Efectos del gusto señalización abolición de proteína sobre la inflamación intestinal en un modelo de ratón de la enfermedad inflamatoria intestinal

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para investigar el efecto de la anulación de los genes relacionados con la gustación de respuesta inmune en un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de ratón inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad.

Resumen

Enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es uno de los trastornos gastrointestinales relacionados con inmune, incluyendo la colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, que afecta a la calidad de vida de millones de personas en todo el mundo. EII los síntomas incluyen dolor abdominal, diarrea y sangrado rectal, que pueden resultar de las interacciones entre la microbiota intestinal, los componentes del alimento, las células epiteliales intestinales y las células inmunes. Es de particular importancia para evaluar cómo afecta cada gen clave expresado en las células intestinales epiteliales e inmunes la inflamación en el colon. Se han encontrado receptores de sabor acoplado a proteínas G, como G proteína subunidad α-gustducin y otras proteínas de señalización, en los intestinos. Aquí, utilizamos α-gustducin como representante y describir un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal para evaluar el efecto de mutaciones en el gen gustativa en inmunidad mucosa intestinal y la inflamación. Este método combina tecnología de knockout de genes con el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducido químicamente y por lo tanto puede ser aplicado para evaluar el resultado de la anulación del gen gustativa, así como otros genes que pueden exuberate o atenuar la respuesta inmune inducida por DSS en el colon. Ratones mutantes son administrados con DSS para un cierto período durante el cual su peso corporal, taburete y sangría rectal son monitoreados y grabados. En diferentes puntos de tiempo durante la administración, algunos ratones son sacrificados, luego se miden los tamaños y pesos de sus bazos y dos puntos y los tejidos del intestino se recogen y procesan para histológicos y análisis de expresión génica. Los datos muestran que los resultados de octavos de final de α-gustducin en pérdida excesiva de peso, diarrea, hemorragias intestinales, daño tisular y la inflamación vs salvaje-tipo ratones. Puesto que la gravedad de la inflamación inducida es afectada por las cepas de ratón, vivienda ambiente y dieta, optimización de la duración de administración y concentración de DSS en un experimento piloto es particularmente importante. Al ajustar estos factores, este método puede ser aplicado para evaluar ambos efectos anti y pro inflamatorias.

Introducción

Las dos formas principales de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) se caracterizan por remitente o progresivos inflamatorias crónicas del intestino con etiología multifactorial^1,2 . El desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal depende de la genéticas, así como ciertos factores ambientales como dieta, uso de antibióticos y lo importante, infecciones patógenas. Sin embargo, la etiología y los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedad inflamatoria intestinal aún no están claros. Por lo tanto, numerosos modelos animales de EII químicamente indu....

Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron revisados y aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités de uso de la Universidad de Zhejiang. Se recomienda usar equipo de protección personal antes de realizar este protocolo.

1. preparación de ratones y DSS

1. Mantener los ratones knockout (α-gustducin^{- / -}) y edad, género y cuerpo peso comparable tipo salvaje del control (α-gustducin^{+ / +}) ratones C57BL/6 individualmente en jaulas limpias.
   Nota: Los ratones knockout han sido retrocruzas con ratones C57BL/6 por más de 20 generaciones y tienen un casi 100% C57BL/6 fondo genético.
2. Disolver 3....

Resultados

Un procedimiento de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS fue establecido por administración 3% DSS en el agua potable a α-gustducin-knockout (KO) y los ratones de tipo salvaje (WT). En comparación con ratones WT, los ratones knockout exhibieron más severa colitis con pérdida excesiva de peso, diarrea y sangrado intestinal (figura 1). Después de una administración de DSS de 7 días, se analizaron las diferencias en la integridad del tejido con H .......

Discusión

Este método puede ser empleado para posible determinar el efecto de mutaciones de genes específicos gustativas en la inflamación en un modelo murino de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS. Para aprovechar al máximo, la inducción óptima de la EII es un paso clave. El desarrollo de la colitis depende de varios factores, incluyendo la cepa de ratón, entorno de vivienda, microflora intestinal, así como los genes de interés. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto con un pequeño número de ratones par.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
< fuerte>Reactivo
dextrano (DSS)	MP Biomedicals	2160110
Complejo estreptavidina-HRP	BD Pharmingen	551011
H& Kit de tinción E BBI	Life Sciences	E607318
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sangon Biotech	B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)	Roche	4913850001
MMLV Transcriptasa inversa, GPR	Clontech, TaKaRa	639574
TaKaRa MiniBEST Kit de extracción de ARN universal	TaKaRa	9767
BD Jeringa 10 mL	BD Biosciences	309604
Instrumentos y equipostijeras >
equilibrio
			frascos
			qPCR
centrífuga
pinzas
Software
Imag-Pro Plus	Cibernética de Medios, Inc.

Sal sódica de sulfato de de tinción de la máquina de con de