El objetivo de este protocolo es aislar los queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratones adultos para una variedad de aplicaciones aguas abajo, como biología molecular, bioquímica, clasificación celular activada por fluorescencia y usos primarios in vitro (por ejemplo, clonogénicos queratinocitos).
Artículo de método
Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
El protocolo descrito aquí es un método fiable para cosechar queratinocitos primarios de ratones hembra adultos (54 x 2 días de edad) produciendo aproximadamente 30 x 106 células viables por ratón. Los queratinocitos de ratón adultos primarios se cosechan de la piel dorsal de los ratones hembras. Los ratones machos (6 semanas de edad) se pueden utilizar para la cosecha de queratinocitos dependiendo de los requisitos del experimento. Los ratones eutanasiados se asempolvan y esterilizan con lavados en serie en soluciones de yodo de povidona y etanol (70% alcohol). Después de desinfectar los ratones, se retira la piel dorsal y se elimina la grasa y el músculo subcutáneos con un bisturí y se desechan. Las pieles se cortan en trozos pequeños y se tratan con una trippsinización leve y a baja temperatura para separar la dermis inferior de la epidermis. Las epidermises raspadas se agitan a baja velocidad, se filtran para eliminar los pelos, se cuentan y se vuelven a suspender en el medio de cultivo. Este método proporciona una excelente suspensión de una sola célula de células altamente retorcebles para muchas aplicaciones aguas abajo.
Introducción
La piel de mamífero cubre todo el cuerpo y cumple una multitud de funciones (por ejemplo, una barrera física primaria, regulación de la temperatura y retención de humedad). Durante las últimas cinco décadas, la investigación básica sobre la piel del ratón ha dado nueva información sobre la estructura y la función de la piel. El modelo de piel de ratón ha ayudado en gran medida a comprender la biología básica detrás de los complejos mecanismos moleculares de la carcinogénesis inducida por radiación ultravioleta o química. Estos modelos de piel de ratón proporcionaron una contribución significativa a la comprensión de las enfermedades de la piel humana y su mitigación. Para explorar más disección molecular de los principales queratinocitos en la biología del desarrollo del folículo piloso, la investigación de células madre, la carcinogénesis y la exploración genética de la epidermis, con frecuencia es deseable aislar y cultivar epitelial primario queratinocitos de la piel de ratones para usar en paralelo con experimentos in vivo. El factor motivador en el desarrollo de este método fue la necesidad de un ensayo in vitro para células madre epidérmicas clonogénicas y folículos pilosas1,2. También era urgente que se necesitaran suspensiones de células únicas decélulas epidérmicas adecuadas para ensayos clonogénicos 3, clasificación celular activada por fluorescencia y citometría de flujo3,4. Las ventajas de este método son un fuerte aumentode la cosecha un orden de magnitud sobre otros métodos 5,6,la inclusión de la porción epitelial de los folículos pilosos, y la alta culturabilidad de las células cosechadas. En la década de 1980, no había métodos conocidos que pudieran cumplir estos requisitos. En los años siguientes, este método fue refinado para aumentar el rendimiento celular. La principal limitación de este método sería enmascarar algunos anticuerpos sensibles a la trippsina que comprometerían la inmunoreactividad6.
Los ratones recibieron cría de acuerdo con las pautas específicas libres de patógenos. Se obtuvieron de uno a cinco ratones hembra de 54 a 2 días de edad. En ratones más viejos, la viabilidad de los queratinocitos se reducirá debido a la fase anágena (crecimiento) del ciclo capilar. Además, el proceso de trippsinización es más difícil en comparación con los ratones jóvenes. El procedimiento de cosecha se ha optimizado con éxito para la piel más delgada de los ratones hembra en comparación con los machos. Los ratones machos generalmente no se utilizan para las cosechas de queratinocitos, ya que tienen una tendencia a luchar entre sí durante la vivienda y por lo tanto pueden dejar arañazos o heridas en la piel.
Protocolo
Todos los protocolos de uso de animales vertebrados han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Minnesota de acuerdo con las directrices recomendadas de NIH y del gobierno.
1. Inicialización y subculturación de la capa del alimentador
- Descongelar un vial de celda que contiene el ratón suizo congelado 3T3 del tanque de nitrógeno líquido colocando el vial en un baño de agua de 37 oC durante 1-2 min. El número de células en el vial es de aproximadamente 1 x 106.
