Method Article

Grabaciones simultáneas de los potenciales de campo Local Cortical y Electrocorticograms en respuesta a estímulos nociceptivos Laser se mueva libremente las ratas

DOI:

10.3791/58686

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Mental Health, Institute of Psychology, 2Department of Psychology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Research Center of Brain Cognitive Neuroscience, Liaoning Normal University, 4Neuroscience Research Institute, Peking University, 5Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 6Key Laboratory for Neuroscience, Ministry of Education/National Health and Family Planning Commission, Peking University, 7Department of Pain Management, State Key Clinical Specialty in Pain Medicine, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado una técnica que registra simultáneamente la electrocorticografía y los potenciales de campo local en respuesta a estímulos nociceptivos laser se mueva libremente las ratas. Esta técnica ayuda a establecer una relación directa de señales electrocortical mesoscópicos y macroscópicos, que facilita la investigación de procesamiento en el cerebro de la información nociceptiva.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Respuesta electrocortical, sacado por los pulsos de láser térmico que activan selectivamente las terminaciones nerviosas libres nociceptivas, es ampliamente utilizado en muchos estudios animales y humanos para investigar el procesamiento cortical de información nociceptiva. Estos potenciales cerebrales evocados por láser (LEPs) consisten en varias respuestas transitorias que son tiempo-bloqueada la aparición de estímulos de láser. Sin embargo, todavía son en gran parte desconocidas, debido a la falta de una técnica de muestreo que puede grabar simultáneamente las actividades neuronales en la superficie de la corteza (es decir, hallazgos [ECoG] y el cuero cabelludo las propiedades funcionales de las respuestas de la LEP el electroencefalograma [cuero cabelludo EEG]) y dentro del cerebro (es decir, potenciales de campo local [LFP]). Para tratar este tema, presentamos aquí un protocolo de animales utilizando ratas libremente móviles. Este protocolo se compone de tres procedimientos principales: preparación (1) animal y procedimientos quirúrgicos (2) un registro simultáneo de ECoG y LFP en respuesta a estímulos nociceptivos de láser y (3) datos análisis y función de la extracción. Específicamente, con la ayuda de una concha protectora 3D impreso, ECoG y LFP electrodos implantados en el cráneo de la rata segura celebraron juntos. Durante la recolección de datos, pulsos de láser fueron entregados en patas delanteras de la rata a través de huecos en la parte inferior de la cámara cuando el animal estaba en quietud espontánea. Constante ruido blanco fue jugado para evitar la activación del sistema auditivo de los ultrasonidos generados por láser. En consecuencia, sólo las respuestas nociceptivas se registraron selectivamente. Utilizando los procedimientos analíticos estándar (p. ej., band-pass filtrado, extracción de época y corrección de línea base) para extraer las respuestas cerebrales relacionados con el estímulo, se obtuvieron resultados demostrando que eran LEPs con un alto cociente signal-to-noise al mismo tiempo registrado de electrodos ECoG y LFP. Esta metodología permite la grabación simultánea de actividades ECoG y la LFP, que proporciona un puente de señales electrocortical mesoscópicos y macroscópicos, facilitando así la investigación del procesamiento de la información nociceptiva en el cerebro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EEG es una técnica para registrar los potenciales eléctricos y actividades del cerebro oscilatorios generadas por las actividades sincronizadas de miles de neuronas en el cerebro. Popularmente se utiliza en muchos estudios básicos y aplicaciones clínicas1,2. Por ejemplo, las respuestas EEG a láser intenso calientan pulsos (es decir, LEPs) son ampliamente adoptadas para investigar el procesamiento periférico y central de entrada sensorial nociceptiva3,4,5. En los seres humanos, LEPs consisten en principalmente tres desviaciones distintas: el componente temprano (N1) que se somatotopically organizada y capaces de reflejar la actividad de la corteza somatosensorial primaria (S1)6y los últimos componentes (N2 y P2) que son centralmente distribuida y más probabilidades de reflejar la actividad de la corteza somatosensorial secundaria, ínsula y corteza anterior del cingulate7,8. En anteriores estudios9,10, hemos demostrado eso rata LEPs, muestreado usando ECoG (un tipo de EEG intracraneal) de electrodos colocados directamente sobre la superficie expuesta del cerebro, también constan de tres distintas desviaciones ( es decir,, somatotopically organizado N1 y el N2 centralizada distribuida y P2). La polaridad, el orden y la topografía de los componentes LEP de rata son similares a humanos LEPs11. Sin embargo, debido a la limitada resolución espacial de la cuero cabelludo EEG subdural ECoG grabaciones12, así como la naturaleza inexacta de EEG fuente análisis técnicas13, la contribución detallada de las actividades neuronales a los componentes de la LEP se discute mucho. Por ejemplo, es confuso si y la medida en que S1 contribuye a la primera parte de la respuesta cortical (N1) sacada por los estímulos de láser6.

