Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Resumen

Medidas del contrato de blanco de la droga son fundamentales para desarrollo de fármacos eficaces y validación química de la sonda. Aquí detallamos un protocolo para la medición de compromiso de Diana farmacológica con alta proyección de imagen contenido en una adaptación de microplacas compatibles del ensayo celular cambio térmico (CETSA).

Resumen

Cuantificación de la interacción de moléculas pequeñas con su blanco prevista de la proteína es fundamental para desarrollo de fármacos, validación de destino y validación química de la sonda. Métodos que miden este fenómeno sin modificación del destino de la proteína o molécula pequeña son particularmente valiosos aunque técnicamente difícil. El ensayo celular cambio térmico (CETSA) es una técnica para supervisar el contrato de blanco en las células vivas. Aquí, describimos una adaptación del protocolo original de CETSA, que permite mediciones de alto rendimiento manteniendo la localización subcelular en el nivel unicelular. Creemos que este protocolo ofrece importantes avances para la aplicación de CETSA profunda caracterización del compuesto objetivo interacción, especialmente en poblaciones heterogéneas de células.

Introducción

En el desarrollo de nuevos fármacos o sondas químicas es esencial par el efecto farmacológico observado o lectura funcional a las medidas de ocupación del destino o participación en células vivas^1,2,3. Estos datos son necesarios para que la molécula pequeña de hecho llegue a su destino deseado y validar la hipótesis biológica detrás de proteína objetivo selección^4,5. Además, durante el desarrollo de drogas, modelo de los sistemas de complejidad creciente se utiliza para seleccionar y corroborar un plomo compuesto antes de los ensayos clínicos. Para confirmar la traducción de la biología a través de estos sistemas preclínicos, métodos de rastreo contrato de drogas blanco y acompañando la biología a lo largo de este proceso de desarrollo son fundamentales.

Compromiso de Diana farmacológica ha sido tradicionalmente difícil de controlar en células vivas con unfunctionalized pequeñas moléculas y proteínas, especialmente a nivel unicelular con resolución espacial^6,7. Sin modificar de un método reciente para observar la interacción entre fármacos y proteínas en células vivas es el ensayo celular cambio térmico (CETSA) en el cual estabilización inducida por ligando de una proteína nativa en respuesta a un desafío de calor es cuantificada^{8, 9,10}. Esto se logra mediante la cuantificación de proteína soluble restante después de la exposición a un desafío de calor. En la divulgación inicial de CETSA, mancha blanca /negra occidental fue utilizada para la detección. Para activar campañas de detección y clasificación de colecciones compuestos más grandes del golpe, los esfuerzos para aumentar el rendimiento de CETSA experimentos han llevado al desarrollo de varios ensayos homogéneos, basado en una microplaca^10,11. Sin embargo, una limitación con estos métodos es que ellos son actualmente más adecuados para tratamiento compuesto en suspensiones celulares y lisis celular, llevando a la pérdida de la información espacial requiere de la detección. CETSA puede ser aplicado experimentalmente como un cambio inducido por ligando de temperatura térmica agregación (T_agg) en una concentración única de la molécula pequeña o la concentración del ligand necesaria para estabilizar la proteína en una sola temperatura. Este último se denomina huellas dactilares isotermo dosis respuesta (ITDRF) para indicar la dependencia de estas mediciones en las condiciones experimentales específicas.

El objetivo de este protocolo es medir el compromiso de destino mediante CETSA en células adherentes detección inmunofluorescente del anticuerpo de (IF) con microscopía de alto contenido¹². Este procedimiento extiende la plataforma original de CETSA para permitir la cuantificación unicelular del contrato de blanco con la conservación de la localización subcelular. En particular, a diferencia de muchos informes anteriores, en este procedimiento de tratamiento compuesto se realiza en células vivas adherentes sin desprendimiento superficial o lavado antes del reto de calor, preservando así el equilibrio establecido enlace que pretendemos medir¹³. Actualmente, el método está validado para un destino proteína p38α (MAPK14) en varias líneas celulares, y esperamos que al compartir este procedimiento la técnica se puede aplicar ampliamente a través del fusión proteoma. Esperamos que este protocolo puede ser adaptado a lo largo de la tubería del desarrollo drogas de proyección, golpe clasificación a través de seguimiento de objetivo participación en vivo.

