Durante la infección, la Listeria monocytogenes es capaz de atravesar la barrera hemato - encefálica para colonizar el cerebro. En este protocolo, se demuestra cómo evaluar la colonización bacteriana de los órganos después de la infección de ratones. Se proporciona un procedimiento para realizar la perfusión de órganos enteros para determinación específica de números bacterianos en la parenquimia del cerebro.
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Artículo de método
Listeria monocytogenes Infección del cerebro
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Resumen
Resumen
Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano intracelular que se asocia frecuentemente a infecciones transmitidas por los alimentos. La capacidad de L. monocytogenes para cruzar la barrera blood - brain (BBB) es acerca de como puede llevar a la peligrosa meningitis y encefalitis. El BBB protege el microambiente de cerebro de varios metabolitos tóxicos y patógenos microbianos que se encuentran en la sangre después de la infección y por lo tanto apoya la homeostasis cerebral. Los mecanismos por el que L. monocytogenes presentes en el torrente sanguíneo cruzar el BBB para causar cerebro infecciones no son completamente entendidas y también hay una falta de un sistema robusto modelo para estudiar el cerebro de infecciones causadas por L. monocytogenes. Aquí, presentamos un modelo de infección del ratón simple para determinar si las bacterias han cruzado el BBB y para cuantificar la carga de bacterias que han colonizado el cerebro en vivo. En este método, por vía intravenosa estaban infectados con L. monocytogenes y animales fueron sacrificados humanitariamente por la exposición a CO2 seguido por dislocación cervical. La perfusión cardíaca de los animales fue realizada antes de la cosecha de órganos infectados. Se extrajo sangre antes de la perfusión y el número de bacterias por órgano o mL de sangre se determinó mediante diluciones de los homogenados en placas de agar sangre o el órgano de la galjanoplastia y contando el número de colonias formadas. Este método puede utilizarse para el estudio de las interacciones receptor-ligando novela que mejoran la infección del cerebro por L. monocytogenes y pueden ser fácilmente adaptado para el estudio de múltiples patógenos bacterianos.
Introducción
La bacteria gram-positiva Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo y uno de los patógenos más mortales transmitidas por los alimentos en todo el mundo. Ingestión de alimentos de L. monocytogenes contaminados puede provocar listeriosis en humanos, una enfermedad invasiva grave dirigidos a mujeres en su mayoría embarazadas, recién nacidos, los ancianos y immunocompromised los individuos1. L. monocytogenes es una de las principales causas de muerte por un patógeno transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos y tasas de mortalidad caso de listeriosis son tan altas como 20-30%, el más alto de todos los agentes patógenos transmitidos por los alimentos2. Actualmente no existe ninguna vacuna para L. monocytogenes y la capacidad de las bacterias efectivamente diseminado a órganos distales y el cerebro por cruzar la barrera blood - brain (BBB) puede conducir a meningitis potencialmente mortal y la colonización del cerebro3 , 4 , 5 , 6. la meningitis bacteriana es generalmente severa; mientras que la mayoría de las personas que reciben tratamiento se recupera, infecciones pueden causar complicaciones serias, por ejemplo, daño cerebral, pérdida de la audición o problemas de aprendizaje en los niños. L. monocytogenes se predice para tener en cuenta al menos el 10% de toda la comunidad adquirió meningitis en US7.
Una ruta importante para la diseminación bacteriana al cerebro y meninges es a través del torrente sanguíneo. Las bacterias circulando en los vasos sanguíneos en el cerebro son capaces de cruzar el BBB para causar infección en el cerebro. El BBB es un sistema altamente vascularizada de la barrera que protege el cerebro contra las partículas extrañas que circulan en la sangre. Las células endoteliales constituyen una capa que recubre la superficie interior de los vasos sanguíneos8,9. Además de L. monocytogenes, son capaces de colonizar varias bacterias patógenas como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliy Haemophilus influenzae tipo b (Hib) el cerebro atravesando la BBB3,4,5,6. Sin embargo, al examinar las cargas bacterianas en el cerebro de ratones infectados, es importante determinar que si las bacterias han cruzado el BBB, de lo contrario la carga bacteriana en el cerebro puede representar las bacterias que se encuentran todavía en los vasos sanguíneos del cerebro. Por lo tanto, es necesario inundar los ratones de toda la sangre antes de la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) de homogenados de cerebro.
