Aquí presentamos un protocolo para investigar el efecto de la anulación de los genes relacionados con la gustación de respuesta inmune en un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de ratón inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad.
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Artículo de método
Efectos del gusto señalización abolición de proteína sobre la inflamación intestinal en un modelo de ratón de la enfermedad inflamatoria intestinal
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Resumen
Resumen
Enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es uno de los trastornos gastrointestinales relacionados con inmune, incluyendo la colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, que afecta a la calidad de vida de millones de personas en todo el mundo. EII los síntomas incluyen dolor abdominal, diarrea y sangrado rectal, que pueden resultar de las interacciones entre la microbiota intestinal, los componentes del alimento, las células epiteliales intestinales y las células inmunes. Es de particular importancia para evaluar cómo afecta cada gen clave expresado en las células intestinales epiteliales e inmunes la inflamación en el colon. Se han encontrado receptores de sabor acoplado a proteínas G, como G proteína subunidad α-gustducin y otras proteínas de señalización, en los intestinos. Aquí, utilizamos α-gustducin como representante y describir un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal para evaluar el efecto de mutaciones en el gen gustativa en inmunidad mucosa intestinal y la inflamación. Este método combina tecnología de knockout de genes con el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducido químicamente y por lo tanto puede ser aplicado para evaluar el resultado de la anulación del gen gustativa, así como otros genes que pueden exuberate o atenuar la respuesta inmune inducida por DSS en el colon. Ratones mutantes son administrados con DSS para un cierto período durante el cual su peso corporal, taburete y sangría rectal son monitoreados y grabados. En diferentes puntos de tiempo durante la administración, algunos ratones son sacrificados, luego se miden los tamaños y pesos de sus bazos y dos puntos y los tejidos del intestino se recogen y procesan para histológicos y análisis de expresión génica. Los datos muestran que los resultados de octavos de final de α-gustducin en pérdida excesiva de peso, diarrea, hemorragias intestinales, daño tisular y la inflamación vs salvaje-tipo ratones. Puesto que la gravedad de la inflamación inducida es afectada por las cepas de ratón, vivienda ambiente y dieta, optimización de la duración de administración y concentración de DSS en un experimento piloto es particularmente importante. Al ajustar estos factores, este método puede ser aplicado para evaluar ambos efectos anti y pro inflamatorias.
Introducción
Las dos formas principales de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) se caracterizan por remitente o progresivos inflamatorias crónicas del intestino con etiología multifactorial1,2 . El desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal depende de la genéticas, así como ciertos factores ambientales como dieta, uso de antibióticos y lo importante, infecciones patógenas. Sin embargo, la etiología y los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedad inflamatoria intestinal aún no están claros. Por lo tanto, numerosos modelos animales de EII químicamente inducidos han sido construidos y aplicado para delinear la patogenia y mecanismos y evaluar la efectividad de la terapéutica humana3.
Receptores del gusto son receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y se clasifican en dos tipos principales: tipo I (T1Rs) y tipo II (T2Rs) que detectan compuestos amargos, dulce y umami. Gusto de cascadas de señales iniciadas por tastant proteínas de unión a T1Rs o T2Rs, activando el heterotriméricas G formado por α-gustducin y un dimer del Gβγ y conduce a la liberación de las subunidades Gβγ. La molécula Gβγ a su vez estimula el enzima efector corriente abajo del phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activada hidroliza el fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato en dos mensajeros secundarios intracelulares inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol] y IP3 se une a y abrir su canal-receptor IP3 R3, liberando iones de calcio desde el retículo endoplásmico. Esto eventualmente conduce a la apertura del canal del ion potencial transitorio del receptor Trpm5 y liberación del neurotransmisor ATP hacia los nervios gustativos4,5,6,7. Sin embargo, las vías de señalización de sabores salados y amargos son diferentes e independientes de dulce y umami gusto amargo8. Además, los componentes de sabor GPCRs y río abajo proteínas existen en varios tejidos extra orales. Estudios recientes indican eso α-gustducin, el principal componente del sabor de señalización, se encuentra expresada en la mucosa intestinal. Se necesitan estudios adicionales para entender las funciones de estos gusto señalización componentes en tejidos extra orales9,10.
