Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Resumen

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Resumen

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.

Introducción

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular¹. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica² que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos³. Se ha propuesto clasificar estas polarizaciones utilizando la llamada dicotomía M1/M2, M1 representa pro-inflamatoria y M2 representa macrófagos antiinflamatorios. Este modelo se ajusta bien en diferentes situaciones patológicas como infecciones agudas, alergias y obesidad⁴. Sin embargo, en los tejidos crónicamente inflamados y cáncer, se ha demostrado que esta clasificación es incapaz de captar el amplio repertorio fenotípico que los macrófagos presentan en determinados ambientes celulares^{5,6, 7}. el consenso actual es que polarización macrófago se describe mejor usando un modelo multidimensional para integrar señales microambiental específicas⁸. Esta conclusión ha sido confirmada mediante análisis transcriptómico de macrófagos humanos que muestra que el modelo M1/M2 es ineficiente en la descripción de las polarizaciones obtuvo⁹.

El estudio presentado tiene como objetivo ofrecer un protocolo para obtener firmas de Proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Describimos cómo diferenciar los macrófagos humanos en entornos de varios niveles de oxígeno y obtener péptidos de proteoma todo macrófagos para llevar a cabo una cuantificación de etiqueta-libre. Esta cuantificación permite la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas. Como investigación en células madre ha puesto de manifiesto la importancia del oxígeno como un parámetro clave ambiental¹⁰, buscamos entender cómo este parámetro de tejido puede influir polarización de macrófagos en los seres humanos. La presión parcial de oxígeno se ha encontrado al rango de 3 a 20% (de la presión atmosférica total) en el cuerpo humano, donde el 20% corresponde aproximadamente a lo que comúnmente se utiliza en una incubadora de cultivo celular (el valor exacto es alrededor 18.6% mientras que la presencia de agua en cuenta).

Trabajo previo ha demostrado que difieren alveolar de macrófagos intersticiales de funcional y morfológico punto de vista¹¹ y estas diferencias son probablemente parcialmente debido a los niveles de oxígeno diferentes a los que están expuestos¹². Además, macrófagos derivados de médula ósea muestran una mayor capacidad que fagocitan bacterias cuando están expuestos a un bajo nivel de oxígeno medio ambiente¹². El efecto contrario se ha encontrado para macrófagos humanos THP1 distinguido¹³, pero estos resultados apoyan la idea de que el oxígeno es un regulador de la biología del macrófago y que es necesario aclarar esta función a nivel molecular en macrófagos humanos. En un estudio anterior, hemos aplicado un enfoque de la proteómica para tratar estos temas. Al medir los niveles de expresión de miles de proteínas al mismo tiempo, destacó el impacto del oxigeno sobre polarización y proporciona una lista de nuevos marcadores moleculares. También fuimos capaces de relacionar estos resultados para algunas funciones de los macrófagos. En particular, encontramos que la tasa de fagocitosis de células apoptóticas se incrementó en macrófagos IL4/IL13-polarizado, que estuvo vinculado a la regulación al alza de ALOX15 según lo revelado por el análisis proteómico del¹⁴. En el presente estudio, describimos cómo realizar tal análisis.

Protocolo

Se obtuvieron muestras de sangre humana (LRSC) de donantes sanos, anónima de EFS (servicio nacional de sangre francesa) como parte de un protocolo autorizado (CODECOH CC-2018-3114). Los donantes dieron consentimiento firmado para el uso de sangre.

1. los medios y preparación del tampón

1. Preparar el medio de macrófagos [RPMI glutamax + 10 mM HEPES 1 x aminoácidos no esenciales (AANE)] y caliente a 37 ° C.
2. Preparar el medio de macrófagos + 10% de suero humano de plasma AB (SAB), filtrarla (0.22 μm filtro), y luego calentarlo a 37 ° C (conocido como macrófago mediana + 10% SAB en adelante).
3. Preparar el búfer de clasificación [1 x de tampón fosfato salino (PBS) + 0,5% albúmina de suero bovino (BSA) + ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA)], filtrarla (0.22 μm filtro) y mantener a 4 ° C.

2. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la cámara de sistema Leukoreduction (LRSC)

1. Colocar 15 mL de solución de la separación de densidad gradiente de la célula (véase Tabla de materiales) en 50 mL tubo de centrifugación por lo que puede calentar a la temperatura ambiente (RT) antes de recibir la LRSC.
   Nota: La densidad depende de la temperatura. Como este producto se almacena a 4 ° C, este paso debe hacerse por adelantado por lo que puede equilibrar a RT.
2. Vacíe la LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mL, añadir hasta 50 mL de PBS 1 x y mezclar. Muy lentamente, añadir 25 mL de la mezcla preparada en el paso 2.2 sobre 15 mL de solución de densidad gradiente calentado durante el paso 2.1.
   Nota: Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso. La sangre debe agregarse a la solución del gradiente de densidad sin cualquier perturbación de esta fase.
3. Centrifugar los tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 g de x sin pausas.
   Nota: Al final de la centrifugación del gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son: los eritrocitos y los granulocitos formando los pellets, fase de solución gradiente de densidad, capa de PBMCs y plasma.
4. Con una pipeta, pasar por la fase de plasma sin lo aspiración y recoger la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mL. Añadir a 50 mL de 1 x PBS a las PBMCs como un paso de lavado y centrifugar durante 10 min a 300 x g.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL de medio de macrófagos.

3. etiquetado magnético y aislamiento de CD14 (monocitos) de las células⁺

1. Cuenta las PBMCs en una cámara Malassez. Retirar la cantidad de PBMCs necesarios para llevar a cabo el experimento (típicamente 100 a 300 x 10⁶ células), colóquelos en un tubo de centrifugación y centrifugar durante 10 min a 300 x g.
2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 80 μl de la solución de clasificación preparada en el paso 1.3 por 10⁷ PBMCs. agregar 20 μl de microesferas de CD14 por 10⁷ PBMCs. Mix bien e incubar por 15 min a 4 ° C en agitación constante.
3. Añadir 1 mL de buffer por 10⁷ PBMCs que clasifica como un paso de lavado y centrifugar 10 min a 300 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de buffer por 10⁸ PBMCs de clasificación.
4. Colocar una columna en el campo magnético del separador. Preparar la columna de lavado con 3 mL de buffer de ordenación.
5. Aplicar la suspensión de células en la columna. La columna depende del número de células para ser aislados (aquí, se utilizan columnas de LS de PBMCs de⁹ hasta 10). Recoger a través de flujo que contiene células sin etiqueta.
   Nota: A partir de este paso, todos los tubos (selecciones negativas y positivas) se mantienen para posterior comprobación de los diferentes pasos por citometría de flujo.
6. Lavar la columna con 3 x 3 mL de buffer de ordenación. Recoger las células pasando a través del mismo tubo de paso 3.12. Realizar pasos de lavado agregando buffer clasificación, tenga cuidado de no secar la columna. Colocar un tubo de colección en la columna y retire del separador.
7. Pipetear 5 mL de buffer de clasificación en la columna. Limpie inmediatamente las células magnéticamente etiquetado empujar firmemente el émbolo en la columna. Para aumentar la pureza de la CD14⁺ las células, la fracción eluída se ha enriquecido en una segunda columna.
8. Repita los pasos 3.4 a 3.7 con una nueva columna.

4. galjanoplastia de monocitos

1. Contar los monocitos en una cámara Malassez. Compruebe la pureza de la CD14⁺ de las células mediante citometría de flujo. Retirar la cantidad de monocitos es necesarios para el experimento y colocar en un tubo de centrifugación.
2. Centrifugar 10 min a 300 x g. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de monocitos en medio de los macrófagos. Las células de la placa y dejarlas asentarse por 50 min a 1 h. Aspire el medio y sustituirlo con medio macrófagos + 10% SAB + 25 ng/mL macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) para inducir la diferenciación.

5. polarización de los macrófagos en el día 6

1. Aspire el medio. Sustituirla por medio de macrófagos + 10% SAB con varios estímulos. Por ejemplo, agregar 10 ng/mL interferón gamma (INFγ) + 1 lipopolysaccharide ng/mL (LPS) para obtener polarización M1, o 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleucina 13 (IL13) polarización M2.
   Nota: La estimulación se puede realizar entre 24 y 48 h antes de proceder a otras pruebas.
2. Cosecha de células con una solución de desprendimiento o un raspador celular.