- Retire el vial de células 3T3 cuando la astilla final de hielo se haya derretido. Limpie el tubo con un hisopo de alcohol al 70%. A continuación, transfiera el vial a un armario de bioseguridad.
- Transfiera las células lentamente a un matraz T-150 y enjuague el vial 3T3 con 1 ml de medio de Mga. Agregue lentamente 30 ml de medio de crecimiento completo (CGM) 3T3 precalentado a las células. Mece suavemente el matraz para extender uniformemente las células fibroexplosivas 3T3. Etiquete el matraz con los detalles de la línea de celda, la fecha y el número de pasaje de forma adecuada.
- Incubar las células a 37oC con 5% deCO2 y 95% de humedad.
NOTA: Según el ATCC, el tiempo de duplicación del ratón suizo 3T3 es de 18 h; cuando el confluente (contacto inhibido), la densidad es deaproximadamente 40.000 células por cm 2. Usamos una línea particular de 3T3 dentro de 10-15 pasajes después de la inicialización. Un crecimiento más rápido o la presencia de células en forma de husillo pueden ocurrir en pasajes más altos y por lo general es una señal de que el 3T3 no funcionará tan bien como las células alimentadoras para los queratinocitos de ratón adultos. Si se produce un crecimiento rápido, es mejor iniciar una nueva línea a partir de celdas de paso inferior. - Cambiar los medios después de 24 h para eliminar las células muertas y el DMSO restante (agente de criopreservación), y dos veces por semana a partir de entonces. Permita que las células proliferen alrededor del 80% de confluencia y utilice matraces T-150 para iniciar el cultivo. Utilice matraces T-225 para la subcultura después de la inicialización.
- Para subcultivo 3T3 células fibroblastas, retire el matraz de la incubadora de cultivo celular y lave dos veces con PBS estéril frío (1x) con gentamicina. Pipet 10 mL de solución de trippsina precalentada (37 oC) (0,25%) en cada matraz T-225.
- Coloque el matraz sobre una placa de calentamiento durante 3-8 minutos. Retire el matraz y utilice suavemente las palmas para tocar las paredes del matraz para separar las células y confirmar el desprendimiento de la célula bajo el microscopio invertido. La solución de trippsina puede aparecer turbia con células 3T3 desprendidas.
- Pipet a la solución de trippsina 3-4x para lavar la superficie de crecimiento celular del matraz y transferir la célula trippsinizada a 30 ml de MGC en un tubo cónico de 50 ml. Vuelva a lavar el matraz de 3 a 5 veces con 10 ml de la mezcla de células de CGM-trippsina del tubo cónico de 50 ml.
NOTA: El contenido de dos contenidos del matraz se puede añadir a un tubo de 50 ml; si sólo se utiliza un matraz, coloque 10 ml de trippsina/células en 20 ml de MGC en un tubo de 50 ml. - Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 160 x g durante 7 min a 4 oC.
- Ahora aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 5 ml de CGM, pipeteando suavemente 10veces para interrumpir completamente el pellet celular. Añadir 10 ml de CGM para llevar el volumen total del tubo cónico de 50 ml a 15 ml.
- Mezcle de nuevo 10x y coloque 5 ml de la suspensión celular en 3 matraces T-150 separados. La relación de subcultivo es de 1:3 en matraces T-225 o 1:4 en matraces T-150. Añadir 30 ml de CGM 3T3 precalentado a cada uno de los matraces.
- Etiquete el matraz con el nombre de la línea de celda, la fecha de la sembración de celdas y el número de paso.
- Para congelar las células 3T3 después de la centrifugación en el paso de subcultivo, retire el tubo de 50 ml de la centrífuga y colóquelo en un cubo de hielo. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 1 ml de mezcla DMSO-DMEM al 5% (ver Tabla1) para cada matraz cosechado.
- Colocar 1 ml de mezcla DMSO-DMEM con suspensión celular en cada criovial (un criovial por matraz 3T3 cosechado). Etiquete el vial con el número de paso, el nombre de la línea celular (3T3) y la fecha en que las celdas se congelaron.