En este estudio, describimos en vivo métodos para examinar infección de L. monocytogenes del cerebro. Para los métodos descritos aquí, se utilizó la cepa de L. monocytogenes 10403S. L. monocytogenes 10403S es una de las cepas de laboratorio más utilizados para el estudio de listeriosis sistémica en el modelo murino de infección10. Este protocolo se basa en la inyección intravenosa estándar de L. monocytogenes seguido de perfusión de los ratones. Un Resumen esquemático del protocolo infección en ratones se muestra en la figura 1. L. monocytogenes-cerebros infectados y otros órganos de los ratones sin perfusión o perfusión fueron recogidos y la carga bacteriana órgano determinado. Estos métodos son útiles para determinar no sólo la total colonización bacteriana del cerebro en los animales infectados, pero también son beneficiosos para determinar si las bacterias han penetrado el BBB en vivo para mediar una invasión del cerebro. Es importante destacar que este protocolo de laboratorio debe realizarse previa consulta con la gerencia de facilidad de animales y el Comité de bioseguridad institucional correspondiente.
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Protocolo
Todos los animales deben ser mantenidos y con máximo cuidado para minimizar el malestar durante el curso del procedimiento. El procedimiento debe llevarse a cabo en cumplimiento de la atención institucional de Animal y Comité de uso y todas las leyes federales, estatales y locales. También tenga en cuenta que los experimentos de laboratorio deben ser realizadas de conformidad con las directrices de nivel 2 de bioseguridad.
1. crecimiento de L. monocytogenes para estudios de infección del ratón
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Autoclave de 500 mL de medio de agar cerebro corazón infusión (BHI) en un matraz Erlenmeyer de 1 L para preparar placas de medios sólidos. Permitir que los medios de comunicación se enfríe en un baño de agua de 56 ° C y luego agregar estreptomicina en una concentración final de 100 μg/mL.
- Vierte 25 mL de medio de Petri en placas de Petri. Permita que las placas se sequen a temperatura ambiente (22 oC-25 º C). Si es necesario, se pueden secar las placas a 37 ° C hasta totalmente seco.
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Utilizando un asa de inoculación estéril y técnica aséptica, obtener un bucle completo de L. monocytogenes de congelado cepa 10403S11,12 a partir de un cultivo congelado en glicerol de los medios de comunicación más el 30% BHI y mantener en un congelador de-80 ° C.
- Racha de la L. monocytogenes en un BHI agar/estreptomicina que colonias de bacterias solo pueden ser aisladas de la placa. Coloque las placas en una incubadora de 37 ° C durante la noche (18 h a 24 h) para hacer crecer las colonias de L. monocytogenes .
- Utilizando un asa de inoculación estéril, escoger una sola Colonia de L. monocytogenes desde el agar BHI de la placa y sembrar la Colonia en un tubo estéril que contenga 5 mL de caldo BHI con estreptomicina μg/mL 100.
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Incubar el tubo de cultivo de L. monocytogenes ligeramente inclinado a 30 ° durante la noche en una incubadora de estática.
- Al día siguiente, inspeccione visualmente la cultura de L. monocytogenes para el crecimiento (los medios BHI será turbios) y vortex brevemente para asegurar una suspensión uniforme de la cultura.
- Asépticamente Remueva una alícuota de 1 mL de cultivo bacteriano y medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro.
Nota: Se utiliza caldo BHI estéril como el espacio en blanco para el espectrofotómetro de lectura antes de medir la densidad óptica de la cultura de L. monocytogenes . La cultura de L. monocytogenes puede también ser diluida (dos a cinco) en BHI antes de leer la densidad óptica. - Determinar el número de L. monocytogenes unidades formadoras de colonias (UFC) por mL de cultivo BHI por diluciones seriadas 10 veces de la cultura de la galjanoplastia. Esto es útil para establecer una relación entre la densidad óptica de la cultura de L. monocytogenes y el número de bacterias por mL de cultivo. En general, un OD600 de 1.0 para una cultura de L. monocytogenes es igual a aproximadamente 1 x 109 UFC de bacterias por mL.