6. célula cultura en condiciones de poco oxígeno

1. A partir de paso 4, mantener los monocitos y macrófagos en un entorno controlado de oxígeno para realizar el análisis de la condición hipóxica. Utilizar una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células debajo de la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento.
   Nota: Cuando se trabaja bajo la presión de oxígeno baja, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado bajo la estación y esperar lo suficiente para obtener la correcta presión parcial en el líquido. Por ejemplo, 10 mL de PBS en una caja Petri de 60 mm requiere aproximadamente 2 horas para llegar a 25 mmHg para la presión de O₂ parciales a partir de la presión atmosférica (como hemos medido con un sensor de oxígeno óptico de fibra). En muchas estaciones hipóxicas o incubadoras, la presión del oxígeno se establece como un porcentaje de la presión atmosférica. Si las medidas exactas son necesarias, es mejor utilizar una estación que autoriza establecer directamente la presión de oxígeno en mmHg.

7. lisis y digestión en Gel (protocolo 1)

Nota: En esta y las siguientes secciones, se describen dos protocolos utilizados para obtener péptidos y realizar el análisis por LC-MS/MS. Protocolo 1 describe lisis celular y fraccionamiento en gel y digestión, y en el protocolo 2 describe lisis celular en solución seguido por digestión en solución y fraccionamiento utilizando un método de enfoque isoeléctrico.

1. Realizar la lisis celular en Tampón Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS, 37% de glicerol, 33.3% (v/v) β-mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,2% p/v]. El equivalente de proteína de 300.000 células para cada muestra en geles de acrilamida bis-Tris 4-12% de la carga.
2. Controlar la duración de la migración electroforética a cada muestra de proteínas se divida en gel 6 bandas como se ejemplifica en la figura 3.
3. Fije el gel con una solución fijadora (30% de etanol + ácido acético al 7.5% por 20 min), luego la solución de tinción (R-250 Coomassie blue por 45 min). La solución de extracción (etanol 30% + 7,5% acético hasta que aparecen bandas) antes de suprimir las bandas de proteínas con un bisturí limpio.
4. Trocear cada banda suprimida antes de la introducción de 500 tubos μl. Una superficie de vidrio limpio es garantía para evitar la contaminación con las queratinas (solución de SDS 5% en agua desionizada se puede utilizar para limpiar las superficies).
5. Lavar las rodajas de gel 3 veces en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio por 20 min a 37 ° C, seguido de un lavado en 25 mM bicarbonato de amonio y acetonitrilo (50% v/v). Deshidratar los pedazos de gel con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.
6. Incubar cada pieza de gel con 10 mM DTT (Ditiotreitol) de bicarbonato de amonio 25 mM por 45 min a 56 ° C (200 μL), seguida de Yodoacetamida 55 mM en 25 mM bicarbonato de amonio (200 μL) durante 35 min en la oscuridad a TA.
7. Dejar de alquilación, incubar cada pieza de gel con 200 μL de 10 mM TDT de bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 minutos a RT. Wash las piezas gel en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio, luego deshidratar con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.
8. Digerir las proteínas durante la noche a 37 ° C con mezcla de tripsina/Lys-C según las instrucciones del fabricante.
9. Extracto de los péptidos resultantes de pedazos de gel mediante la adición de 50 μL de 50% acetonitrilo para 15 minutos, luego 50 μL de ácido fórmico al 5% durante 15 min y finalmente, 50 μL del 100% de acetonitrilo para piscina a 15 minutos y secar cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y pérdida de muestra. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su análisis posterior.

8. proteína extracción y digestión en solución (protocolo 2)