Protocolo

1. siembra de células

Nota: Para una visión general del flujo de trabajo vea la figura 1. Una lista detallada de materiales y reactivos están disponibles en la Tabla de materiales.

1. Antes de la siembra de las células, perforar con un taladro estándar en el marco de placas de ensayo imágenes de 384-pozo negro para evitar burbujas de aire que está atrapadas debajo de la placa más adelante durante la etapa de calefacción. Para evitar partículas de plástico en los pozos durante este paso y mantener las condiciones de esterilidad, sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo o cubra la placa antes de la perforación en una campana de cultivo de tejidos. Por lo general, 3 agujeros con un diámetro de 3,5 mm en cada lado de la placa (borde corto) es suficiente.
2. Preparar un banco de flujo laminar limpiándolo con etanol al 70%. Siguiendo técnicas de cultivo de tejido aséptica estándar, retire media celular frasco o plato. Lavar las células con 5-10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego añadir tripsina 2 mL en el matraz. Incube el frasco a 37 ° C hasta que se desprenda de las células A-431. Contar las células usando un hemocitómetro o celda contador. Preparar una suspensión de 50.000 células/mL en medio de cultivo.
3. Añada 40 μl de suspensión celular (dando una densidad celular final de 2.000 células por pocillo) en cada pocillo de una placa de ensayo usando un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal, dependiendo de la escala del experimento. Pasar brevemente la placa de lado a lado para dispersar las células uniformemente en la parte inferior de la placa.
4. Para minimizar los efectos de borde de la placa, permiten que las células se colocan en la parte inferior de la placa de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar. Luego, colocar la placa en un recipiente de plástico con toallas de papel húmedo para asegurar una atmósfera húmeda. Antes del uso, limpie el recipiente de plástico con etanol al 70%.
5. Incubar la caja con la placa de ensayo durante 2-3 días a 37 ° C y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada convencional. Supervisar la confluencia de las células hasta 50-75%, según lo determinado por la inspección visual con un microscopio de luz.

2. tratamiento del compuesto

1. En el día del experimento, aspirar el medio de cada pocillo con una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración. Si no hay una arandela de placa, el líquido puede eliminarse invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Cualquier exceso de líquido se retira entonces taponando con toallas de papel.
2. Añadir 30 μl de compuestos diluido a la concentración apropiada en medio de cultivo celular mediante dosificación automática o una pipeta multicanal según la escala del experimento. Asegúrese de añadir un control positivo (ligando conocido) y negativo (DMSO) a varios pozos en cada placa de ensayo. Ya que este es un ensayo de cambio térmico, es necesario que la concentración de compuesto supera la constante de disociación para observar la estabilización de la proteína. Por lo tanto, una pauta aproximada para la concentración del compuesto es 50 - 100 veces el IC₅₀pero más descripciones de detalle de las concentraciones de compuestos se encuentran en la sección de discusión.
   Nota: Tolerancia de DMSO de las líneas celulares debe analizarse antes del experimento.
3. Sello sello de la placa de ensayo compuesto tratado con una placa transpirable e incubar a 37 ° C y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada durante 30 minutos.

