Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado que un fluorescente nuevo coloración técnica para la detección de la proteína total en geles de poliacrilamida. El protocolo utiliza una sonda de encendido plata de iones específicos de fluorescencia que detecta Ag⁺-complejos de proteínas y elimina ciertas limitaciones de manchas plata cromogénicos tradicionales.

Resumen

Tinción de plata es una técnica colorimétrica ampliamente utilizada para visualizar las bandas de proteínas en geles de poliacrilamida siguiendo la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE). Las manchas de plata clásico tienen ciertos inconvenientes, como fondo alta coloración, recuperación de proteína pobre, baja reproducibilidad, un estrecho rango dinámico lineal de cuantificación y la compatibilidad limitada con espectrometría de masas (MS). Ahora, con el uso de una sonda de Ag⁺ fluorógenos, TPE-4TA, hemos desarrollado un método para la visualización total de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. Esta nueva mancha evita el paso de reducción plata molestas manchas de plata tradicional. Además, la tinción fluorescente de plata demuestra buena reproducibilidad, sensibilidad y cuantificación lineal de detección de la proteína, lo que es una mancha de gel de proteína útil y práctico.

Introducción

Muchos métodos de tinción han sido usados para visualizar proteínas después de electroforesis en gel, por ejemplo utilizando colorimétricos colorantes como el azul brillante de Coomassie, tinción de plata, fluorescencia, o radiactivo etiquetado^{1,2, 3 , 4}. plata es considerada como una de las técnicas más sensibles para la detección de proteínas que requieren reactivos simples y baratos. Pueden ser categorizado en dos grandes familias: la mancha de plata amoniacal y el nitrato de plata manchan^5,

Protocolo

1. preparación del Gel

Nota: La demostración sigue un protocolo estándar para preparar el gel para manchas poco después de SDS-PAGE¹². En Resumen, los pasos siguientes describen la preparación de las muestras y electrophoresis del gel.

1. Realizar SDS-PAGE con geles de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 m m, 15-bien) usando un gel mini tanque lleno con 2-(N -morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido tampón de ácido (MES).
2. Diluir las muestras con una mezcla de agua destilada, litio dodecil sulfato (LDS) tampón y un agente de reducción de muestra.
3. Carga el primer carril con el d....

Resultados

Las bandas de proteínas teñidas por el tinte plata fluorescente presentan una intensa fluorescencia verde bajo una lámpara de UV 365 nm. Todas las bandas de proteína 14 (10-200 kDa), de arriba hacia abajo, eran claramente visibles, correlacionan bien con los 14 color rojo teñido por el tinte (figura 2) SYPRO Ruby del¹⁰.

Detección cuantitativa de la proteína, los geles fueron .......

Discusión

Presentada aquí es una novela plata fluorescente tinción de proteínas en geles de poliacrilamida. Esta estrategia integra fluorescentes manchas y manchas de plata convencionales. Las hazañas de tinción la Unión selectiva de iones de plata a las proteínas como en otros plata manchas pero emplea una plata muy sensible fluorógenos sondeo TPE-4TA para iluminar las proteínas límite plata. Puesto que la sonda fluorógenos TPE-4TA puede detectar iones de plata en una concentración bastante baja .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de muestra LDS (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reactivo
4-12% Gel de proteína Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pocillos	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Gel prefabricado
Agente reductor de muestras (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reactivo
MES SDS Tampón de funcionamiento (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reactivo
Mini tanque de gel	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipo
Fuente de alimentación de 300 W (230 VCA)	Thermo Fisher Scientific	PS0301
Equipo Escalera de proteínas sin manchar	Thermo Fisher Scientific	26614	Muestra
Nitrato	de plata Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reactivo
Etanol	Bragg and co.	42520J	Reactivo
Ácido acético	J.T. Baker	103201A	Reactivo
Milli-Q Síntesis A10			Merk-Proporciona 18.2 MΩ.
Sistema de documentación de gel de agua cm (modelo C600)	Azure biosystems-Equipment