1. Con 150 μL del tampón de lisis siguiente de realizar la lisis celular (2 x 10⁶ células):
   1. Urea de 7 M, tiourea de 2 M, 40 mM Tris y grietas del 4%, suplidas con los inhibidores de proteasa (mini completa, libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel).
2. Homogeneizar las soluciones por 30 min a temperatura ambiente con un termoagitador. Centrifugue a 13.800 x g por 20 min RT y conservar el sobrenadante.
3. Eliminar contaminantes con un kit de limpieza 2D:
   1. El kit contiene solución precipitante, solución precipitado Co, tampón de lavado y lavado aditivo.
   2. Añadir 300 μL de solución precipitante y mezclar bien. Incubar en hielo por 15 minutos añadir 300 μL de solución de co precipitado. Centrifugar los tubos (al menos) a 12.000 x g durante 5 minutos. Una pequeña pelotilla debe ser visible. Proceder rápidamente al siguiente paso para evitar resuspensión o dispersión de la pelotilla. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet.
   3. Centrifugar los tubos otra vez con la bisagra de la tapa y pellets hacia fuera para traer el líquido sobrante en la parte inferior del tubo. Un pulso breve es suficiente. No debería haber queda líquido visible en los tubos.
   4. Sin perturbar el pellet, agregar 40 μl de solución de co precipitado. Dejar que el tubo se sientan en hielo por 5 min, centrifugar durante 5 minutos, luego retire y deseche el lavado. Añada 25 μl de agua desionizada. Vortex cada tubo para s 5-10. El diábolo debe dispersar pero se disuelve en el agua.
   5. Añadir 1 mL de tampón de lavado (previamente enfriado durante al menos 1 h a-20 ° C) y 5 μl de aditivo de lavado. Vortex hasta que el pellet se dispersa completamente. Incubar los tubos a-20 ° C durante al menos 30 min vórtex por 20-30 s cada 10 minutos
      Nota: Los tubos pueden almacenarse a-20 ° C hasta 1 semana con degradación proteica mínima o modificación.
   6. Centrifugar los tubos (al menos) en 12.000 × g por 5 min con cuidado retire y descarte el sobrenadante. Una pelotilla blanca debe ser visible. Permiten la pelotilla a seca al aire durante no más de 5 minutos (si es demasiado seco, va a ser difícil que vuelva a suspender los pellets).
4. Resuspender el precipitado de proteína en 300 μL 8 M urea y 0.1 M de bicarbonato de amonio. Vortex fuertemente durante 1 minuto determinar la concentración de proteína usando un análisis colorimétrico.

9. en la solución digestión (protocolo 2)

1. Reducir los puentes disulfuro añadiendo 5.1 μl de una solución acuosa de 700 mM TDT (concentración final 12.5 mM) a las proteínas resuspendidas de paso 8.4 e incubar a 37 ° C por 30 min con un termoagitador. Alquilato residuos de cisteína mediante la adición de 20,3 μl de una solución acuosa de 700 mM Yodoacetamida (concentración final 40 mM) y se incuba a 25° C por 30 min en la oscuridad con un termoagitador.
2. Añadir 990 μl de bicarbonato de amonio de 0.1 M a la muestra. Añadir un volumen correspondiente de tripsina/Lys-C mix (enzima: sustrato proporción 1: 100 w/w). Incubar a 37° C durante la noche con un termoagitador.

10. limpiar el cartucho (protocolo 2)

1. Moje un cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de metanol. Limpie el cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de agua al 80% acetonitrilo HPLC-grado y descartar el flujo a través. Equilibre el cartucho con 4 columnas-volúmenes (4 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado y descartar el flujo a través.
2. Acidificar las muestras con 90 μl de ácido fórmico al 10% o agua a pH 2-3 (Compruebe el pH con un indicador de pH). Cargar las muestras acidificadas y recoger el flujo a través. Vuelva a cargar el paso (contiene los péptidos no conservado). Lavar el cartucho con columna-volumen 6 (6 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado.
3. Eluir péptidos del cartucho con volúmenes de columna 1 (1 mL) de agua de acetonitrilo HPLC-grado de acid/50% fórmico 0,1%. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Concentrar la muestra utilizando un concentrador de vacío (150 x g, vacío a 160 mBar).

11. fraccionamiento de la concentración isoeléctrica (protocolo 2)

Nota: Los péptidos son separados según sus puntos isoeléctricos usando un fraccionador de gel en una tira de 13 cm cubriendo un rango de pH de 3 a 10. Se utilizó el siguiente protocolo suministrado por el proveedor (resumido a continuación):

1. Preparar las siguientes soluciones: solución (600 μl de solución de glicerol, 60 μL de tampón de OFFGEL, 4,34 mL de agua ultrapura) y B (1,776 mL de solución) y 444 μl de agua ultrapura.
2. Armar las tiras IPG, marcos y electrodos según las instrucciones del fabricante.
3. Resuspender la muestra con 1,8 mL de solución B. agregar 40 μl de la solución B a cada pocillo. Carga 150 μL de muestra a cada pocillo.
4. Seleccionar el método por defecto para péptidos: OG12PE00 (método OFFGEL predeterminado para péptidos para uso con 3100 OFFGEL baja Res Kit marcos de pH 3-10, 12-bien. Espere a que este método ha sido completado (20 h). Recoger las fracciones en tubos debidamente etiquetados.

