Artículo de método

Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura

DOI:

10.3791/58748

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28 de noviembre de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe los protocolos para evaluar el efecto de proteínas fluorescentes en la agregación y toxicidad del polyglutamine mal plegadas ampliación para la evaluación rápida de una proteína fluorescente recién desacostumbrada en el contexto de reporteros fluorescentes.

Resumen

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Para la investigación de localización de la proteína y el tráfico usando proyección de imagen de células vivas, los investigadores a menudo dependen de su proteína de interés a un reportero fluorescente de fusión. La lista en constante evolución de proteínas fluorescentes genéticamente codificadas (FPs) presenta los usuarios varias alternativas cuando se trata de diseño de fusión fluorescente. Cada FP tiene propiedades ópticas y biofísicas específicas que pueden afectar a las propiedades bioquímicas, celulares y funcionales de las fusiones fluorescentes resultantes. Por ejemplo, varios FPs tienden a formar oligómeros no específicos que son susceptibles de obstaculizar la función de la pareja de fusión. Por desgracia, sólo unos cuantos métodos existen para probar el impacto de FPs en el comportamiento del reportero fluorescente. Aquí, describimos un método simple que permite la evaluación rápida del impacto de FPs mediante ensayos de toxicidad del polyglutamine (poliQ) en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Proteínas poliQ amplió la huntingtina se asocian con la aparición de la enfermedad de Huntington (HD), donde la huntingtina ampliada agrega en oligómeros tóxicos y cuerpos de inclusión. La agregación y la toxicidad de poliQ expansiones en la levadura son muy dependientes de las secuencias que flanquean la región de la poliQ, incluyendo la presencia de etiquetas fluorescentes, proporcionando así una plataforma experimental ideal para estudiar el impacto de FPs en el comportamiento de sus socio de la fusión.

Introducción

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Desde la caracterización inicial de la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria1, una amplia paleta de FPs genéticamente codificados han sido desarrollados, permitiendo que biólogos de la célula localizar y rastrear simultáneamente múltiples eventos/proteínas celulares en la vida de las células de2,3. FPs se derivan de múltiples organismos, de medusas y corales, por lo tanto, pantalla propiedades biofísicas específicas que desviar mucho más allá de su respectivo espectro fluorescente. Estas propiedades incluyen brillo, estabilidad lumínica y una tendencia a oligomerize entre otros2,4. Selección de FPs monomérica es un aspecto importante en la selección de una etiqueta conveniente diseñar un reportero fluorescente, con el fin de reducir al mínimo las interacciones inadecuadas y alteraciones de la función de socio de la fusión y maximizar la eficiencia de reportero para un dado el compartimiento celular4,5,6. Mientras que el GFP ha, con el tiempo, ha evolucionado para reducir al mínimo el efecto de la adición de la etiqueta fluorescente a la fusión socio5,7,8, como nuevas variantes FP realizan en comparación con GFP sigue siendo difícil de evaluar.

Existen pocos métodos para caracterizar el comportamiento de FPs. La mayoría de ellos involucran pruebas propiedades biofísicas de FPs usando aproximaciones bioquímicas, como la ultracentrifugación y gel filtración protocolos9,10,11,12. Estos métodos tienen la salvedad de utilizar FPs purificada en solución, que ofrece poca información sobre su comportamiento en las células intactas. El desarrollo de las ofertas de ensayo organizado retículo endoplásmico liso (OSER) una evaluación cuantificable de tendencia de FPs a oligomerize en la vida de las células13 por la prueba de la capacidad de FPs sobreexpresado para reorganizar los túbulos del retículo endoplásmico en OSER verticilos14. Esta técnica con éxito puede detectar cambios entre variantes monoméricas y oligoméricas de GFP y otros FPs. Sin embargo, se basa principalmente en la sobreexpresión en las células transfected transitorio, y la cuantificación y el análisis de la imagen pueden ser muy lentos a menos que la técnica es adoptada como una colección de datos y flujo de trabajo de análisis.

