Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

Ensayos de fagocitosis del macrófago se utilizan a menudo para el estudio de la función inmune innata. La respuesta inmunitaria innata puede indicar susceptibilidad a la infección. Líneas celulares de macrófagos son ampliamente utilizadas en estudios de Inmunología. Sin embargo, el paso extendido puede causar la pérdida de gene y compromete las funciones inmunológicas en estas líneas celulares. Así, los macrófagos peritoneales primarios son el objeto ideal para estudiar la función de células¹.

Aunque fue probablemente intacto en el cuerpo de la respuesta inmunitaria innata, la capacidad fagocítica puede disminuir con respecto a que en el más joven del cuerpo^2,3. Aquí le mostraremos un método para evaluar la fagocitosis de los macrófagos peritoneales de jóvenes (8 semanas de edad) y el ratón de edad (16-month-old) con expresión de EGFP e. coli, que es conveniente, rápida y económicamente factible.

El uso de una cepa de expresión de EGFP e. coli es una de las ventajas de este ensayo ya que estas bacterias son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte, incluso después de que los macrófagos son fijos por paraformaldehído al 4% (w/v). Además, mediante el uso de la expresión de EGFP e. coli, los investigadores no necesitan tinción más después de la fagocitosis, que ahorra tiempo. Además, los macrófagos son immunoresponsive para el antígeno de superficie de e. coli , lo que e. coli más adecuado para el ensayo de fagocitosis que el uso de la expresión de EGFP hongos o granos marcados con fluoresceína.

Con expresión de EGFP e. coli, un ensayo de fagocitosis puede ser fácilmente realizado en 2 h y medido por tanto flujo cytometry y fluorescencia microscopía, dependiendo del propósito del investigador. Puesto que este método mide directamente la capacidad fagocítica, los resultados son más reproducibles que otros métodos indirectos.

Este método ha sido validado también en una línea de 264.7 células y células de sangre periférica mononuclear⁴. El texto siguiente proporciona las instrucciones detalladas paso a paso para realizar este análisis y destaca los pasos críticos que los investigadores pueden modificar para satisfacer las necesidades de sus experimentos.

Todos los procedimientos fueron realizados en los institutos nacionales de salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los protocolos fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Dalian Universidad médica. Dieciséis meses de edad (con un peso de 30-35 g) y ocho semanas de edad se obtuvieron ratones de C57BL/6 (específicos del patógeno-libre) machos (20-25 g) SPF SPF animal del centro de la de la Universidad médica de Dalian. Todos los ratones se mantuvieron en el alojamiento de los animales con acceso a agua y alimento ad libitum. La temperatura se mantuvo a 20-24 ° C, humedad fue 40% - 70%, e iluminación era oscuro de 12 h luz/12 h. Los animales podían aclimatarse al ambiente por al menos 7 días antes del experimento.

1. construcción del plásmido pET-SUMO-EGFP y la inducción de la expresión de EGFP

1. Sintetizar el fragmento del gen EGFP (una secuencia bp 717 sintetizada por un servicio de síntesis genética personalizada, véase Tabla de materiales y archivo adicional 1 de la secuencia) y amplificar el fragmento con el (primer avance 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') y primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), con alta fidelidad Taq ADN polimerasa.
2. Para asegurar que los productos de la reacción en cadena (PCR) polimerasa tienen solo 3' adenina voladizos para la clonación de TA en el paso siguiente, utilice una extensión de 30 min a 72 ° C después del último ciclo (ver archivo adicional 1 para las condiciones PCR). Comprobar el producto PCR por electroforesis en gel de agarosa.
3. Clonar el producto PCR en el vector pET-SUMO (véase Tabla de materiales) usando el TA clonación método⁵ con T4 ADN ligasa. Incubar la reacción a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante 30 minutos. El vector es lineal entre los nucleótidos 653 y 654 con un 1 5 bp T-saliente en cada filamento.
4. Transformar el producto de la ligadura en la cepa químicamente competente de BL21(DE) e. coli como sigue: Añadir 5 μl (100 ng) del producto de PCR a 100 μl de células competentes BL21(DE) mediante choque térmico a 42 ° C por 90 s; mantener la mezcla en hielo durante 3 min. y luego, añadir 400 μL de medio de caldo (LB) Lisogenia precalentado a 37 ° C, agitándolo durante 1 h a 37 ° C y 120 rpm.
5. Inocular 100 μl de las bacterias sobre la superficie de una placa de LB-kanamicina (100 μg/mL) con la lactosa de inductor (0,5 mmol/L), rendimiento de la cepa de expresión de EGFP. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
   Nota: Si la EGFP se expresa correctamente, se observan algunas colonias como luz verde brillante en la oscuridad.
   1. Opcionalmente, seleccione colonias para verificar el fragmento insertado de EGFP por secuenciación de ADN. Los iniciadores para la secuenciación del ADN son: avance, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; reverso, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. Inocular una colonia positiva en 5 mL de medio LB con kanamicina μg/mL 100. Incubar en una incubadora de agitación a 120 rpm durante 2 h, 37 el ° C, añadir la lactosa inductor a una concentración final de 0,5 mmol/L y continuar a temblar durante 6 h, inducir la expresión de EGFP. Empíricamente, cuando temblores durante 6 h, la densidad óptica a 600 nm (OD600) puede llegar a 0.7 o superior.
7. Añadir 10 μl de medio de cultivo bacteriano en un portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos y examinar la expresión de EGFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Las bacterias expresan EGFP pueden almacenarse en el medio de a 2-8 ° C durante varias semanas.

