguno.
6. En la ficha Método Run , eliminar pasos hasta que haya un total de tres. Establecer el primer paso a 25,0 ° C, rampa tipo 100%, tiempo 00:05; el segundo paso a 95,0 ° C, rampa tasa 1%, tiempo de 1:00; el tercer paso a 95,0 ° C, rampa tipo 100%, tiempo 00:05. Elegir para recopilar datos utilizando el menú desplegable de Recoger datos o pulsando el icono de la Colección de datos (figura 6).
7. Ajuste el volumen de reacción por pozo a 20 μl.
8. Presione el botón de Inicio ejecutar para comenzar el experimento de la TSA.

5. Análisis de datos

1. Elegir una longitud de onda para trazar una curva de fusión con. Para los experimentos de nanoDSF, la relación de intensidades de fluorescencia en 330 nm y 350 nm (correspondiente al triptófano en entornos no polares y polar, respectivamente)¹³ es de uso general. Para la mayoría de TSA, la emisión de tinte máximo es adecuada para el trazado de la curva de fusión (la máxima emisión de SYPRO Orange es de 569 nm)¹².
2. Calcular los valores de_m de T de cada condición mediante la determinación de los puntos de inflexión de cada curva de fusión. Mayoría de los sistemas nanoDSF calcula automáticamente valores de_m T por la diferenciación numérica de las curvas de fusión después de la adquisición de datos. Si el software utilizado no calcula automáticamente los valores de_m T, software libre, alternativa basada en GUI como NAMI¹¹ puede automatizar análisis de datos y río abajo procesando, dando la opción de producir un mapa de calor resumiendo T_m valores para todo el experimento de 96 pocillos (la referencia que proporciona orientación y recursos para el procesamiento de datos con NAMI).
3. Comparar los valores de_m de T de todas las condiciones encuestados. Las pantallas de estabilidad contienen dos pozos en cada pantalla (A1 y A2) que contienen solamente agua. Tomando los valores de agua solamente como punto de referencia permite calcular valores de_m ΔT, abordar errores sistemáticos y que permite la comparación fácil de estabilizar efectos. Valores más altos de_m T indican condiciones térmicamente estabilizadoras que se recomiendan para uso río abajo. Condiciones prometedoras a menudo muestran una dependencia de la concentración en su estabilización.

Lisozima fue probada con las pantallas de la estabilidad y la proteína X, una proteína diana en el proyecto de Virus X, fue probada con la pantalla osmolyte. Ambas proteínas producidas generalmente derriten las curvas con transiciones de desnaturalización definida claramente en experimentos TSA y nanoDSF (ver acompañando a figuras de curvas representativas). En algunos casos donde las muestras que no producen curvas interpretable con una transición de desnaturalización definida fueron interpretadas como desnaturalizadas y no esta incluidas en las comparaciones dem de T.

La figura 7 muestra resultados de la muestra en la pantalla sal, ejemplificar las propiedades de estabilización térmica de cloruro de amonio a la lisozima. Dependencias de concentración como el que se muestra arriba a menudo son indicativas de condiciones prometedoras, pero puede ser útil para comparar los resultados de aumento de la concentración de iones con varias diferentes sales para ver si estabilización térmica generalmente surge de un aumento de la fuerza iónica del buffer o si la presencia de iones específicos confiere estabilidad adicional.

Comparación de los valores dem de T de la lisozima con la pantalla de pH (figura 8) revela dos pedazos de información. En primer lugar, hay una tendencia general de aumento de estabilidad con la disminución de los valores de pH. En segundo lugar, los valores dem rango de T obtenidos mediante sistemas tampón diferentes con valores de pH idénticas pueden ser significativos.

Datos en la figura 8 indican que el acuerdo entre TSA y nanoDSF en este experimento es generalmente bueno, pero nanoDSF muestra una tendencia a identificar valores ligeramente mayores dem T y un poco más grande Tm cambios de TSA. Sin embargo, algunos pozos con valores de pH superiores a 8.5 muestran grandes discrepancias entre los valores dem T obtenidos de TSA y nanoDSF. Diferencias potencialmente podrían atribuirse al mecanismo de la desnaturalización de la proteína a valores de pH diferentes; por ejemplo, un colorante sensible a la hidrofobicidad podría dar un comparativamente bajo Tm si hidrofóbicas regiones de una proteína verse expuestas al solvente significativamente más rápido que el ambiente de cambios de residuos de triptófano en la polaridad de la lectura.

La figura 9 muestra un mapa de calor de Tm valores obtenidos con lisozima utilizando la pantalla osmolyte. Condiciones con el más alto Tm aumenta en comparación con los pocillos de control (pozos A1 y A2, que contiene agua desionizada) son de color azul oscuro. Condiciones especialmente estabilización identificadas en la figura 9 incluyen glicerol, D-sorbitol 1 M, hipotaurina 100 mM y 10 mM Ala-Gly (pozos A4-A6, A9, E7 y F8, respectivamente).

La figura 10 muestra un heatmap de Tm valores obtenidos con la proteína X. TSA y experimentos de nanoDSF con la pantalla Osmolyte revelan que la mayoría de los osmolitos probado o un aumento menor en Tm (dentro de 1 ° C) o tener un efecto perjudicial en la estabilidad de la proteína x. En particular, el ácido dipicolinic en una concentración de 10 mM (bien D1) parece desnaturalizar la muestra a temperatura ambiente. Los resultados de TSA y nanoDSF identifican rápidamente ácido dipicolinic como aditivo incompatible para X de proteína que debe ser evitada cuando se trabaja con la proteína. Sin embargo, altas concentraciones de D-sorbitol y arabinosa (pozos A9 y B9, ambos a 1 M) así como glicerol y OTMA (pozos A4-A6 y E1, respectivamente) fueron identificados como estabilizar térmicamente.