El método aquí descrito se utiliza para caracterizar las funciones de las proteínas de señalización gustativas expresadas en tejidos extra orales. Combinamos una línea de ratón transgénico desarrollada para delinear cascadas de señales en papilas gustativas con el modelo de colitis inducida químicamente. En gran parte debido a su simplicidad procesal y similitudes patológicas humanas colitis ulcerosa, el dextrán sulfato de sodio (DSS)-modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducida ha sido más ampliamente utilizado entre la colitis inducida químicamente varios modelos11. En este estudio, utilizamos ratones deficientes en gustducin α como una línea representativa ratón para revelar nuevas funciones del α-gustducin inflamación e inmunidad mucosa intestinal 1) analizando los cambios morfológicos en el tejido y 2) análisis de diferencias en la expresión de citocinas relacionadas con inflamación en el colon. Este método puede ser utilizado determinar cuantitativa y cualitativamente los aportes de proteínas de señalización gustativas (y otras proteínas en el intestino) al daño tisular y la inflamación intestinal, cuando líneas de ratón modificado genéticamente por los genes de interés están disponibles. Ventajas de este método están permitiendo a los usuarios obtener datos integrados resultantes de acciones de la DSS química y deficiencia del gen de interés. Este método puede ser mejorado para aumentar su sensibilidad y revelar sutiles cambios intestinales a nivel celular y molecular.
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones fueron revisados y aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités de uso de la Universidad de Zhejiang. Se recomienda usar equipo de protección personal antes de realizar este protocolo.
1. preparación de ratones y DSS
- Mantener los ratones knockout (α-gustducin- / -) y edad, género y cuerpo peso comparable tipo salvaje del control (α-gustducin+ / +) ratones C57BL/6 individualmente en jaulas limpias.
Nota: Los ratones knockout han sido retrocruzas con ratones C57BL/6 por más de 20 generaciones y tienen un casi 100% C57BL/6 fondo genético. - Disolver 30 g de dextrán sulfato de sodio (DSS) en polvo en 1 L de agua esterilizada. Mezclar hasta que la solución llega a estar clara para asegurar que la concentración final de trabajo es de 3% (p/v).
Nota: La solución DSS puede almacenarse a temperatura ambiente hasta 1 semana o a 4 ° C hasta su uso.
2. inducción y evaluación de DSS la Colitis en ratones
- Pesar y registrar el peso inicial de cada ratón. Coloque los ratones individualmente en jaulas estándar y las jaulas de la etiqueta.
- Reemplace regular de agua potable con una solución DSS de 3% para un total de 7 días para que ambos grupos de ratones tienen acceso ad libitum.
- Medir el peso del cuerpo del ratón, registran consumo de solución DSS y recoger y examinar las heces de cada ratón diario durante la administración de DSS. Observar la severidad de la diarrea y el sangrado rectal y convertir esto en el índice de enfermedad inducida por DSS12.
- Durante el experimento, se calcula el porcentaje de pérdida de peso en comparación con el peso inicial y el índice de la enfermedad para evaluar los síntomas de la colitis.
Nota: El índice de la enfermedad se obtuvo combinando observaciones de diarrea y sangrado rectal y se definen como sigue: 0 (heces normales, no de sangre), 1 (heces suaves, sin sangre), 2 (heces suaves, poca sangre), 3 (heces muy suave, modesta de sangrado) y 4 (heces acuosas, sangrado significativo)12. El índice de la enfermedad se analiza diariamente para cada ratón. - Al final del tratamiento de 7 días DSS, sacrificar a los ratones por dislocación cervical y proceder a los experimentos restantes.
3. preparación de las muestras de tejido
- Coloque el ratón en la posición supina y limpie la piel del abdomen con etanol al 70%. Haga una incisión de 3 cm de largo de la línea media en el abdomen con un par de tijeras pequeñas para exponer la cavidad abdominal.
- Utilice un par de pinzas para separar el bazo de otros tejidos, y luego extirpar el bazo y medir su tamaño.
- Identificar y levantar los puntos con pinzas y separarlo del mesentery alrededor. Tire todo colon hasta el ciego y el recto son accesibles.