2. preparación de L. monocytogenes para infección de ratones
- Dieciocho a veinticuatro horas antes de la infección del animal, crecen cultivos de L. monocytogenes en caldo BHI que contiene 100 estreptomicina μg/mL y determinar el OD600/ ~ UFC por mL como se indica en el paso 1.
Nota: Los ratones generalmente piden una semana antes de la infección y están aclimatados a la instalación de animales antes de la infección, los estudios se realizan. En este estudio, 6 – 8 semanas viejo hembra BALB/c ratones (5 por grupo) fueron alojados en un ambiente de barrera en las instalaciones de contención animal nivel BSL2 Harvard Medical School y suministran alimentos y agua ad libitum. - Determinar la cantidad de L. monocytogenes la cultura necesaria para infectar a cada ratón basado en el ~ UFC por mL de cultivo bacteriano. Realizar una dilución de la cultura de L. monocytogenes en estéril con tampón fosfato salino pH 7.2 (PBS) en la concentración adecuada de bacterias. Ratones se infectan generalmente por vía intravenosa con 200 μL de PBS con 1 – 2 × 104 UFC de bacterias animales.
- Verificar el número de L. monocytogenes en el inóculo por diluciones seriadas 10 veces en placas de BHI agar con 100 estreptomicina μg/mL de la galjanoplastia. Incubar las placas en una incubadora de 37 ° C durante la noche para determinar el número de L. monocytogenes inoculada por ratón como sigue:
Inóculo (UFC) = (número de colonias x factor de dilución) / mL plateado x volumen (mL) inyectado
3. infección de ratones con cola vena inyección intravenosa de L. monocytogenes a través de
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Retire los contenedores de tapa y la comida de la jaula con los ratones y colocar la jaula debajo de una lámpara de calor infrarrojo W 250 durante 5 minutos.
Nota: Este método permite que las venas de cola dilatar, asegurando que las inyecciones son más fáciles de realizar.- Con cuidado coloque el animal en un ratón de tamaño adecuado restringir el dispositivo para sujetar con seguridad el animal durante las inyecciones de vena de la cola.
- Mezclar el inóculo de L. monocytogenes (paso 2.2) y carga el inóculo en una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 26 G.
- Localizar una vena lateral de la cola del ratón y limpiar el sitio de la inyección con una almohadilla de alcohol o un spray de etanol 75%.
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Inyectar suavemente el ratón con 200 μL de la suspensión de L. monocytogenes en una vena lateral de la cola usando la jeringa con la aguja de 26 G.
- Usar gasa de algodón presionando brevemente en el sitio de inyección para detener cualquier sangrado y coloque el animal en una jaula nueva.
Nota: Realizar este proceso para todos los ratones a inyectar y marque la caja con etiquetas apropiadas. Para determinar la concentración después de la inyección del inóculo de L. monocytogenes , repita el paso 2.3 usando la cantidad restante de inóculo. La intravenosa inóculo de infección de L. monocytogenes por ratón se divulga la UFC promedio medido de las muestras antes y después de la inyección del inóculo.
- Usar gasa de algodón presionando brevemente en el sitio de inyección para detener cualquier sangrado y coloque el animal en una jaula nueva.
- Seguimiento diario de los animales infectados y observar signos manifiestos de enfermedad (por ejemplo, volantes de piel, postura jorobada, movimiento lento, pérdida de peso). Eliminar animales que parecen ser significativamente moribunda antes de la infección después de 72 h (p. ej., 24, 48 h post-infección) del estudio y sacrificio humano. Continuar seguimiento diario hasta que se sacrifican todos los animales restantes en infección después de 72 h.
Nota: La dosis letal (LD50) de 50% para la cepa de L. monocytogenes 10403S en ratones BALB/c es ~ 1-2 x 104 UFC/animal. Ratones infectados con dosis de LD50 de L. monocytogenes mediante este protocolo pueden exhibir signos de enfermedad, como se indicó anteriormente, y los investigadores podrían esperar los ratones para empezar a sucumbir a la infección después de la infección después de 72 h.