- Coloque estos viales de celda 3T3 en un frasco de congelador de celdas (ver Tabla de materiales)y transfiera a un congelador de -70 oC para >5 h. Retire y transfiera cuidadosamente los viales del frasco del congelador de celdas y colóquelos en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo hasta el próximo uso . Introduzca información sobre el nombre de la línea celular, la ubicación en el tanque y la fecha en la hoja de inventario de nitrógeno líquido de laboratorio.
2. Preparación de la capa de alimentación 3T3 para la irradiación y la sembración de rayos X
- Prepare las células 3T3 una semana antes de su irradiación y permítales crecer un 100% de confluencia. Las células 3T3 están típicamente dentro de los pasajes de 120 a 130.
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Para los ensayos clonogénicos exitosos de queratinocitos primarios, antes de sembrar células 3T3, cubra la superficie de los platos Petri de 60 mm con un colágeno.
- Pipet a unos 2-3 ml de la solución de recubrimiento de colágeno en platos Petri de 60 mm para recubrir la superficie inferior y eliminar el exceso de líquido de recubrimiento de colágeno (ver Tabla 1). Transfiera los platos de Petri a una incubadora de 37oC con 5% de CO2 durante un mínimo de 1 h. No deje que los platos se sequen en la incubadora.
- Paso de irradiación de rayos X: Siga los pasos 1.4–1.6. Utilice 50 ml de CGM fresco para volver a suspender el pellet celular, cerrar el tubo cónico y sellar con película de sellado de parafina. Para evitar cualquier contaminación, utilice bolsas de plástico para embolsar dos veces la celda sellada con parafina que contiene el tubo y colóquela sobre hielo. Una capa de alimentación alternativa basada en mitomicina se puede utilizar para el cultivo de queratinocitos7.
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Irradiar células 3T3 de fibroblastos en el tubo cónico de 50 ml con una dosis de 5.000 rads (50 Cgy) con una máquina biológica de rayos X. Irradiar estas células junto con los medios CGM.
- Después de la irradiación de rayos X, las células centrífugas a 160 x g durante 7 min a 4 oC. Aspirar el medio sobrenadante y resuspender suavemente el pellet celular con 5 ml de CGM triturando suavemente 10x. Ahora lleva el volumen final a 30 mL con 25 mL adicionales de medio y triturar 10x. Estos pasos de trituración son cruciales para la capa uniforme de fibroblastos 3T3 para el ensayo de clonogenicidad.
- Recuento celular viable: Cuente los queratinocitos usando un hemocitómetro de vidrio regular. Tome aproximadamente 0,5 ml de las células y colóquelas en un tubo de 1,5 ml. Retire 200 ml de mezcla celular y agregue un volumen igual de solución azul Trypan al 0,4% y mezcla 3-4x. Transfiera las células con un hemocitómetro y cuente todas las células nucleadas (pequeñas células doradas y rosas) como células viables. Calcular la concentración final de celdas de oro viables.
- Pipetear 1 x 106 3T3 células (se pueden utilizar un mínimo de 7 x 105) células) en platos Petri recubiertos de colágeno de 60 mm (paso 2.2) y añadir suavemente 4 ml de medios Williams E modificados de alto calcio (ver Tabla 1). Permita que las células 3T3 recién sembradas se adhieran durante 24 horas. Al día siguiente, cosecha el queratinocitos primarios frescos y sócérbalos encima de la capa de fibroblastos 3T3 adjunta para el ensayo clonogénico como se indica a continuación.
3. Cosecha y sembrado de queratinocitos primarios
- Eutanasia de cuatro a cinco ratones hembra adultos a través de la inhalación de CO2 de acuerdo con las normas aprobadas para instalaciones para animales/IACUC. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para ratones hembra/macho sin mujeres.
- Recortar aproximadamente 9 cm2 de la piel dorsal con una cortadora de animales eléctrica y colocar todos los ratones recortados en un frasco de 500 ml con suficiente solución antiséptica de yodo de povidona (no exfoliar) para cubrirlos durante 1-2 min. Agitar el frasco bien para cubrir uniformemente el antiséptico antiséptico solución sobre los ratones.
- Vierta la solución y enjuague con agua limpia hasta que el líquido se despeje. Repita el mismo lavado antiséptico seguido de un enjuague con agua. Después del lavado antiséptico con solución de yodo, remoje todos los ratones en etanol al 70% durante 5-10 min.