- Aislar el colon transecting en el margen de colonocecal y profundo en la pelvis para liberar el colon proximal y distal, respectivamente. Luego, mida y registre la longitud de los dos puntos aislados. Tenga cuidado de no dañar el tejido colónico durante el procedimiento de disección.
- Lavar el colon con 10 mL de solución salina helada con tampón fosfato (PBS) con una jeringa de 10 mL, equipada con una aguja de la sonda para eliminar las heces y sangre hasta que el efluente quede totalmente claro.
- Para la identificación histológica, las muestras de tejido dividir igualmente en tres partes: proximal, media y distal. A continuación, fijar el tejido con 4% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C.
- Para el análisis de la expresión del cytokine, congelar todo el colon rápidamente con nitrógeno líquido y almacenarlo a-80 ° C hasta su uso.
4. histológica evaluación de la severidad de la Colitis inducida por DSS
- Hematoxilina y eosina (H & E) tinción
- Después de la fijación, sumergir el tejido en una solución de sacarosa al 30% en PBS 1 x durante la noche en un tubo de 15 mL a cryoprotect las muestras.
- Incrustar el tejido en la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y coloque a-20 ° C hasta que se endurezca el PTU.
- Transferir el bloque de OCT que contiene el tejido de un criostato, sitúe el selector de espesor en el criostato y 12 μm, rebanada y recoger las secciones congeladas de 12 μm de espesor.
- Las secciones de tejidos recogidos de un criostato a 65 ° C durante 20 min sobre una placa de calor.
- Lávese las secciones brevemente en agua destilada. Tinción con hematoxilina, coloración de la solución durante 5 minutos y posteriormente enjuagar con agua corriente durante 5 minutos.
- Diferenciar las secciones con 0.5% de ácido clorhídrico-etanol durante 30 s y aclárelo en funcionamiento grifo agua durante 1 minuto. Luego, realizar el lavado en PBS 1 x durante 1 min y posteriormente enjuague con agua corriente durante 5 minutos.
- Realizar lavado de las secciones de tejido en alcohol 70%, 75%, 80% y 95%, cada uno para 10 s. contratinción en eosina solución por 2 min la coloración.
- Realizar la deshidratación con alcohol 95% y 2 cambios de alcohol absoluto durante 5 minutos cada vez. Claro en 2 cambios de xileno durante 5 minutos.
- Puntuación de daño a los tejidos del colon proximal, medio y distal de cada ratón por el knockout de genes y grupos de tipo salvaje basados en los resultados de la anterior tinción H & E.
Nota: El índice de la enfermedad es un resultado combinado de daño epitelial e inflamación en las regiones de la mucosa, submucosa, muscular y serosa, que se define como sigue: 0 (sin daño tisular y la inflamación), 1 (daño tisular focal e inflamación), 2 (irregular daño tisular y la inflamación) y 3 (daño tisular difuso e inflamación)12,13. Tres puntuaciones por ratón de las partes proximal, medias y distales del colon luego se suman para obtener una puntuación total para cada animal. Luego se calculan las puntuaciones medias para cada grupo.
- Immunohistochemistry14
- Las secciones de tejidos recogidos de un criostato a 65 ° C durante 20 min sobre una placa de calor. Lávese las secciones de 1 x PBS 3 veces, durante 10 minutos. Incubar las secciones de tejido en peróxido de hidrógeno 3% durante 10 min eliminar la peroxidasa endógena. Lávese las secciones 3 veces más. Bloquear los tejidos con el bloqueo de búfer (BSA 3%, detergente no iónico al 0.3%, 2% de suero de cabra, 0.1% de azida sódica en PBS 1 x) a temperatura ambiente durante 1 h o más.
- Reemplace el amortiguador de bloqueo con una solución que contiene los siguientes anticuerpos primarios de células inmunitarias específicas del tipo: CD45 para leucocitos, CD3 para los linfocitos T, B220 para las células de B, CD11b de macrófagos y Ly6G para neutrófilos. Incubar a 4 ° C durante la noche.