Diferente de la técnica de grabación en el macroscópicos directos, nivel intracraneales grabaciones cronometradas usando microhilos los arreglos de discos con la ayuda de un aparato de estereotáctica y microdrives14,15 podría medir actividades neurales (p. ej., LFPs ) de regiones específicas. LFPs reflejan principalmente la sumación de potenciales postsinápticos excitatorios o inhibitorios de las poblaciones neuronales locales16. Desde actividades neuronales muestreados LFP reflejan procesos neuronales que ocurren dentro de cientos de micrómetros alrededor del electrodo de la grabación, esta técnica de grabación es ampliamente utilizada para investigar la información que se procesa en el cerebro a nivel mesoscópico. Sin embargo, sólo se centra en los cambios locales precisa de actividades del cerebro y no puede responder a la pregunta de cómo se integran las señales de múltiples regiones (por ejemplo, cómo se integran componentes LEP en múltiples regiones del cerebro).

Cabe destacar que el registro simultáneo de un ECoG y corticales LFPs mueva libremente las ratas podría facilitar la investigación de procesamiento tanto macroscópico de información cortical y mesoscópica. Además, esta metodología proporciona una excelente oportunidad para investigar la medida en que las actividades neuronales de las regiones del cerebro predefinidos contribuyan a las LEPs. De hecho, varios estudios han evaluado la coherencia entre picos, LFP cortical, y ECoG señales17,18 y demostró que la LFP19,20 adyacente al electrodo de EEG contribuye a la formación de las respuestas cerebrales relacionados con estímulos. Sin embargo, la técnica existente se utiliza generalmente para grabar las respuestas cerebrales de los animales anestesiados debido a la falta de una cubierta protectora para evitar que los electrodos están dañados por la colisión. En otras palabras, la técnica que podría construir el puente de señales electrocortical a nivel mesoscópico (LFP cortical) y macroscópica (EEG y ECoG) en mover libremente las ratas todavía está careciendo.

Para solucionar este problema, hemos desarrollado una técnica que podría registrar una ECoG y LFPs corticales en múltiples regiones del cerebro al mismo tiempo se mueva libremente las ratas. Esta técnica ayuda a establecer la relación directa de señales electrocortical mesoscópicos y macroscópicos, facilitando así la investigación del procesamiento en el cerebro de la información nociceptiva.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho adultas (400-450 g de peso) en el experimento. Todos los procedimientos quirúrgicos y experimentales habían seguido a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética de investigación en el Instituto de Psicología de la Academia China de Ciencias.