3. calor desafío

1. En primer lugar, establecer el baño de agua a la temperatura deseada. Tenga en cuenta que la temperatura final que se alcanza dentro de los pocillos de la placa de ensayo puede ser diferente de la temperatura final en el baño de agua. Investigar previamente el desplazamiento con un termómetro simulado de la placa y termopar. Por lo general toma 30 minutos para el baño María se estabilice a la temperatura deseada.
2. Para verificar que la temperatura deseada se alcanza en los pocillos de la placa de ensayo durante la etapa de calentamiento, prepare una placa simulada no sellada que contienen el mismo volumen de medio que la placa de ensayo.
3. Retire las placas de ensayo de la incubadora. Quite el sello transpirable y volver a sellar la placa de ensayo que contiene las células tratadas con compuestos con una papel de aluminio adhesivo firmemente para asegurar que no hay agua se escapará en los pozos durante el posterior calentamiento en el baño de agua. Asegúrese de que los orificios perforados en el marco de la placa son accesibles.
4. Coloque la placa de ensayo y la placa del maniquí en el baño de agua con la parte inferior de la placa en ángulo hacia la superficie del agua a la fuerza todo el aire restante hacia fuera debajo de las placas.
5. Monitorear la temperatura dentro de los pocillos de una placa simulada nueva usando un termómetro termopar.
6. Calentar la placa de ensayo en el baño de agua durante 3 minutos. Transferir inmediatamente el ensayo y la placa falsa a otro baño de agua con agua templado de habitación se enfríe durante 5 minutos. La placa de ensayo está lista para su posterior procesamiento.

4. fijación

1. Dispense el paraformaldehído al 10 μl 16% (w/v) (PFA) directamente a la placa de ensayo con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   Nota: Algunos fijadores se clasifican como carcinogénicos y deben seguirse las normas de seguridad institucional.
2. Aspire la solución de la PFA y lavar las células con 300 de μl PBS, usando una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración.
   Nota: Este procedimiento se ha optimizado con un protocolo de desbordamiento en la arandela de placa que líquido al mismo tiempo dispensado y quitado. Si no hay una arandela de placa o procedimiento similar, el paso de lavado puede también hacer manualmente.
3. Procedimiento de lavado manual: Retire el líquido de los pozos invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Añadir 80 μl de PBS con una pipeta multicanal e invertir la placa otra vez como se describe anteriormente, repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, secar la placa sobre toallas de papel limpias para quitar cualquier exceso de líquido.

5. la permeabilización

1. Añadir 20 μl de 0,1% (v/v) NP-40 para los pozos con una pipeta multicanal e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar las células con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
2. Alternativamente, cuando sea apropiado, aplicar un protocolo de recuperación de antígeno, por ejemplo:
   1. Añadir 20 μl de SDS 1% a los pozos con una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lavar siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente (paso 4.2).
   2. Añadir 80 μL de glicina de 10 mM a pH 7,2 e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de glicina con una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.

6. bloqueo

1. Añadir 15 μl de 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS en los pocillos con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.

7. primaria del anticuerpo

1. Aspirar la solución bloqueo usando una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.
2. Añadir 10 μl de anticuerpo primario diluido por consiguiente en el 1% (w/v) BSA en PBS para los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.

8 anticuerpo secundario

1. Aspire la solución de anticuerpo primario y lavar los pocillos según el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
2. Añadir 10 μl del anticuerpo secundario Alexa 488 diluido por consiguiente en el 1% (p/v) BSA en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Selle la placa con un sello adhesivo de aluminio para proteger de la luz.
   Nota: Proteja la placa de la luz durante este y los pasos posteriores.

9. nuclear la coloración y la mascarilla de células

1. Añadir 10 μl de colorante nuclear diluido a 0,05 mg/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos más.
2. Aspire la solución de Hoechst y anticuerpo secundario y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
3. Añadir 10 μl de la mascarilla de células diluida a 200 ng/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Aspire la solución de la máscara de la célula y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
5. Añada 60 μL de PBS a todos los pozos con la arandela de placa, un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal y sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo.