- Quitar los anticuerpos primarios de las secciones de tejido por la aspiración. Lávese las secciones con 1 x PBS 3 veces, durante 10 minutos. Incubar las secciones con anticuerpo secundario biotinilado, seguido por la incubación con el complejo estreptavidina-HRP a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones con 3, 3'-diaminobenziding (DAB) solución para desarrollar un color marrón claro u oscuro y visualizar las células immunoreactive.
- Contratinción las secciones hematoxylin y amoníaco diluido el 0.3% (v/v). Tomar imágenes de campo claro con 10 aumentos en un microscopio.
- Utilice un programa de procesamiento de imagen para identificar y cuantificar la población de las células inmunes marcadas en el epitelio y la lámina propia (por debajo del epitelio) por ajuste de 2 máscaras: utilizar la primera máscara en la función basado en el cubo de color para establecer una detección de color umbral y medir las áreas coloreadas de DAB-reactiva; Utilice la máscara segunda para determinar áreas total del epitelio y laminar propria en la sección examinada. Expresar la población de células immunoreactive como proporción de la zona de tinción de las células infiltradas en el área total del tejido examinado.
5. Gene expresión evaluación de Colitis inducida por DSS
- Recuperar los tejidos del colon de la knockout del gen tratados con DSS y ratones de tipo salvaje de un congelador de-80 ° C agregar 0,6 mL de tampón de lisis a 25 mg de tejido y homogeniza en un homogenizador.
- Seguir protocolo del kit de extracción de RNA para extraer el ARN total y DNasa I sirve para eliminar cualquier contaminante de la DNA genomic.
- Correr un gel de agarosa para verificar la calidad del ARN extraído. Si su banda de RNA de 28S es más brillante que la banda de 18 años, es usable. Toma 1 μl de la muestra de RNA para determinar la concentración de RNA en un microspectrophotometer.
- Mezclar 1 μg de ARN total con 2,5 μl de13,14,15,16,17,18 cartillas de 20 mM oligo (dT)12,y 1 μl de la leucemia murina de Moloney virus (MMLV) de la transcriptasa reversa. Incubar a 42 ° C durante 60 min preparar el cDNA.
- Establecer las reacciones de PCR en tiempo real mediante la mezcla de 1μl de cDNA con 0,5 μl de primers de qPCR de avance y retroceso para el TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 y β-actina como control además de 2 x tinte verde fluorescente.
- Ejecutar la qPCR con los siguientes parámetros: 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 50 ° C para 25 s y 72 ° C por 20 s.
- Calcular la cuantificación relativa de la expresión génica utilizando los 2–ΔΔCt método15. Analizar comparativamente los niveles de expresión génica en los octavos de final vs. ratones de tipo salvaje.
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Resultados
Un procedimiento de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS fue establecido por administración 3% DSS en el agua potable a α-gustducin-knockout (KO) y los ratones de tipo salvaje (WT). En comparación con ratones WT, los ratones knockout exhibieron más severa colitis con pérdida excesiva de peso, diarrea y sangrado intestinal (figura 1). Después de una administración de DSS de 7 días, se analizaron las diferencias en la integridad del tejido con H ...
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Discusión
Este método puede ser empleado para posible determinar el efecto de mutaciones de genes específicos gustativas en la inflamación en un modelo murino de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS. Para aprovechar al máximo, la inducción óptima de la EII es un paso clave. El desarrollo de la colitis depende de varios factores, incluyendo la cepa de ratón, entorno de vivienda, microflora intestinal, así como los genes de interés. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto con un pequeño número de ratones par...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por becas de la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671016, 31471008 y 31661143030) y los institutos nacionales de salud (DC010012, DC015819) y por la Fundación Siyuan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| < fuerte>Reactivo | |||
| dextrano (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Complejo estreptavidina-HRP | BD Pharmingen | 551011 | |
| H& Kit de tinción E BBI | Life Sciences | E607318 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Transcriptasa inversa, GPR | Clontech, TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Kit de extracción de ARN universal | TaKaRa | 9767 | |
| BD Jeringa 10 mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Instrumentos y equipostijeras > | |||
| equilibrio | |||
| frascos | |||
| qPCR | |||
| centrífuga | |||
| pinzas | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Cibernética de Medios, Inc. |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