1. implantación del electrodo

  1. Anestesiar la rata en una cámara con isoflurano 5% y una tasa de flujo de aire de 1 L/min antes de la cirugía.
  2. Usar un aparato estereotáxicas, fijar la cabeza de la rata con su nariz en la máscara anestésica. Administrar isoflurano a través de la máscara anestésica en una concentración del 2% con una tasa de flujo de aire de 0.5 L/min para mantener la profundidad anestésica durante la cirugía. Tenga en cuenta que la tolerancia quirúrgica se logra cuando la rata no responde a pellizcos del dedo del pie.
  3. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad corneal.
  4. Cepille la parte superior del cuero cabelludo de rata utilizando un estándar máquina de afeitar.
  5. Esterilizar el cuero cabelludo usando el yodoforo médica desinfectante solución y 75% de alcohol para quitar el yodo.
  6. Inyectar la lidocaína (2%) en el cuero cabelludo para analgesia local. Administrar atropina (i.p. 0.2 mL) para inhibir la hipersecreción respiratoria.
  7. Haga una incisión de línea media de aproximadamente 2-3 cm en el cuero cabelludo con un bisturí. Cortar y eliminar parte del cuero cabelludo a lo largo de la línea media y exponer el cráneo. Utilice el electrocoagulator para detener el sangrado, cuando sea necesario.
  8. Marque la ubicación de los electrodos ECoG basados en las coordenadas estereotáxicas predefinidas (colocadas según la posición de Bregma) y la ubicación de los electrodos de referencia y de la tierra en la línea media (a 2 y 4 mm caudalmente a la Lambda, respectivamente).
  9. Perfore los agujeros (diámetro: 0.5m m) para los tornillos de ECoG, usando un taladro eléctrico craneal del cráneo en los sitios marcados, sin destruir la dura.
  10. Un tornillo de acero inoxidable (diámetro exterior: 0,6 mm), que conecta con el alambre de cobre recubierto de aislante, en el orificio de aproximadamente 1 mm de profundidad sin penetrar la duramadre subyacente. Los tornillos actúan como ECoG, referencia y electrodos de tierra durante el experimento.
  11. Lugar una cáscara protectora base de cráneo. Fijar la base con los tornillos adyacentes en el cráneo usando acrílico dental. Usar el algodón médico que podría ser quitado posteriormente para proteger el área que se pretende utilizar para la implantación de alambre profundidad de ser cubierto.
    Nota: La cáscara protectora es un producto de diseño personalizado impreso en 3D poliláctico, que consta de tres partes: una base, una pared y una tapa. La pared está recubierta por cobre formas cónicas para la construcción de una jaula de Faraday.
  12. Marque la ubicación de los electrodos de alambre profundidad basadas en las coordenadas estereotáxicas predefinidas.
  13. Perfore pequeños agujeros (diámetro: 0,2 mm) en el cráneo alrededor de los sitios marcados para la implantación de alambre y con cuidado retire la aleta de hueso para exponer la duramadre. Lave la craneotomía con frecuencia, con solución salina normal. La figura 1 describe la configuración antes de la implantación de los electrodos de alambre de profundidad.
  14. Utilizando una aguja, levantar y cortar la dura sin dañar el mater del pia, vasos y la superficie del neocórtex.
  15. Baje los electrodos de alambre de la profundidad a la superficie del neocórtex y, entonces, penetrar lentamente el cerebro a la profundidad del objetivo. Con frecuencia se detiene a los electrodos para la resiliencia cortical. En el presente estudio, la profundidad de la punta del cable es 0,5 mm bajo la superficie cortical.
  16. Sello de la craneotomía con una mezcla de cera y parafina aceite para asegurar que los electrodos de alambre de profundidad se pueden mover para posteriores manipulaciones experimentales.
  17. Fijar el aparato de electrodos con acrílico dental en el cráneo.
  18. Soldar cada cable de cobre que se conecta al tornillo ECoG para el canal correspondiente en el módulo del conector. Cubrir los puntos de la soldadura con arcilla para evitar el contacto potencial entre los diferentes canales.
  19. Montar la pared de la cáscara protectora a la base y soldar los electrodos de referencia y de la tierra a los canales correspondientes.
  20. Fijar la tapa a la cáscara protectora utilizando cintas para evitar la contaminación.
  21. La rata se inyectan con penicilina (60.000 U, i.p.) inmediatamente después de la cirugía para prevenir las infecciones posquirúrgicas.
  22. Solo-casa de la rata en una temperatura y humedad controladas - de la jaula y mantener en un ciclo de día/noche 12 h después de la cirugía, con comida y agua ad libitum durante al menos una semana antes el experimento LEP.
    Nota: Para grabar de manera simultánea corticales actividades LFP y ECoG, un aparato se utilizó aquí que fue montado con dos tipos de electrodos ligados a un módulo del conector, que contenía varios microdrives conectados a los arreglos de discos de alambre de tungsteno. Los pasadores de oro fueron utilizados para conectar los cables de tungsteno a la tarjeta de interfaz de electrodo (BEI) del módulo conector presionando los cables en los agujeros pequeños de metal en el BEI. Dos agujeros de metal en el BEI fueron soldados con alambres de cobre revestidos, y el extremo abierto de cada alambre de cobre fue soldado con el correspondiente alambre de cobre conectado al tornillo de ECoG. Los detalles de fabricación han sido descritos en otra parte21.