NOTA: Los ratones con piel clara (por ejemplo, BALB/c) conservarán un ligero color amarillento de los lavados de yodo antiséptico, mientras que los ratones más oscuros (por ejemplo, C57BL/6) no. En particular, la viabilidad celular o el crecimiento del cultivo no se ve afectado debido al color amarillo.
- Retire con cuidado la piel dorsal recortada con fórceps y tijeras en una capucha de flujo laminar. Coloque la piel dorsal extirpada en un tubo cónico lleno de PBS/2x gentamicina. Evite el uso de la piel lateral ventral para prevenir la contaminación de las células mamarias en el cultivo.
- Usando fórceps autoclavedos y un bisturí, coloca una piel dorsal a la vez peluda hacia abajo en un plato delgado de Petri. Comience a raspar todo el tejido subcutáneo, incluida la grasa del lado ventral del tejido cutáneo, hasta que esté semitranslúcido. Trate de eliminar los máximos rastros de tejido subcutáneo sin rasgar la piel (parte del folículo piloso). Además, no raspe durante mucho tiempo y evite el secado de la piel.
- Mantenga la piel raspada en solución de PBS hasta que se procesen todas las demás pieles restantes. Con un bisturí, corte las pieles en tiras de 0,5 cm x 1-1,5 cm y coloque el lado peludo en un plato estéril de Petri.
- Pipeta cuidadosamente 20 mL de solución de gentamicina PBS/2x mezclada con tripsina (0,25%) en una placa Petri de plástico de 100 mm x 20 mm. Usando fórceps estériles, transfiera las pieles y flote su lado peludo hacia arriba en la superficie de la solución de trippsina durante 2 h en una incubadora de 32 oC.
NOTA: El tiempo y la temperatura de la tripinización son cruciales para un buen rendimiento de los queratinocitos primarios altamente cosechables. Aunque otros métodos pueden proporcionar buenos rendimientos de células viables, la cultura de los queratinocitos ha sido menos satisfactoria.- Durante este tiempo de incubación de 2 h, cubra los platos con recubrimiento de colágeno y colóquelos a 37 oC durante 1 h (ver paso 3.1.2). Para ensayos clonogénicos, los platos Petri de 60 mm ya han sido recubiertos 24 horas antes de la cosecha de queratinocitos para permitir que la capa de alimentación 3T3 irradiada se adhiera a la parte inferior y se propague uniformemente.
NOTA: El recubrimiento de platos de cultivo para el cultivo clonogénico es muy importante para el apego adecuado, la formación de colonias y el crecimiento/proliferación final de ratones queratinocitos epidérmicos.
- Durante este tiempo de incubación de 2 h, cubra los platos con recubrimiento de colágeno y colóquelos a 37 oC durante 1 h (ver paso 3.1.2). Para ensayos clonogénicos, los platos Petri de 60 mm ya han sido recubiertos 24 horas antes de la cosecha de queratinocitos para permitir que la capa de alimentación 3T3 irradiada se adhiera a la parte inferior y se propague uniformemente.
- Paso de raspado epidérmico: Organizar una placa Petri cuadrada de plástico estéril y crear una superficie a una pendiente de 30o para un raspado epidérmico adecuado con 15 ml de medio de cosecha (ver Tabla 1). Retire cuidadosamente una tira de piel flotante de la solución de trippsina con fórceps curvos. Con una nueva cuchilla de bisturí, raspe la epidermis y los pelos en el medio.
- No utilice fuerza excesiva, pero utilice la fuerza suficiente para raspar la epidermis, o afectará la viabilidad celular.
- Durante el raspado de epidermis, mantenga la hoja perpendicular a la pieza de la piel. Si la hoja está inclinada hacia el movimiento de la hoja, hay más posibilidades de desgarro de la piel. Si la hoja está en ángulo lejos del movimiento de la hoja, hay más posibilidades de eliminación insuficiente de la epidermis.
- Vierta cuidadosamente el medio de cosecha que contiene células epidérmicas raspadas en un frasco estéril de 60 ml (autoclavable y reutilizable) con una barra de agitación magnética de 1,5 pulgadas. Enjuague el plato Petri con medio de cosecha adicional para recoger las células epidérmicas restantes y llevar el volumen final a 30 ml. Utilice un agitador magnético y revuelva a 100 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este proceso eliminará las células epidérmicas atrapadas de los cabellos.
