Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.
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Artículo de método
La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Métodos de inmunohistoquímica (IHC) para el análisis in situ de la expresión de la proteína por microscopia ligera son una poderosa herramienta de investigación y diagnóstico. Sin embargo, la visualización y cuantificación de antígenos múltiples en una sección de tejido solo usando IHC cromogénico convencional es un reto. Proyección de imagen de multiplexado es especialmente relevante en linfoma investigación y diagnóstico, donde los marcadores tienen que interpretarse en el contexto de un microambiente tumoral compleja. Aquí se describe un protocolo para IHC fluorescente multiplexado tinción para posibilitar la evaluación cuantitativa de múltiples objetivos en tipos celulares específicos de interés en el linfoma. El método cubre aspectos de validación de anticuerpo, anticuerpo optimización, la optimización multiplex con marcadores de subtipos de linfoma, la tinción de tejido microarrays (TMA) y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con específicas referencia a linfoma. Usando este método, partituras de la intensidad media de un marcador de interés y el porcentaje de positividad se generan para facilitar aún más el análisis cuantitativo. Multiplexación minimiza la utilización de la muestra y proporciona información espacial para cada marcador de interés.
Introducción
Neoplasias linfoides son causados por la incontrolada proliferación maligna de linfocitos. Estas células son componentes vitales del sistema inmune y localización a los órganos inmunes primarios y secundarios, como la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros sistema linfoide asociado a mucosa. Neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de trastornos que se clasifican basados en una constelación de características, incluyendo la morfología, immunophenotype, características genéticas y la presentación clínica. Mientras que cada parámetro desempeña un papel, sigue siendo una característica que define y constituye la base para el sistema de clasificación de la OM....
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Protocolo
Todos los tejidos utilizados en este protocolo se obtuvieron bajo el B Singapur NHG dominio específico de tablero de estudio 2014/00693.
1. selección y validación de los anticuerpos
Nota: Antes de proceder con el establecimiento de cualquier panel multiplexado, asegúrese de que todos los anticuerpos de la mancha enérgicamente, identificar sólo el antígeno blanco de interés. El objetivo es seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno de interés en las secciones de tejido.
- De un anticuerpo con un uso bien establecido de la investigación y uso clínico rutinario en IHC, confirmar las co....
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Resultados
MF-IHC imágenes una muestra de DLBCL con C-MYC y el cambio de gene de BCL2 (doble golpe linfoma) se muestran en la figura 1. La figura 2 ilustra las imágenes simuladas campo brillante de immunohistochemical. Figura 3 indica la generación de datos de porcentaje. Figura 4 muestra los detalles de una fórmula mediana para la generación de datos numéricos.
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Discusión
MF-IHC tiene el potencial para permitir que los patólogos perfeccionando diagnosticcriteria en patología linfoide y analizar el papel de los biomarcadores en tipos específicos de la célula hacia una predicción del resultado clínico. Como un nuevo método de investigación, mf-IHC se aplica cada vez más a la identificación cuantitativa y espacial de múltiples parámetros inmunes de las células de tumor17. La detección de mf-IHC de la coexpresión de marcadores biológicos de tumor ha demostrado ser repr.......
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Divulgaciones
A.D.J. ha recibido financiación de PerkinElmer hacia viajes para reuniones de grupos de usuario. Los autores no tienen ningún otro conflicto de interés divulgar.
Agradecimientos
S.-B.N. y A.D.J. son apoyados por el médicos investigación Consejo transición premios de Ministerio de salud Singapur nacionales (NMRC/TA/0020/2013 y NMRC/TA/0052/2016). Los autores reconocen una beca de investigación Yoon Yong Siew a A.D.J. de la Universidad Nacional cáncer Institute de Singapur hacia la compra de un microscopio de proyección de imagen espectral de Vectra. Este estudio es aprobado por el Singapur NHG dominio específico de Junta B (2014/00693).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Diluyente de anticuerpos | DAKO | REF S3022 | Solución bloqueante |
| peroxidasa | DAKO | S2023 | Para el bloqueo de peróxidos |
| Microscopio automatizado multiespectral | Vectra Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Absoluto de imagen espectral |
| Etanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Alcohol etílico para rehidratación |
| Diluyente de amplificación | PERKIN ELMER | FP1135 | Tampón diluyente de fluoróforo |
| Anti-Ratón IgG [Cabra] Marcado con HRP | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Anticuerpo secundario |
| Anti-Conejo IgG [Cabra] Marcado con HRP | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Anticuerpo secundario |
| BCL2 | DAKO | clon 124 ( Lote Nº 20031561) (RRID-AB578693) | anticuerpo primario |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564 (Lote No.6050438)(RRID-AB563429) | anticuerpo primario |
| CD20 | DAKO | Clon L26 (Lote No.20028627) (RRID-AB442055) | anticuerpo primario |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clon ab32072 (Lote NO. GR29511133)(RRID-AB731658) | anticuerpo primario |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Reactivo fluorescente adecuado a base de tiramida |
| Graphpad Prisma 7 | Bloc | Software estadístico | |
| HistoClear Agente de limpieza | SIGMA | H2779-1L | Histoclear para desparafinar y limpiar |
| inForm Advanced software de análisis de imágenes | Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Software de análisis de datos |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | anticuerpo primario |
| KOS MILESTONE procesador de tejidos multifuncional | Milestone | Microondas para la recuperación de epítopos inducida por calor | |
| Microondas | PANASONIC | NN-ST651M | Pelado por microondas |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 medios de | montaje |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Reactivo fluorescente adecuado a base de tiramida |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Reactivo fluorescente adecuado a base de tiramida |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Reactivo fluorescente adecuado a base de tiramida |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Tyramida adecuada reactivo fluorescente a base |
| de poli-L-lisina portaobjetos | recubierto FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Portaobjetos para la adhesión de secciones de tejido en uso histológico rutinario |
| Espectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | tinción de ácido nucleico |
| Solución de recuperación de objetivos, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | para HIER |
| Tris Buffer salino (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | para tampón lavado |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
Referencias
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. <....
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