4. disección y perfusión cardíaca de ratones infectados con L. monocytogenes
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En la infección después de 72 h (o en un punto antes del tiempo deseado), eutanasia los ratones infectados con un protocolo aprobado por el Comité institucional de ética Animal, tales como CO2 asfixia seguida por dislocación cervical.
Nota: Si la recogida de sangre debe ser realizado, minimizar el rasgado de los vasos sanguíneos mientras se realiza la dislocación cervical.- Confirmar ratones han sido sacrificados por la ausencia de una respuesta de contracción de la pata.
Nota: Si la perfusión cardiaca debe ser realizado, establecer un sistema automatizado de la bomba/de la perfusión a una velocidad de flujo de volumen de 4 mL/min.
- Confirmar ratones han sido sacrificados por la ausencia de una respuesta de contracción de la pata.
- Coloque el animal en su espalda en una bandeja de disección y aplicar etanol del 75% sobre la superficie de la piel/piel abdominal.
- Con unas tijeras, hacer una incisión en la pared abdominal y ampliar la incisión justo por debajo de la caja torácica.
- Exponga el diafragma y los órganos viscerales.
Nota: Tenga cuidado de no lacerar cualquier órganos viscerales. - Abrir la cavidad torácica por el diafragma de corte y cortar la parrilla costal bilateral para exponer el ventrículo izquierdo del corazón.
- Con unas pinzas embotadas, agarrar con cuidado el corazón e insertar una aguja de mariposa 21 G conectado a un sistema de perfusión en el ventrículo izquierdo y luego con cuidado corta la aurícula derecha para recoger la sangre (~0.2 mL) en un tubo de 2 mL que contiene 10 mM etilendiaminotetracético ácido (EDTA) para evitar la coagulación. En la figura 2se muestra un diagrama esquemático de la perfusión cardiaca en el ratón.
Nota: Si la perfusión no debe ser realizado, sangre puede ser recogida por punción cardiaca utilizando una jeringa de 1 mL y rápidamente transferida a un tubo de 2 mL que contiene 10 mM EDTA para prevenir la coagulación. L. monocytogenes -infectado órganos entonces se cosechan como descrito (paso 5.1). - Iniciar la perfusión y perfusión del animal por 4 min con 15 – 20 mL de PBS con 10 mM EDTA.
Nota: Evaluar la perfusión mediante la observación de la sangre y la solución de PBS-EDTA que fluye a través de la aurícula derecha y en la bandeja de disección. El cerebro y el hígado aparece blanqueados después perfusión completa asegurando que las bacterias restantes son de los órganos cosechados y no la sangre circulante.
5. órganos y determinación de las cargas bacterianas
- Siguientes, cosecha órganos (p. ej., hígado, bazo) quitando cuidadosamente cualquier vasculatura y ligamentos unida y colocar los órganos por separado en un tubo cónico de 15 mL estéril que contiene 5 mL de estéril fría (4 ° C) PBS. Almacenar las muestras en hielo hasta que ocurra la transformación posterior.
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Para cosechar el cerebro, decapitar la cabeza detrás de las orejas con unas tijeras y cortar la piel del cuero cabelludo entre ojos del animal hacia abajo de la línea media. Si es necesario, recorte el exceso de tejido mantener las tijeras presionadas contra el cráneo.
- Suavemente inserte una punta de las tijeras en el foramen magnum (el agujero en la base del cráneo a través del cual pasa la médula espinal) y cortar lateralmente en el cráneo en ambos lados.
- Suavemente corte cráneo-entre ojos de roedor hacia abajo de la línea media, asegurándose de que se aplique una presión lateral. Evitar la perturbación del cerebro y mantener un contacto mínimo entre el tejido cerebral y las tijeras.
- Con unas pinzas de punta fina, abrir el cráneo para exponer el cerebro y una espátula entre la parte inferior del cerebro y la base del cráneo para extraer el cerebro.
