Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.
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Artículo de método
Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.
Introducción
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular1. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica2 que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos3. Se ha propuesto clasificar estas polar....
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Protocolo
Se obtuvieron muestras de sangre humana (LRSC) de donantes sanos, anónima de EFS (servicio nacional de sangre francesa) como parte de un protocolo autorizado (CODECOH CC-2018-3114). Los donantes dieron consentimiento firmado para el uso de sangre.
1. los medios y preparación del tampón
- Preparar el medio de macrófagos [RPMI glutamax + 10 mM HEPES 1 x aminoácidos no esenciales (AANE)] y caliente a 37 ° C.
- Preparar el medio de macrófagos + 10% de suero humano de plasma AB (SAB), filtrarla (0.22 μm filtro), y luego calentarlo a 37 ° C (conocido como macrófago mediana + 10% SAB en adelante).
- Preparar el búfer de cla....
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Resultados
A partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por centrifugación diferencial, el protocolo permite la obtención de una población de CD14+ monocitos con una pureza cuota de más del 98% mediante citometría de flujo (figura 1). Estos monocitos se diferencian secundariamente hacia polarizaciones diferentes (figura 2). Cuando se elige un fraccionamiento en gel, la migración en geles de SDS-page se.......
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Discusión
Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)17, digestión en solución18 y asistido por el filtro muestra preparación
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
AM es financiado por el programa de líder del grupo de jóvenes (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le cáncer y la Fundación arco pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo de la espectrometría de masas para plataforma de Biología (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, París). Agradecemos a Lauren Anderson por su lectura del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Estación de trabajo de hipoxia | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Citómetro de flujo | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Ácido fórmico (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1.610.436 | |
| Lipopolisacárido, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| kit de limpieza 2D | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medio, suplemento glutamax | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (NEAA) 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Columna de aparatos Reverse C18 micro columna de centrifugado | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0,5 M, pH 8,0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 CAJA | |
| CD14 Microperlas humanas | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS columna de separación LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleucina 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleucina 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferón gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clon TÜ K4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Rotador de tubos | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Mezcla de tripsina/Lys-C | PROMEGA | V5073 | |
| Cóctel completo de inhibidores de proteasa mini sin EDTA | Roche | 11836170001 | |
| solución de gradiente de densidad ( Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Suero humano de plasma AB masculino humano (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| albúmina sérica bovina (BSA) 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glicerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Azul de bromofenol | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Bicarbonato de amonio | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrilo | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Ditiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Yodoacetamida | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Kit de ensayo | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL pipeta de plástico estéril | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 cartuchos de fase inversa, 100 mg | Waters | WAT036820 |
Referencias
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012). <....
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Reimpresiones y permisos