2. primaria cultura y aislamiento de macrófagos peritoneales de ratón

1. Añadir a 100 mL de agua destilada y la mezcla a la esterilidad antes de su uso de autoclave 3,5 g de tioglicolato. Bombear el medio de cultivo tioglicolato en la jeringa estéril de 1 mL en la campana para la inyección peritoneal de ratón. Utilice un ratón por jeringa para evitar la infección. El uso de tioglicolato puede aumentar el número de macrófagos. Los macrófagos peritoneales residentes pueden ser aislados sin tioglicolato con bajo rendimientos de macrófago.
2. Anestesiar el ratón utilizando un método aprobado por la Comisión de uso y cuidado de los animales local. Inyectar 1 mL de medio de cultivo tioglicolato de 3,5% en la cavidad peritoneal del ratón con la jeringa de 1 mL, utilizando una aguja de 23 G.
   Nota: Mediante la inducción de la anestesia, la inyección peritoneal puede realizarse fácilmente y reduce el riesgo de lesiones a los órganos internos causados por la inyección.
3. Mantener el ratón con agua y alimento ad libitum durante 3 días. Controlar el cuerpo peso e ingesta de alimentos de los animales cada día. Si la pérdida de peso es superior al 10% dentro de 3 días, excluye el animal del experimento.
4. Después de 3 días, eutanasia el ratón mediante dislocación cervical después de la rápida inducción de anestesia por sevoflurane en una caja cerrada. Como alternativa, utilizar un método que ha sido aprobado por el Comité local de atención y uso animal a eutanasia el ratón.
5. Ponga el ratón en un plato (con un diámetro de 10 cm) con etanol al 75% para esterilizar y transferir rápidamente a la campana. Ponga el ratón sobre una placa y la pata delantera a la Junta para fijar la posición del ratón.
6. Utilizando una jeringa de 5 mL atada 20 G aguja, colocando el bisel de la aguja hacia arriba en un ángulo de 30° - 40°, inyecta solución salina 5 mL de frío (4-10 ° C) con tampón fosfato (PBS) en la parte inferior del abdomen en la cavidad peritoneal del ratón, evitando perforar el intestino. Si se pincha el intestino (o cualquier otro órgano), el ratón y sus células pueden ya no ser utilizados para experimentos, como esto puede activar las células que no son aptos para el cultivo celular primario.
7. Realizar un suave masaje en los dos lados del abdomen del ratón. A continuación, aspirar el líquido suavemente y lentamente. Dispensar el líquido peritoneal en un tubo de centrífuga de 50 mL. Repetir estos pasos 2 x o 3 x.
8. Centrifugar las células suspendidas durante 10 min a 400 x g en una centrífuga refrigerada (4-8 ° C). Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en Medio RPMI 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS). Contar las células. Empíricamente, la densidad celular es aproximadamente igual a 5 x 10⁶ células/mL cuando las células se resuspendió en 10 mL de medio.
9. Añadir 5 x 10⁶ células en cada pozo de una placa de 6 pozos para el análisis de citometría de flujo y 5 x 10⁵ células por pocillo en una placa de 24 pocillos para un microscopio de fluorescencia. La cultura las células a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ durante la noche. El medio de cultivo puede ser renovado después de 3 horas para eliminar las células nonadherent porque la mayoría de estos son los linfocitos. Las células adherentes son principalmente los macrófagos, y puede adherirse a tratados con cultura de tejido plástico.

3. ensayo de fagocitosis del macrófago usando el microscopio de fluorescencia

1. Observar las células bajo un microscopio de campo brillante para evaluar viabilidad celular y densidad celular.
2. Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Añadir 100 μl de medio de cultivo fresco y 10 μl de suspensión bacteriana (aproximadamente 2 x 10⁷ células) en cada pocillo como se describe en la tabla 1. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora.
3. Lave suavemente 3 x x-5 con 500 μl de PBS frío por pozo para lavar las bacterias noninternalized.
4. Incubar las células con formaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5. Lavar las células fijadas 3 x con PBS (500 μL/pocillo).
6. Añadir 200 μL de phalloidin 633 de la fluorescencia del tinte conjugados solución de trabajo (véase Tabla de materiales) a la F-actina de la mancha. Almacén en un lugar oscuro y húmedo (60% - 80%) a temperatura ambiente durante 60 minutos lavar las células 3 x con PBS (500 μL/pocillo) para eliminar cualquier exceso phalloidin. Por la coloración de la F-actina, el citoplasma puede ser descrito y ayudan a distinguir las bacterias internalizadas.
7. Añadir 200 μL de solución de trabajo de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (1 μg/mL) Mancha el núcleo de las células e incubar por 5 min en un lugar oscuro y húmedo a temperatura ambiente. Enjuague 1 x con PBS (500 μL/pocillo) y 1 x con el mismo volumen de agua destilada. Luego, las células estarán listas para observación bajo un microscopio de fluorescencia invertido.