Para lisozima, combinaciones de condiciones de rendimiento los valores más altos dem T de cada pantalla de estabilidad fueron probados para la punta de prueba de un efecto combinado sinérgico. La figura 11 muestra un aumento general en los valores dem T como más componentes del sistema tampón (pH, sal y osmolyte) se agregan. En el caso del MES, sulfato de amonio y el d-sorbitol, un Tm aumentar tan grande como 10 ° C puede observarse cuando todos los componentes están presentes en comparación con el MES solo. La figura 11 muestra que un notable efecto sinérgico puede ocurrir cuando los componentes individuales de un tampón se optimizado y combinados con las pantallas de estabilidad.

De manera más general, figura 11 también muestra la magnitud de los valores dem ΔT que puede ser observado en TSA y nanoDSF experimentos. La magnitud de ΔTm alcanzable varía significativamente basado en el sistema de la proteína, pero cualquier valor dem ΔT alrededor y por encima de 5 ° C a menudo es indicativo de un beneficioso efecto estabilizador.

Figura 1 : Bioprospección. Recogida de muestras de un ambiente extremo en el proyecto de Virus X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: esquema TSA. Ejemplo anotado de una curva de fusión típicos obtenida de un experimento TSA. Esta curva es característica de la proteína de "dos Estados" clásico despliegue, donde la población muestra las transiciones de dobla a desnaturalizado sin intermediarios detectables parcialmente plegada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Estabilidad de pantallas de flujo de trabajo. Flujo de trabajo estándar de optimización de búfer mediante las pantallas de estabilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Flujo de trabajo de una norma TSA experimentar con las pantallas estabilidad. De izquierda a derecha: (A) pipeteo de alícuotas de las pantallas de estabilidad en una placa de 96 pocillos. B pipetear la muestra de proteína con colorante fluorescente en la placa. (C) sellado de la placa antes de la centrifugación. (D) colocación de la placa en un sistema de RT-PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: flujo de trabajo de un experimento estándar de nanoDSF. (A) apertura del tubo capilar carga del rack. (B) carga de los capilares en la parrilla. (C) inmovilizando los capilares con la tira del lacre magnético. (D) un experimento de programación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Interfaz de usuario para el sistema de RT-PCR. Un experimento de la TSA ha sido programado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Pantalla de datos de muestra de la sal. (A) relación de las intensidades de fluorescencia a 350 nm vs 330 nm para un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con lisozima. Las muestras corresponden a los pozos C7-C12 de la pantalla sal (1,5 M - cloruro de amonio 0,2 M). Valores dem T calculados para cada condición se superponen a la trama. (B) Resumen de los valores dem T calculada a partir de los datos presentados en la figura 7A. Intensidades de fluorescencia (C) a 590 nm para un experimento TSA con un tinte sensible a la hidrofobicidad reportero de lisozima. Como figura 7A, las muestras corresponden a los pozos C7-C12 de la pantalla de la sal. Valores calculados dem T se superponen en el gráfico. (D) Resumen de los valores dem T calculada a partir de datos presentes en la figura 7C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: datos de muestra de pantalla de pH. Resumen de Tm cambios obtenidos con la lisozima y la pantalla de pH. Cada punto representa una condición independiente; puntos en el mismo valor de pH son de sistemas de amortiguamiento diferentes en el mismo pH. Tm cambios se calculan en relación a un control Tm de 68,0 ° C para los experimentos TSA y 71,9 ° C para los experimentos de nanoDSF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : Datos de muestra de pantalla Osmolyte (lisozima). Resumen de Tm valores obtenidos de un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con lisozima y cada bien de la pantalla del osmolyte. Se comparan valores dem T (en ° C) en los pocillos A1 y A2 que contienen agua como control. Un heatmap se genera en base a ΔTm valores comparados (azul denota un aumento dem T y rojo una disminución dem del T). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: datos de muestra de pantalla Osmolyte (proteína X). (A) Resumen de Tm valores obtenidos de un experimento de la etiqueta-libre nanoDSF con proteína X y la pantalla osmolyte. Tm valores se comparan a los pozos A1 y A2 que contienen agua como control. Un heatmap se genera en base a ΔTm valores comparados (azul denota un aumento dem T y rojo una disminución dem del T). (B) nanoDSF curvas obtienen bien A9 (1 M D-sorbitol, una condición de estabilización) y D1 (10 mM dipicolinic ácido, una condición desestabilizadora). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11 : Buffer efecto optimización en Tm. Valores de lisozima junto con las condiciones de cada pantalla que el mayor incremento en Tmen TSA Tm . 100 mM ácido acético, pH 4,2 y 100 mM MES, pH 5.6, fueron elegidos como los sistemas de amortiguación, junto con sulfato de amonio de 1,5 M como la sal. Las concentraciones del Osmolyte eran idénticas a las encontradas en la pantalla del osmolyte: Ala-Gly, D-sorbitol 1 M, 50 mM de L-lisina e hipotaurina 100 mM de 10 mM. Barras de error representan el desvío estándar de seis repeticiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Resumen de la frecuencia de la cristalización de molécula de buffer en las entradas del Banco de datos de la proteína (PDB). Datos obtenidos a través de PDBsum16 de un total de 144.868 entradas (correctos a partir del 05/12/18).

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