- Coloque un colador de células estéril de 70 m en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. El colador de celda cabe en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml.
- Lleve el frasco dentro de una campana de bioseguridad. Retire la barra de agitación y vierta el contenido en el filtro del colador unido a un tubo cónico de 50 ml. Estirar el cabello no deseado y las hojas de estrato córneo.
- Presione los pelos junto con los materiales del estrato córneo dentro del colador y manipule los para liberar las células pilosas atrapadas. Utilice 5 ml de medio de cosecha para permitir que las células atrapadas restantes se liberen y fluyan hacia el tubo. Lleve el volumen total hasta 50 ml en tubo cónico.
- Tapar el tubo cónico de 50 ml con filtrado celular y centrifugar a 160 x g durante 7 min a 4oC. A continuación aspirar el sobrenadante y añadir 5 mL de medio de cosecha. Resuspenda el pellet de celda triturando suavemente 20x con un pipeta de 5 ml.
- En este paso, mantenga las celdas en una nevera para evitar cualquier agregación. Añadir 25 ml de medio de cosecha y triturar de nuevo (20-25x).
- Para garantizar un recuento preciso de queratinocitos en este paso, tomar 1 ml de suspensión celular y añadir 19 ml de medio de cosecha. Ahora la dilución celular es 1:20 en tubo cónico de 50 ml. Si los queratinocitos se cosechan de un solo ratón, ajuste el volumen de la suspensión celular. En lugar de 30 ml, utilice 15 ml y haga una dilución 1:10 para contar las células.
- Pipet 0,5 ml de células diluidas del tubo cónico de 50 ml (dilución 1:20) y transferir a un tubo de microcentrífuga autoclave de 1,5 ml. Retire 0,2 ml (200 ml) de mezcla celular a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada un volumen igual (200 ml) de una solución azul Trypan al 0,4%. Mezcle suavemente esta solución 3x y transfiera las células a un hemocitómetro para contar los queratinocitos nucleados.
- Puntuar todas las células azules oscuras positivas para Trypan azul como células muertas no viables, y puntuar pequeñas células de oro y rosado como células viables. El rendimiento final del queratinocitos por ratón debe ser de alrededor de 30 millones de células viables.
- Centrifugar el tubo cónico original de 50 ml (del paso 3.8) durante 7 min a 160 x g a 4 oC. En este paso, resuspenda las células en el medio deseado y haga la dilución necesaria para la sembración de células.
- Para el cultivo en masa, semilla de 2 a 4 millones de células de oro viables en cada plato Petri de 35 mm en medio de cultivo celular (medio de tipo KGM + suplementos para cultivos monocapa) (ver Tabla 1). Para un ensayo clonogénico (formación de colonias), semilla 1.000 células por plato Petri de 60 mm en capas de alimentación 3T3 de ratón suizo irradiadas por rayos X con recubrimiento de colágeno y medio DeWilliam's E modificado con suplementos y suero.
- Utilice un medio de 2 a 4 ml para platos Petri de 35 mm y 60 mm, respectivamente. Además, formular el medio DMEM y Williams E adquirido de ATCC conniveles reducidos de bicarbonato sódico para su uso al 5% de CO 2.
- Cultivar las células de cultivo (masa o clonogénicas) a 32 oC, 95% de humedad con 5% co2. Cambiar los medios un día después de la sembración inicial para el cultivo de masas, y luego 3 veces semanalmente a partir de entonces. Sin embargo, para los ensayos clonales, el primer cambio medio es 2 días después de la sembración celular y 3 veces semanalmente a partir de entonces.
- Para el cultivo clonal, cultive las células a intervalos de dos y cuatro semanas. Después de la finalización de los cultivos clonales (2 o 4 semanas), aspirar el medio. Fijar las colonias en 10% de formalina tamponada durante la noche a temperatura ambiente y mancha con 0.5% de rodamina B en agua de autoclave durante 1 h. A continuación, retire la mancha de rodadamina B con una pipeta del borde de los platos.
- Enjuague los platos con agua fría autoclave hasta que los platos estén limpios. Ponga los platos inclinados en la tapa de los platos y déjelos secar para el conteo final de colonias. En particular, al realizar el ensayo de cultivo clonogénico, nunca pipetee <1 ml de células. Si las células se concentran, diluya en serie la concentración celular.