Para complementar estos enfoques, se estableció un ensayo que aprovecha el efecto de etiquetas fluorescentes sobre la toxicidad y agregación poliQ expansiones en levadura15,16. La expansión de la poliQ tramo con más de 36 repeticiones dentro del primer exón de la codificación del gene de que la proteína huntingtina (Htt) está asociada con la enfermedad de Huntington17,18. La expresión de ampliado Httex1 en los resultados de la levadura en una fuerte agregación de la proteína Htt mal plegada juntada a un defecto severo del crecimiento. Curiosamente, estos fenotipos están fuertemente influenciados por las secuencias que flanquean el tramo de la poliQ, incluyendo FPs15,16. Fue racionalizado que las diferentes propiedades de FPs pueden afectar diferencialmente poliQ toxicidad en levadura. De hecho, comparado con GFP como FPs, proteínas fluorescentes rojas y sus formas evolucionadas han demostrado una menor toxicidad y agregación16. Este manuscrito ofrece un protocolo detallado para evaluar el efecto de la próxima generación de FPs de toxicidad poliQ y agregación en la levadura. Este análisis permite un análisis rápido y potencialmente de alto contenido de variantes FP que pueden usarse en paralelo con anteriormente caracteriza técnicas para la caracterización óptima de nuevo FPs y pueden evaluación cómo realizar en comparación con GFP.

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Protocolo

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1. generación de nuevo fluorescencia etiquetada Httex1 reporteros para una expresión en la levadura

Nota: Esta sección ha sido modificada del Protocolo por Jiang et al. 16 y Albakri et al. 19.

  1. Diseño de cebadores para amplificar la secuencia de codificación de la proteína fluorescente o interés por PCR. El primer avance debe incluir una secuencia de líder para ayudar a la enzima de restricción durante la digestión (GATC), seguida por un sitio de restricción de SpeI (ACTAGT) y 20 bases de aguas abajo del ATG (excepto ATG) del gene de la proteína fluorescente de interés. La cartilla reversa debe incluir la secuencia de líder (GATC), seguida de un sitio de restricción SalI (GTCGAC) y el complemento reverso de 20 bases corriente arriba del codón de la secuencia FP (incluso parada).
  2. Utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.1, realizar la reacción de PCR utilizando un termociclador con los siguientes ajustes: calor hasta 95 ° C por 1 min y ciclo a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 2 min por kB del producto de PCR. Realizar ciclos de 18 es amplia.
  3. Ejecutar la reacción de PCR en un gel de agarosa (0,5% de acetato-Tris-EDTA). Se debe una única banda correspondiente al tamaño del producto esperado. Aislar el fragmento utilizando un kit de purificación de gel.
  4. El protocolo emplea un vector de Httex1 lleva 25 (no tóxico) y 72 (HD asociada, mostrando una fuerte agregación) repite poliQ. Digerir los fragmentos PCR y el vector con enzimas de restricción del SpeI y SalI por 3 h a 37 ° C.
  5. Purificar el vector digerido por correr en un gel de agarosa como en el paso 1.3.
  6. Purificar el fragmento PCR digerido con un kit de potabilización de la polimerización en cadena.
  7. Ligar el fragmento resultante de PCR digerido y p415 -GAL1-bandera-25 72QpolyQ plásmidos1 utilizando T4 ligasa (1 h a temperatura ambiente). Utilice una reacción de 10 μl (1 μl de enzima T4, 1 μl de tampón de X 10, 6 μl del fragmento PCR y 2 μl de vector).
  8. Transformar 2 μl de la reacción de la ligadura en 50 μl de Escherichia coli-células competentes e incubar en hielo durante 30 minutos. Entonces, choque térmico las células a 42 ° C por 30 s. Agregar 1 mL de medio de consecuencia SOC e incuban a 37 ° C por 1 h en una coctelera Boston. Placa de 200 μL de la reacción en una placa de agar LB con ampicilina μg/mL 100. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
  9. Seleccione tres colonias bacterianas individuales, cultivarlas durante la noche en 3 mL de LB caldo que contiene 100 ampicilina μg/mL a 37 ° C en un agitador y extraer el plásmido de ADN utilizando un kit de purificación de plásmidos.
  10. Compruebe el plásmido por digerir 500 ng de ADN mediante enzimas de restricción del SpeI y SalI por 1 h a 37 ° C y correr la reacción en un gel de agarosa (0,5% de acetato-Tris-EDTA). Debe haber dos bandas en los tamaños derecha de vector (~ 7 kb) y el inserto (el tamaño varía según el gen de interés). Luego, verifique el plásmido por secuenciación.
  11. Transformar la p415 -GAL1- plásmidos - poliQ FP debanderaen la cepa de levadura W303 siguiendo un protocolo de transformación estándar levadura2.