2. recolección de datos

  1. Cosquillas en la rata por lo menos 1 x al día durante tres o más días consecutivos antes del experimento para asegurar que la rata obtiene familiarizada con el experimentador22.
  2. Colocar la rata en la cámara de comportamiento durante al menos 1 h antes del experimento para que la rata se aclimata al ambiente de grabación.
    Nota: La cámara es un cubo de plástico con una longitud lateral de 30 cm. La parte inferior de la cámara está hecha de una reja de hierro con huecos de ~ 8 mm.
  3. Conectar la headstage de grabación con el módulo de electrodo suavemente, para evitar asustar a la rata y dañar el módulo de electrodo.
  4. Configurar el generador del laser, conectar la fibra óptica y ajuste el tamaño del punto del láser según el manual de equipos. Conectar la salida digital de la activación al puerto de entrada digital de la Junta de la grabación.
    Nota: tenga cuidado de no enrollamiento de la fibra óptica excesivamente para evitar la rotura de la fibra. Antes de grabar, asegúrese de que las señales de disparo se muestran y grabadas por el software de grabación. En este protocolo, estímulos de calor radiante son generados por una perovskita de aluminio neodimio infrarrojo itrio (Nd: YAP) láser con una longitud de onda del μm 1.34. El diámetro del tamaño del punto láser se encuentra a aproximadamente 5 mm por los lentes de enfoque. Un láser He-Ne se refirió a la zona estimulada, que se define según el objetivo del experimento. También, la energía del estímulo de los pulsos del láser se determina según el diseño experimental. La duración del pulso del laser es de 4 ms.
  5. Ajuste la cámara de vídeo debajo de la esquina de la cámara experimental para registrar continuamente los comportamientos nociceptivos de la rata cuando su pata recibe estímulos nociceptivos láser. Ajustar la posición y dirección de la cámara para asegurarse de que los comportamientos nociceptivos se registran completamente durante todo el experimento.
    Nota: Una cámara de alta velocidad dispositivo de carga acoplada (CCD) es muy recomendable, como pueden entregar las señales de funcionamiento a la placa principal del sistema de grabación para registrar el tiempo de inicio y la duración de la conducta nociceptiva precisamente. Comportamientos nociceptivos son evaluados por el experimentador después de cada estímulo láser, según criterios previamente definidos basados en el movimiento animal23,24, del modo siguiente: no hay movimiento (puntuación = 0), girar la cabeza (incluyendo temblores o elevación de la cabeza; Puntuación = 1), vacilar (es decir, un pequeño cuerpo de brusco movimientos bruscos movimiento; puntuación = 2), retiro (es decir, retracción de la pata desde el estímulo láser; puntuación = 3), movimiento lamer y todo el cuerpo (puntaje = 4).
  6. Brindar constante ruido blanco (50 dB SPL) a través de un altavoz en la parte superior de la cámara.
    Nota: Como se indica en anteriores estudios10,25, estimulación láser sobre la piel genera ultrasonidos que pueden ser detectados por el sistema auditivo de la rata. Por esta razón, constante ruido blanco se juega durante todo el experimento para evitar la activación del sistema auditivo en respuesta a los ultrasonidos generados por láser. Este procedimiento permite la grabación selectiva de las respuestas cerebrales relacionadas con la activación del sistema nociceptivo.
  7. Recoge los datos electrofisiológicos de la ECoG y los electrodos de alambre de profundidad, utilizando el sistema de grabación según el manual del equipo.
    Nota: Las señales de funcionamiento de la cámara y el disparador de las señales de los pulsos del láser son muestreadas simultáneamente con los datos electrofisiológicos al mismo velocidad de muestreo (todos los datos son amplificados y digitalizan utilizando una tasa de muestreo de 20.000 Hz), que asegura todos los datos son sincronizados en tiempo.
  8. Entregar los pulsos del láser a la plantar de forepaw la rata a través de los huecos en la parte inferior de la cámara.
    Nota: El estímulo del laser se entrega solamente cuando la rata es espontánea quietud durante más de 2 s basado en la observación del experimentador, para reducir al mínimo la contaminación de la señal de los artefactos relacionados con el movimiento. Para evitar la fatiga del nociceptor o sensibilización, el objetivo del haz láser se desplaza manualmente después de cada estímulo y el intervalo del interstimulus nunca es menor de 40 s. ECoG y señales de la LFP pueden grabarse varias veces de cada rata. La rata necesita ser puesto en la cámara experimental 1 h antes de cada sesión de grabación. Después de todo las sesiones de grabación, la rata fue profundamente anestesiada y perfusión transcardially con solución salina tamponada con fosfato helada seguida de paraformaldehído al 4%. El cerebro fue quitado del cráneo y seccionado para identificar las posiciones de los electrodos.