10. adquisición y análisis de imágenes

1. Captura de imágenes en un sensor contenido alto con 3 canales fluorescentes: DAPI (387/447), GFP (472/520) y TexasRed (562/624). Adquisición de 4 imágenes por pozo con objetivo de 10 X. Utilizar autoenfoque láser automatizado y aplicar 2 binning durante la adquisición. Guardar imágenes como archivos de tiff de escala de grises de 16 bits, junto con metadatos.
2. Analizar imágenes utilizando el software disponible. Identificar los límites de la celda utilizando un algoritmo de puntuación de célula con DAPI (núcleo) y TexasRed (citoplasma).
3. Extracto de media intensidad para todas longitudes de onda adquiridas para su posterior análisis de datos.
4. Calcular el factor Z para asegurar la robustez del ensayo.
5. Calcular % estabilización con la siguiente fórmula: 100 * (1-(bien intensidad-control negativo de intensidad bien media) / (promedio del control negativo de la intensidad promedio de control positivo de intensidad)). Esta control negativo de DMSO y el control positivo es la sustancia de referencia. Puesto que la máxima estabilización entre compuestos puede variar y de hecho ser mayor que el control positivo para las curvas ITDRF, las intensidades máxima y mínima estabilización para cada compuesto se utilizan a veces en lugar de los valores de intensidad de los pozos de control .

Resultados

El protocolo descrito en la figura 1 describe el flujo de trabajo básico para ejecución de ensayos CETSA en células adherentes con detección de la proteína soluble restantes por proyección de imagen de contenido alto. Este flujo de trabajo puede ser fácilmente adaptada a todas las etapas de desarrollo de ensayos modificando el diseño de la placa de los reactivos o compuestos¹⁴. Detallamos los resultados esperados para varias previsto a...

Discusión

Como comentamos en la sección de resultados, hay varias medidas claves para el procedimiento. En primer lugar, es importante identificar un reactivo de alta calidad afinidad. Recomendamos una pequeña biblioteca de anticuerpos para cada objetivo deseado de detección. Después de que un anticuerpo primario se ha seleccionado, también es importante validar el sistema para un número de sitios de Unión diferentes de la meta de proteína si es necesario. Counter-detección de compuestos que interfieren con la señal de ensayo como...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	para separar células y subcultivar
16% de paraformaldehído (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fijador
IgG (H+L) de cabra anti-conejo (H+L), anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11008	anticuerpo secundario
HCS CellMask tinción roja	ThermoFisher Scientific	H32712	Tinción de citoplasma
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	para permeabilización
Tinción de Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	tinción nuclear
Dulbecco' Águila modificada' medio s (DMEM) - glucosa alta Componente	medio de cultivo celular	Sigma-Aldrich	6429
Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	componente de medio de cultivo celular
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	componente de medio de cultivo celular
Corning, junta de placa transpirable	Sigma-Aldrich	CLS3345	para la etapa de incubación de Copound
Anticuerpo anti-p38 de conejo [E229]	Abcam	ab170099	anticuerpo primario, LOT:GR305364-16
Falcon, Negro Placas de imagen de fondo transparente de 384 pocillos	VWR	736-2044
Greiner, placas de polipropileno de bajo volumen de 384 pocillos	VWR	784201
Adhesivo Papel de aluminio	VWR	30127790
Sello de aluminio pelable	Agilent	24210-001	para PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibidor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibidor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibidor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibidor
AMG 548	Tocris	3920	p38 y alfa; inhibidor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38 y alfa; inhibidor
L-Skepinona	CBCS colección		p38 y alfa; inhibidor
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	agente bloqueante
SDS (dodecil sulfato de sodio)	BDH	44244	utilizado en la recuperación de antígenos
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	utilizada en la recuperación de antígenos
Células A-431	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte	Para la
Sellador de placas	Agilent		PlateLoc
Dosificador de reactivos a granel	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Líquido automatizado manipulación	Plataforma de manipulación de líquidos Agilent Bravo; utilizada para la preparación de placas compuestas
			Sistema de análisis