2. localización del ensayo

  1. Raya la levadura clones llevan 25Q/72Q etiquetadas con el FP de interés sobre una placa de agar que contiene medios de selección de levaduras (sintético completo-SC sin leucina) con glucosa como fuente de carbono. Al mismo tiempo, también raya 25Q/72Q-ymsfGFP para servir como control positivo.
    Nota: 25Q/72Q que no contengan una etiqueta fluorescente no son tóxicos y pueden servir como control negativo.
  2. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-3 días.
  3. Seleccione hasta tres colonias individuales de la placa.
  4. Inocular los 5 mL de SC suplementado con 2% de glucosa como fuente de carbono.
  5. Pellet en 200 μL de cada cultivo durante la noche y lavar 3 x con estéril de agua destilada.
  6. Resuspender las células en medios SC que contiene 2% galactosa como fuente de carbono para inducir la expresión de fusiones poliQ. Incubar la galactosa media noche a 30 ° C en un agitador de tubo. Como control, repita este paso mediante el uso de los medios de comunicación que contiene glucosa.
  7. A la mañana siguiente, igualar las densidades de célula a densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0.2 en 100 μl de medio SC en una placa de 96 pocillos estéril.
  8. Preparar cuatro cinco diluciones de cada muestra con agua estéril por pipetear 20 μl de la muestra de la anterior en 80 μl de medios de comunicación en el siguiente pozo.
  9. Utilice una levadura fijación herramienta para observar las células en las placas selectivas (que contengan glucosa o galactosa) e incubar a 30 ° C por 2 d.
  10. Imagen de las placas con un dispositivo de documentación de la imagen.

3. cuantificación del crecimiento celular en cultivo líquido

  1. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.
  2. Medir el OD600 usando un espectrofotómetro.
  3. Diluir las células a un OD600 de 0.1 en 300 μL de medios de comunicación en una placa de 96 pocillos.
  4. Ejecute cada muestra por triplicado.
  5. Incube la placa en una lector de placa/incubadora con capacidad de agitación. Establecer el número de muestras, la temperatura a 30 ° C, la absorbancia a 600 nm, la longitud de los experimentos a las 24 h y los intervalos de medición a 15 minutos y, a continuación, seleccione el modo de agitación continua.
  6. Crear la curva de crecimiento y cuantificar el área bajo la curva utilizando el software de gráfica científica. Se recomienda el GraphPad Prism 7. Pegar los datos en una tabla XY con tres valores de replicación. La curva de crecimiento se mostrará en la carpeta gráficos en el lado izquierdo. Para cuantificar el área bajo la curva, seleccione analizar en la parte superior izquierda y haz clic en el área bajo la curva en los análisis de XY.

4. fluorescente microscopia

  1. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.
  2. Diluir las células 10 x en crecimiento los medios de comunicación y la transferencia de 200 μL de cada muestra a cámaras imagen 8-bien.
  3. Imagen de las células utilizando un microscopio confocal, equipado con un objetivo Aprochromoat Plan X 63 (1.4 NA) a temperatura ambiente.
    Nota: El uso de un microscopio confocal es opcional. También se puede emplear un microscopio estándar de fluorescencia de amplio campo.
  4. Ajustar la potencia del agujero de alfiler y láser para la adquisición de imagen óptima. Puesto que los agregados 72Q son mucho más brillantes que la señal 25Q difusa, a menudo es necesario utilizar un valor de adquisición diferentes entre la plásmidos diferentes con el fin de evitar la saturación de la señal fluorescente.
  5. Procesar las imágenes mediante ImageJ20 u otro software de procesamiento de imágenes. En este paso, se desea el porcentaje de células que pantalla agregado puede calcularse manualmente.

5. dot Blot

Nota: En el presente Protocolo, blot dot se utiliza para examinar los niveles de expresión de la proteína. Preparar los cultivos celulares, siguientes pasos 2.1-2.5 del presente Protocolo.