Nota: Esto resulta en rotura de las fibras nerviosas de cerebro. - Transferir cuidadosamente el cerebro a un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de PBS estéril fría.
- Deseche el cadáver del ratón y repita estos pasos para el resto de los animales.
Nota: Una vez que todos los órganos han sido cosechados, limpie el área de procedimiento y preparar para que la homogeneización de órgano determinar la carga bacteriana.
- Limpiar y esterilizar la punta de un homogeneizador de tejidos colocado en una bioseguridad gabinete insertando la punta y ejecutando el homogeneizador para bleach 10 s secuencialmente en 5%, agua estéril, etanol del 75%, agua estéril cada contenido en un tubo cónico de 15 mL separadas.
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Homogeneizar el cerebro infectado (~ 20 s en posición 6, rpm máximas) en el tubo cónico de 15 mL hasta que no queden fragmentos de tejido visible.
- Limpia el homogeneizador como se describe en el paso 5.3 para prevenir bacterias llevan sobre contaminación a la muestra siguiente del órgano.
- Realizar el proceso de homogeneización de todos los otros órganos (p. ej., hígado, bazo).
- Una vez terminado el proceso de homogeneización, limpie el homogeneizador como se describe en paso 5.3 y almacenar hasta su uso posterior.
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Preparar diluciones seriadas 10 veces de los homogenados del órgano en PBS estéril y las diluciones en placas BHI agar/estreptomicina para determinar la UFC por órgano de la placa.
Nota: Un método similar se realiza para determinar la UFC por mL de sangre.- Después de todas las diluciones se platean, transferir las placas a una incubadora de 37 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, contar el número de colonias en cada placa para determinar el número total de bacterias por órgano o mL de sangre como sigue:
CFU/órgano = (número de colonias x factor de dilución) / mL de homogenado plateado x 5
UFC/mL de sangre = (número de colonias x factor de dilución) / mL de sangre plateado
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Resultados
El cerebro es altamente vascularizado y L. monocytogenes se sabe para infectar a los tipos de células presentes en la sangre3,13. El protocolo descrito se utiliza para demostrar la capacidad de L. monocytogenes para cruzar la barrera blood - brain (BBB) conduce a la infección del cerebro en ratones. Para determinar si las bacterias han cruzado el BBB en vivo, se realiza la perfusión de sangre en el ratón...
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Discusión
L. monocytogenes es capaz de causar meningoencefalitis mortales en seres humanos. Estudios previos han demostrado la capacidad de las bacterias para cruzar la barrera blood-brain (BBB) y para colonizar el cerebro. Se han propuesto tres vías de invasión del cerebro durante la infección: directa penetración del BBB por bacterias, stealth transporte por bacterias contenidas dentro de las células mononucleares3y la migración axonal por las cepas de L. monocytogenes causantes de rhomb...
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el servicio de salud pública de los Estados Unidos otorgar AI103806 de los institutos nacionales de salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cerebro Corazón Medios de infusión | Becton Dickinson | 237200 | |
| Sulfato de estreptomicina | Amresco | 0382-50G | |
| Placas de Petri | VWR | 25384-342 | |
| Glicerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Homogeneizador Básico | IKA | 3352109 | Modelo: T18BS1 |
| Espectrofotómetro | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| ratones BALB/c | Jackson Laboratory | Modelo #000651 | |
| Jeringas de 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | |
| agujas de 26 G | Becton Dickinson | 305115 | |
| agujas de mariposa de 21 g | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| Tubos cónicos de 15 mL | VWR | 21008-918 | |
| Tubos de ensayo de fondo redondo | VWR | 60819-546 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Corning | 46-013-CM | |
| Espátula de acero inoxidable | VWR | 82027-520 | |
| Tijeras de acero inoxidable (6,5 pulgadas) | VWR | 82027-592 | |
| Tijeras de acero inoxidable (4,5 pulgadas) | VWR | 82027-578 | |
| Pinzas romas de acero inoxidable (4,5 pulgadas) | VWR | 82027-440 | |
| Pinza de punta fina de acero inoxidable (6 pulgadas) | VWR | 82027-406 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