Resultados
Típicamente, los rendimientos de los queratinocitos epidérmicos por ratón que van desde 20 x 106 a 30 x 106 Trypan azul excluyendo las células se obtienen8,9. La viabilidad oscila entre el 80% y el 90%. Las eficiencias típicas de la sembración son alrededor del 30% de fijación a 24 h. La formación de colonias en capas de alimentación 3T3 irradiadas es de alrededor de 60 colonias por cada 1.000 células viables sembradas para ratones C57BL/6, y aproximadamente 30 colonias por cada 1.000 células para ratones de tipo suizo10 ,11. Los resultados típicos de los ensayos de formación de colonias se ilustran en la Figura1. El número de células madre del folículo piloso es aproximadamente 9% CD34+/CD49f+ células madre para ratones C57BL/612. Los resultados típicos de la citometría de flujo se indican en la Figura2.
Las características de crecimiento de cuatro medios diferentes se ilustran en la Figura3. Los medios probados incluyen KGM-gold, SFM, William's E medium y Morris-2 (un medio de calcio reducido desarrollado en el laboratorio Morris basado en Williams E).
Figura 1: Ejemplos representativos de un ensayo para queratinocitos clonogénicos de ratones adultos. Esta fotografía demuestra la formación de colonias de queratinocitos de ratones hembra CD-1 54 días de edad tratados tópicamente con 1) sin tratamiento, 2) acetona seguida una semana más tarde por acetona dos veces por semana durante dos semanas, 3) DMBA seguido una semana más tarde por acetona dos veces por semana durante dos semanas, 4) acetona seguida una semana más tarde por TPA dos veces por semana durante dos semanas, y 5) DMBA seguido una semana más tarde por TPA dos veces por semana durante dos semanas. Después de sus tratamientos in vivo, los queratinocitos fueron cosechados y sembrados a 1.000 células por plato en capas alimentadoras de 3T3 irradiado, y cultivados durante dos semanas, después de lo cual los platos se fijaron con formalina tamponada y se teñir con rodamina B. Los platos de cada columna son réplicas de cada grupo de tratamiento del ratón. Tenga en cuenta que el número de colonias más grandes aumentó tras el tratamiento con DMBA, y el número total de colonias aumentó el tratamiento tpA de los ratones antes de la cosecha de queratinocitos. Abreviaturas: DMBA: 7,12-dimethylbenz[a]anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo representativo de citometría de flujo de células madre de folículos pilosos de ratones adultos. Brevemente, los queratinocitos primarios aislados fueron aislados de la piel de ratones dorsales y filtrados para desechos celulares usando filtro celular. La suspensión aislada del queratinocitos fue etiquetada con anticuerpos CD49f o 6-integrina (PE) y CD34 (FITC) junto con tinte muerto vivo y otros controles. Los anticuerpos de control de isotipos FITC y PE (Rat IgG2akappa) se utilizaron con fines de compensación (ver Tabla de Materiales). Las células madre fueron seleccionadas por medio de CD49f (canal PE), que reconoció el componente externo de los hemi-desmósomas encontrados en células epidérmicas basales y folículos pilosos, y CD34 (canal FITC), que reconoció las células madre del folículo piloso (es decir, CD34-FITC+ y a6-PE+ (columna superior derecha, total 5%)). La columna lateral derecha muestra las diferentes poblaciones de queratinocitos, a saber, sólo CD34-FITC, células CD34-FITC y a6-PE (población de células madre positivas dobles), solo a6-PE y células no manchadas. Tenga en cuenta que hay dos poblaciones de CD34+ células madre como se han informado6,14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de cuatro medios diferentes en cultivos primarios de células epidérmicas de ratones hembra adultos. Los queratinocitos primarios fueron aislados de la piel de ratones dorsales y contados para la sembración utilizando cuatro medios diferentes (KGM, SFM, Willem's-E y Morris-2). El mismo número de queratinocitos fueron sembrados y seguidos por su morfología general y patrón de crecimiento. Tenga en cuenta que los queratinocitos proliferantes tienen morfologías ligeramente diferentes. KGM, SFM, y Morris-2 todos los cuales son medios de calcio reducidos tienen el crecimiento más robusto después de catorce días. Por el contrario, las células no persisten cuando se cultivan en el medio Williams E que tiene 1,4 mM de calcio y una alta proporción de potasio a sodio. Sorprendentemente, el medio Williams E con suplementos y el suero bovino fetal del veinte por ciento apoya los cultivos clonales de queratinocitos mucho mejor que cualquier otro medio probado, probablemente porque el medio Williams E enriquecido ayuda a las células alimentadoras 3T3 a "alimentar" mejor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Soluciones y Medios de Comunicación | Comentarios |