3. Análisis de los datos

  1. Filtrar los datos continuos con un filtro band-pass entre 1 y 30 Hz.
  2. Época los datos utilizando una ventana de análisis de 3 s, extendido de 1 s antes a 2 s después de la aparición de estímulos de láser. Corrección de línea base se realiza restando la amplitud media dentro del intervalo de prestimulus.
  3. Rechazar manualmente las épocas que están contaminadas por los artefactos brutos.
  4. Calcular la media onda LEP que son tiempo-bloqueada la aparición de los estímulos de láser para cada condición experimental.
  5. Calcular que la coherencia de transformación wavelet (WTC) de formas de onda LEP grabado de ECoGs y profundidad alambre de electrodos.
    Nota: WTC es una técnica para llevar a cabo la coherencia entre pares de electrodos en función de tiempo y frecuencia. El WTC entre dos señales se puede calcular para cualquier punto de la frecuencia de tiempo, que tiene la ventaja de generar valores de la coherencia de todo el espectro de frecuencia de tiempo. Los detalles de la metodología han sido descritos en otra parte26.

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Results

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En el experimento representativo, se registraron los datos electrofisiológicos de cinco ratas. Los estímulos de láser fueron entregados a la derecha forepaw de cada rata por 20 veces con > 40 intervalos interstimulus de s. El cerebro evocado laser las respuestas fueron registradas usando ECoG tornillos y cables de profundidad y los cables de profundidad fueron implantados en bilaterales cortezas somatosensoriales primarias (S1) y cortezas de motor principal (M1).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el presente estudio, describimos una técnica para registrar simultáneamente ECoGs y respuestas LFP corticales provocadas por estímulos nociceptivos laser se mueva libremente las ratas. Los resultados mostraron que las respuestas LEP se pudieran detectar claramente después de la aparición de estímulos de láser en las señales de ECoG y LFP. La grabación simultánea de ECoG y cortical LFP permitirá a los científicos investigar su relación para comprender mejor la contribución de las actividades neuronales a los componente...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por CAS laboratorio clave de Salud Mental, Instituto de psicología, la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31671141 y 31822025), el 13th Plan de informatización de cinco años de la Academia China de Ciencias (XXH13506), y el proyecto de la Fundación científica del Instituto de Psicología de la Academia China de Ciencias (Y6CX021008).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ratas macho Sprague-DrawleyIsoflurano Vital River
RWD Life Science
Sistema de anestesia de isoflurano para animales pequeñosRWD Life ScienceIncluyendo la máscara antigás de anestesia para ratas
Aparato estereotáxicoRWD Life Science
El aparato con electrodoscombinados ECoG y LFPEl aparato es de fabricación casera, que ensambla el ECoG y los electrodos de alambre de profundidad a un módulo
conector CarcasaLa textura de la carcasa es poliláctica, y la carcasa es casera y contiene tres partes: una base, una pared y una tapa. La pared está cubierta por conos de cobre para construir como una jaula de Faraday
Alambres de tungsteno (diámetro: 50 mm)California Fine Wires CompanyLos electrodos para el registro cortical de LFP
  Tornillos de acero inoxidable
(diámetro: 0,6 mm)		Los electrodos para el registro ECoG
Taladro craneal eléctricoRWD Life Science
  Broca (diámetro: 0,5 mm)RWD Life ScienceEl taladro se utiliza para perforar los agujeros de los tornillos ECoG
  Broca (diámetro: 0,2 mm)RWD Life ScienceEl taladro se utiliza para perforar los agujeros de los cables de profundidad 
Polvo arílico dentalSNC dental
Líquido arílico dentalSNC
Fisher ScientificLa mezcla se utiliza para sellar la craneotomía para asegurar el siguiente movimiento de las matrices de microalambres:
Aceite mineralFisher Scientific
Electrocoagulador Bovie medical Corporation
RHD2132 Placas de amplificación Intan TechnologiesUn sistema de RHD2000 de cabecera de 32 canales
Intan TechnologiesEl sistema de adquisición de datos
Generador láser de perovskita infrarroja de neodimio, itrio y aluminio (Nd:YAP)Ingeniería
Matlab R2016bEl MathWorks 
protectora impresa en 3D parafina dental Electrónica

References

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