  1. Generar proteína lisados con perlas de cristal en tampón de lisis (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% de glicerol, 1 mM Ditiotreitol [TDT]). Añadir inhibidores de la proteasa, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PSMF) y cóctel, directamente antes del uso del inhibidor de la proteasa. 5 mL del cultivo durante la noche de la pelotilla y resuspender en 200 μL de los granos de cristal y 200 μL de tampón de lisis. Agitarlos durante 30 s a 12 asaltos. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 10 min y recoger el sobrenadante.
  2. Punto una cantidad igual de proteínas totales en una membrana de nitrocelulosa con un aparato de microfiltración. Prewet la membrana con PBS y montar el aparato. Conectarse a una fuente de vacío y asegúrese de que los tornillos estén apretados. Encienda la aspiradora y deje que el filtro de la muestra a través de la membrana por gravedad.
  3. Bloquear la membrana en PBS - 0,05% Tween/5% leche descremada.
  4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario anti-FLAG toda la noche a 4 ° C. Se recomienda la M1 monoclonal de anti-FLAG.
  5. Lavar la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
  6. Incubar la membrana con un anticuerpo secundario fluorescente marcado (anti-mouse IgG) por 1 h a temperatura ambiente en PBS - 0,05% Tween/5% leche descremada.
  7. Lavar la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
  8. Imagen-mancha blanca /negra usando un sistema de documentación de immunoblot.

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Resultados

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FPs tienen diferentes propiedades biofísicas, incluyendo su tendencia a oligomerize, que pueden afectar el comportamiento de sus socios de la fusión en el contexto de reporteros fluorescentes. Este protocolo describe un método simple donde se pueden fusionar varios FPs a expansiones de tóxicos poliQ. Puesto que la toxicidad de la poliQ es altamente dependiente de las secuencias que flanquean el tramo poliQ15, este ensayo permite una comparación rápida y directa de ...

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Discusión

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En este artículo, se emplearon varios ensayos para medir la agregación de Httex1 poliQ expansiones y su efecto sobre el crecimiento de la levadura como modelo para estudiar cómo diferentes fluorescentes proteínas alteran sus contrapartes fusion en el contexto de reporteros fluorescentes . Usando una variante de la GFP (ymsfGFP) como control positivo, demostramos que este detecta cambios significativos en la agregación entre diferentes etiquetas fluorescentes y toxicidad de la poliQ y permite una comparación rá...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio es apoyado por una subvención de funcionamiento de los institutos canadienses de investigación en salud M.L.D. y P.L. El trabajo presentado aquí es apoyado por un premio John R. Evans líder fondo de la Fundación Canadiense para la innovación y un fondo de juego desde el fondo de la investigación de Ontario para P.L. Y.J. es apoyado por un MSc a beca de doctorado transferencia del Decano de la escuela de Schulich de M edición y odontología en la Universidad de Western Ontario. S.D.G. es apoyado por una beca de doctorado de Canadá ALS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-alfa E. coli competente (alta eficiencia)New Englanfd BiolabC2987
SpeI-HFNew Englanfd BiolabR3133prefieren las enzimas de alta fidelidad
SalI-HF NewEnglanfd BiolabR0138prefieren las enzimas de alta fidelidad
AgaroseFisher ScientificBP160
LB-AgarFisher ScientificBP1425
LB-CaldoFisher ScientificBP1426
AmpicilinaFisher ScientificBP1760
PfuUltra Alta Fidelidad ADN polimerasaAgilent Technologies600382
EPOCH2 espectrofotómetro de microplacas BioTekInstruments incEPOCH2TC
Replicador de pines de levaduraV& P Científico inc.
generador de imágenes SPIS& P Robótica inc.spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal con AryScanCarl Zeiss MicroscopíaLSM 800
8 pocillos Cámaras de imagen Lab-TekFisher Scientific12565470
Aparato Bio-DotBio-Rad1706545
Chemi Doc XRS+Bio-Rad1708265
anticuerpo anti-FLAG M1Sigma-AldrichF3040
Cabra anti-ratón IgG alexa 555 anticuerpo secundarioThermo A32727
Kit de minipreparación de plásmidosFisher ScientificK0503
Kit de extracción de gel de plásmidoFisher ScientificK0831
Kit de purificación de PCRFisher ScientificK0702
PrizmGraphPadN/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)Fisher ScientificBP13354
Se Se VP407AH

Referencias

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