| Soluciones de cosecha | |
| 2.5% de trippsina (5 mL) | |
| PBS de Dulbecco (500 mL) | |
| Gentamicina (2 mL) | |
| PBS con 2x gentamicina (45 ml) | |
| Salina con fosfato (PBS) con 2x gentamicina | |
| Solución de trippsina | |
| Soluciones de cultivo celular | |
| Solución de revestimiento de platos Purecol-fibronectina: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Albúmina sérica bovina 1,0 mg/ml (10 ml) | |
| Medio de cultivo celular (100 mL) | |
| Fibronectina (1 mg) | |
| Colágeno Purecol (1 mL) | |
| Solución de congelación celular | |
| DMSO (2 mL) | |
| DMEM con 10% BCS y pen-strep | |
| Medio de cosecha | Necesita estar sin calcio |
| 2x gentamicina (1 mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| SMEM (500 mL) | |
| Medios E de High-Calcium Williams con: | |
| EGF (5 g/ml) 1 mL | |
| Glutamina 14,5 mL | |
| Hidrocortisona (1 mg/ml) 0,5 ml | |
| Insulina 1 mL | |
| LinoAcid-BSA (0,1 mg/ml) 0,5 ml | |
| MEM Ess AminoAcids 4 mL | |
| Vitaminas MEM 5 mL | |
| Penicilina-Estreptomicina 5 mL | |
| Transferrina (5mg/ml) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1.000 l) 57,5 l | |
| Vit E 1 mg/ml (4oC) 3,5 oC | |
| Vit D2 (10 mg/ml) 50 l | |
| Medio de crecimiento completo de fibroblastos 3T3 (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penicilina-estreptomicina (10 mL) | |
| Kgm | El medio utilizado para el cultivo en masa es un medio de calcio reducido |
| Medio Morris 2 con los mismos suplementos que el E de Williams | Una variante reducida de calcio de Williams E con suplementos |
Tabla 1: Recetas de soluciones y medios.
Discusión
El método de recolección de queratinocitos descrito aquí fue desarrollado para producir altos rendimientos de queratinocitos epidérmicos primarios altamente cosechables de la parte posterior de ratones hembra adultos. Estos queratinocitos son adecuados para la citometría de flujo, la aplicación de la biología molecular y el cultivo celular primario, incluido el ensayo clonogénico que se indica aquí. Este método de recolección de queratinocitos también ha sido útil para el estudio de otros aspectos aguas abajo de la carcinogénesis química cutánea y la promoción tumoral1,13.
Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para el rigor y la reproducibilidad, se utilizaron ratones hembra de 54 a 2 días de edad. Esto nos ha permitido realizar ensayos de colonias sensibles y cuantitativos a partir de múltiples cepas de ratones y utilizarlos como fenotipo en el análisis de enlaces que conduzca a la identificación de al menos un nuevo gen regulador de células madre10,11. En segundo lugar, es útil cortar las pieles en trozos más pequeños, ya que la trippsinización es más eficaz que tratar de mantener la piel entera. En tercer lugar, el tiempo y la temperatura de la flotación de tripsina es muy importante para la posterior cultura. Además, uno necesita "golpear considerablemente" los pelos que quedan en el filtro para desalojar las células unidas. Este paso es importante para obtener altos rendimientos de las células. Además, la temperatura de 32 oC de la incubadora es importante para el cultivo a largo plazo de queratinocitos de ratones adultos. Por último, en este protocolo, las lecturas paralelas de los experimentos in vitro e in vivo1 se basan en cultivos primarios en lugar de subculturas o líneas celulares. En particular, si se cosechan los queratinocitos primarios por primera vez utilizando este protocolo, mantenga la dermis restante después de raspar para confirmar la eliminación completa de los folículos pilosos junto con la epidermis por observación histopatológica.
