Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.
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Artículo de método
Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores
En este artículo
Resumen
Resumen
Salida de leucocitos de tejidos periféricos a los ganglios linfáticos drenantes no sólo es fundamental para la vigilancia inmune e iniciación sino también contribuye a la resolución de las respuestas del tejido periférico. Mientras que una variedad de métodos se utilizan para cuantificar la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periféricos, los mecanismos celulares y moleculares que rigen la salida dependiente del contexto siguen siendo mal entendidos. Aquí, describimos el uso de photoconversion en situ para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos de piel murina y tumores. Photoconversion permite la directa etiquetado de leucocitos residente dentro del tejido cutáneo. Aunque la exposición a luz ultravioleta induce local las respuestas inflamatorias caracterizan por infiltrados de leucocitos y filtración vascular, en una comparación directa con aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, photoconversion específicamente etiquetado las poblaciones migratorias dendrítico de la célula y al mismo tiempo permitió la cuantificación de salida mieloide y linfoide de microambientes cutáneas y tumores. Los mecanismos de salida de leucocitos siguen siendo un componente faltante en nuestra comprensión de la complejidad de leucocito intratumoral, y así la aplicación de las herramientas descritas en este documento proporcionará una visión única en la dinámica de tumor inmunes microambientes ambos en constante estado y en respuesta a la terapia.
Introducción
Las respuestas inmunitarias de tejido periférico están conformadas no sólo por el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación, sino también por los mecanismos que regulan su retención posterior. Por lo tanto, inmunidad protectora es dictada por acumulativos mecanismos celulares y moleculares que determinan si entra a un leucocito, permanece dentro, o más bien emigra de tejido periférico vía los recipientes linfáticos. Lo importante es la propensión de leucocitos al tejido a través de vasos linfáticos (denominada salida) la salida está ligada a sus funciones especializadas. Las células dendríticas (DC) adquieran comportamiento migratorio en respuesta a seña....
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Protocolo
Animales todos los protocolos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Oregon Health & Science University.
1. inducción de la inflamación y FITC pintura del pabellón de oreja de ratón
- En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado (inducir en el isofluorane 3-5% y se mantiene a 1-3% isofluorane; tasa de flujo de oxígeno en 0.5-1.0 L/min). Asegurar adecuada anestesia mediante el control de la pérdida del reflejo pedal, movimientos involuntarios y la reducción de la frecuencia respiratoria.
- Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arrib....
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Resultados
Primero intentamos replicar los resultados photoconversion publicados en la literatura para evaluar la eficacia y determinar la inflamación asociada en la piel de ratón. El pabellón de la oreja fue expuesto a la luz 100 de mW violeta (405 nm) para 3 minutos como se ha descrito33. Solo suspensiones celulares generados a partir de la piel del oído o dLNs cervical inmediatamente después de la exposición revelaron una eficiencia de conversión del 78% de CD45 todos.......
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Discusión
Aunque la salida de leucocitos de los tejidos periféricos, no-linfoides es crítica para la iniciación y resolución de la respuesta inmune, los mecanismos moleculares que rigen la salida son poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento es en gran parte debido a la disponibilidad lista de herramientas para la cuantificación in vivo. Aquí, describimos el uso de ratones photoconvertible (Kaede-Tg) para cuantificar la salida de leucocitos endógena de la piel y tumores y proporcionar una comparación directa cara a c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen de revelar los conflictos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Dr. Marcus Bosenberg por prever líneas de melanoma murino YUMM 1.7 y 1.1 YUMM y Dr. Deborah J. Fowell proporcionando B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) ratones 15Utr acuerdo con RIKEN BRC a través de los Bio-recursos nacionales de MEXT, Japón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa D | Roche | 11088866001 | |
| DNasa | Roche | 4536282001 | |
| Fuente de luz Silver-LED-405B con fibra óptica y colomor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Isómero de isotiocianato de fluoresceína I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| ftalato de dibutilo | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetona | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| jeringas de calibre 29 | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 filtros de células mmm | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua reparable | Invitrogen | L34966 | |
| Antiratón purificado CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clon N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clon M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clon 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clon 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clon 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clon 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clon HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clon BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clon 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clon M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clon 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clon RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Albúmina sérica bovina (Fracción V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Conjunto de partículas de compensación de compensación de control negativo y anti-ratas y antihámster | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Citómetro de flujo | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
Referencias
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in l....
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Reimpresiones y permisos