12. limpiar Harvard aparato columna C18 reversa Post-IEF (protocolo 2)

1. Añadir progresivamente unos μL en un tiempo de 1% TFA en agua desionizada a cada fracción para acidificar la muestra. Verifique con papel pH el pH es de 3 o menos.
2. Preparar las siguientes soluciones: solución 1 (5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 4,99 mL de agua ultrapura) y 2 (0, 5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 9,49 mL de agua ultrapura).
3. Humedezca previamente la columna spin con 150 μL de solución 1. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar la columna de vuelta con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.
4. Pasar la fracción a través de la columna. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.
5. Eluir la fracción con 50 μL de solución 1. Centrífuga de 90 s a 750 x g. Repita estos pasos una vez más.
6. Seco-fracción utilizando un concentrador de vacío (150 g de x, vacío 160 mBar) y almacenar a-80 ° C

13. Análisis de datos de proteómica y bioinformática¹⁸

1. Analizar los datos obtenidos por un nano-LC MS/MS masa espectrómetro usando software de cuantificación como MaxQuant (versión 1.5.2.8) y el motor de búsqueda de Andrómeda.
2. Establece tarifa falsa del descubrimiento (FDR) al 1% para proteínas y péptidos y un largo mínimo de 7 aminoácidos. Establecer la especificidad de la enzima como C-terminal Arg y Lys. Permite 2 divisiones perdidas en bonos de prolina. Seleccione carbamidomethylation de la cisteína como modificación fija y oxidación de la acetilación y la metionina de la proteína N-terminal como modificaciones variables.
3. Analizar los datos con el software de análisis estadístico. Realizar un análisis de enriquecimiento funcional usando el software FunRich (www.funrich.org/). Realizar un análisis de enriquecimiento ontología génica utilizando el software de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).

Resultados

A partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por centrifugación diferencial, el protocolo permite la obtención de una población de CD14⁺ monocitos con una pureza cuota de más del 98% mediante citometría de flujo (figura 1). Estos monocitos se diferencian secundariamente hacia polarizaciones diferentes (figura 2). Cuando se elige un fraccionamiento en gel, la migración en geles de SDS-page se...

Discusión

Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)¹⁷, digestión en solución¹⁸ y asistido por el filtro muestra preparación

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Estación de trabajo de hipoxia	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 Citómetro de flujo	BD	Accuri C6
Urea	Agilent Technologies	5188-6435
Ácido fórmico (FA)	ARISTAR	450122M
R-250 Coomassie blue	Biorad	1.610.436
Lipopolisacárido, E.Coli (LPS)	Calbiochem	437627
kit de limpieza 2D	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 medio, suplemento glutamax	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (NEAA) 100X	Gibco	11140-035
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X	Gibco	14190-094
Harvard Columna de aparatos Reverse C18 micro columna de centrifugado	Harvard Apparatus	74-4601
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Invitrogen	AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%	Life Technologies SAS	NP0321 CAJA
CD14 Microperlas humanas	Miltenyi Biotec	130-050-201
MACS columna de separación LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)	Miltenyi Biotec	130-096-485
Interleucina 4 (IL4)	Miltenyi Biotec	130-093-917
Interleucina 13 (IL13)	Miltenyi Biotec	130-112-410
Interferón gamma (INFγ)	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC (clon TÜ K4)	Miltenyi Biotec	130-080-701
MACSmix Rotador de tubos	Miltenyi Biotec	130-090-753
Ácido trifluoroacético (TFA)	Pierce	28904
Mezcla de tripsina/Lys-C	PROMEGA	V5073
Cóctel completo de inhibidores de proteasa mini sin EDTA	Roche	11836170001
solución de gradiente de densidad ( Histopaque 1077)	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax	Sigma Aldrich	A7089-100ML
Suero humano de plasma AB masculino humano (SAB)	Sigma Aldrich	H4522-100ML
albúmina sérica bovina (BSA) 30%	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma-base	Sigma Aldrich	T1503
Glicerol	Sigma Aldrich	49767
β-Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148
Azul de bromofenol	Sigma Aldrich	114405
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 20%	Sigma Aldrich	5030
Bicarbonato de amonio	Sigma Aldrich	9830
Acetonitrilo	Sigma Aldrich	34888
Ditiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Yodoacetamida	Sigma Aldrich	57670
Thiourea	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Micro BCA Kit de ensayo	ThermoFisher	23235
5 mL pipeta de plástico estéril	VWR	612-1685
Thermomixer C Eppendorf	VWR	460-0223
Sep-Pak tC18 cartuchos de fase inversa, 100 mg	Waters	WAT036820