La principal fortaleza de este protocolo para la cosecha de queratinocitos de ratón adultos es que produce altos rendimientos de células cosechables que son adecuadas para muchas aplicaciones posteriores. La principal limitación es que algunos epítopos de superficie celular pueden ser sensibles a la trippsinización, de tal manera que la inmunomancha puede verse comprometida. Por lo tanto, al probar un nuevo anticuerpo de superficie celular, puede ser prudente utilizar un método de dosis6 o termólisina5 para la cosecha para la comparación. La importancia de este protocolo es que ha sido rigurosamente probado, cuantificado y aplicado a aplicaciones tan diversas como ensayos para células madre clonogénicas1,9,10,11, para cultivos de masas en bioquímica8,para la clasificación FACS en el análisis de células madre3,4, para la biología molecular3,12, y para la secuenciación continua de ARN y ADN.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,4% Azul tripano 1x en solución salina al 0,9% | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M Tampón HEPES | Sigma | H0887 | magnética estéril |
| 1,5 pulgadas con anillo de pivote | Bel-Art, Wayne | 371101128 | en 2 oz Tarro Nalgene |
| 10 mL pipetas desechables | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL tubo cónico estéril | BD Falcon | ||
| matraz de cultivo de 150 cm2 (T-150) | Tapón de rosca Corning | 430825 | |
| 2 mL Micro Tubo Cónico | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Tarro Nalgene | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Solución de tripsina 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) matraz | de cultivo Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Botellas de almacenamiento: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm plato de cultivo estéril | Corning | 430165 | |
| pipetas desechables de 5 mL | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL tubo cónico estéril | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm de cultivo estéril plato | Corning | 430166 | |
| 70% etanol | |||
| 90 mm de diámetro Spectra Filtro Mesh, 74 µ m tamaño de poro | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| antibióticos (penicilina-estreptomicina) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Suero de ternero bovino (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Albúmina sérica bovina | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 Anticuerpo conjugado FITC | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alfa6-integrina, GOH3) PE anticuerpo conjugado | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µ m estéril | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Colágeno, Bovino, Tipo I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Contenedor de congelación celular económico para crioviales de 1 o 2 mL | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning Vial criogénico de polipropileno de 2 mL, autónomo con fondo redondo | Corning | 430659 | |
| dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| destilada Milli-Q | hecha dulce; agua de ósmosis inversa dos veces destilada | ||
| Dulbecco' Libre de solución salina tamponada con fosfato 1x, Ca2+ y Mg2+ | Technologies Gibco | 14190-144 | Medio de águila modificado estéril |
| de Dulbecco (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectina | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand Contenedor de muestras estériles de 4 onzas | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicina 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene "Mr. Frosty" Congelador | celular Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Frascos de boca ancha de lado recto Nalgene PC, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| Nº 22 hojas estériles de acero inoxidable BD | Bard-Parker | 371222 | |
| n.º 4 mangos de bisturí Instrumentos | Investigación Biomédica | 26-1200 | En un vaso con 70% de etanol |
| Un par de pinzas de vendaje ocular de curva completa | Militex | 18-784 | En un vaso con 70% de etanol |
| Un par de tijeras | Instrumentos | de investigación biomédica25-1050 | En un vaso con 70% de etanol |
| Un par de pinzas de vendaje para el pulgar | Militex | 6-4 | En un vaso con 70% de etanol |
| Oster Pro-Cord/Recortadora inalámbrica n.º 40 cuchilla | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Placa de Petri de plástico 100 mm x 20 mm estéril | Corning | 430167 | |
| Marca Pyrex Embudo de vidrio liso sin tallo | Corning | 6240-75 | |
| Rata IgG2akappa FITC anticuerpo de control de isotipo | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rata IgG2akappa PE anticuerpo de control de isotipo | BD Pharmingen 555844 | ||
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ y Mg2+ medio esencial mínimo libre para el cultivo en suspensión | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Placas de Petri cuadradas de plástico estéril | BD Falcon | 351112 | |
| Ratón suizo 3T3 fibroblastos | ATCC | CCL-92 | utilizado dentro de 10 pasajes |
| Triadina; Solución tópica de preparación de povidona yodada al 10%, 16 oz | Grupo Triad | 10-8216 | |
| VWR Placas de Petri de plástico, ahorrador de espacio estéril 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E | Medium Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Bolsa |
Referencias
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
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- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
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