4. ensayo de fagocitosis macrófago mediante citometría de flujo

1. Para minimizar los errores experimentales y hacer una adecuada interpretación de los resultados, establecer los grupos y tubos para el experimento de control como se indica en la tabla 2.
   1. Para el grupo control, que se colocará en el hielo (grupo 4 en el cuadro 2), retire el medio de la placa de 6 pozos y lavar 1 x con PBS. Luego, añadir 1 mL de EDTA frío 70 m m en el pozo para separar las células y transferirlos al tubo de citometría de flujo. Añadir 50 μl de suspensión bacteriana en el tubo y coloque en hielo durante 1 hora.
   2. Para los otros grupos, eliminar el medio de cultivo. Añadir 1 mL de medio fresco en cada pozo. Añadir 50 μl de suspensión bacteriana en los pozos de acuerdo con la configuración de grupo, como se describe en la tabla 2. Luego, coloque la placa de 6 pozos en los 37 ° C, 5% CO₂ incubadora de 1 h.
2. Para calmar la fluorescencia de noninternalized e. coli, añadir 200 μL de solución de agua de cristal violeta (CV) de 0,8% en el pozo y se mecen poco, evitando un resultado falso positivo por el atascamiento de EGFP expresar e. coli a la superficie de la los macrófagos pero no internalizado. Lavar las células 3 x con PBS para quitar cualquier CV residual.
3. Luego, añadir 1 mL de EDTA frío 70 m m en el pozo para separar las células y transferirlos al tubo de citometría de flujo.
4. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
5. Añada 100 μl de PBS para resuspender las células. Añadir 5 μl del anticuerpo F4/80-PE-conjugado (un antígeno de superficie expresado en macrófagos de ratón) en los tubos o isotipo IgG2a PE de uso, según la configuración de grupo. Brevemente Vortex e incubar las muestras en hielo durante 5-10 min en la oscuridad.
6. Añadir 1 mL de PBS a cada tubo y centrifugar a 400 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular con 200-300 μL de PBS para el análisis de citometría de flujo. Ejecutar cada tubo y adquirir datos para al menos 10.000 eventos de células F4/80⁺ .

El vector pET-SUMO utiliza un pequeño modificador de ubiquitina-como para permitir la expresión de proteínas nativas en la e. coli. Fusión de SUMO puede mejorar considerablemente la solubilidad EGFP, lo que le permite ser detectado fácilmente. Si la expresión de EGFP con éxito es inducida por lactosa, se observan colonias verdes en la oscuridad (figura 1A). Puntos verdes, que representan la expresión de EGFP e. coli, se observan bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 40 x (figura 1B).

Análisis de la microscopia muestran imágenes de fluorescencia (figura 1) de los macrófagos peritoneales de los grupos de jóvenes y mayores. Figura 1 muestra la fluorescencia roja de la F-actina, la fluorescencia verde de EGFP expresar e. coli, la fluorescencia azul de tinción nuclear DAPI y la imagen combinada de los tres canales de fluorescencia. Los ratones de 16 meses de edad, que fueron mirados como los ratones envejecidos, fueron el equivalentes de 60 a 65 años de edad los seres humanos. Estas imágenes sugieren que los macrófagos de ratones jóvenes presentan una mayor capacidad de fagocitosis que los de los ratones envejecidos.

Citometría de flujo (figura 2) se utilizó para cuantificar y comparar la fagocitosis de macrófagos del grupo joven y envejecida. Figura 2A muestra un análisis de citometría de flujo representativo de los jóvenes, ancianos y grupos de control. El anticuerpo F4/80-PE se utilizó para identificar y bloquear los macrófagos, y las señales positivas de EGFP indican los macrófagos que fagocitados e. coli. La proporción de células EGFP+ y F4/80+ indican la capacidad fagocítica de los macrófagos. El resultado (figura 2B) del grupo de jóvenes fue de 62,7% ± 5,1% (media ± SEM), que fue significativamente mayor que el 35,2% ± 2.9% (media ± SEM) del grupo de edad. Estos resultados son consistentes con la tendencia de los resultados de la microscopia de fluorescencia.

Figura 1 : Expresión de EGFP E. coli y su fagocitosis por los macrófagos. (A) expresión de EGFP e. coli colonias. El plásmido pET-SUMO-EGFP se transformó en células BL21(DE); las bacterias fueron inoculadas en una placa de LB-kanamicina (100 μg/mL). Una capa de 0,5 lactosa mmol/L en la superficie de la placa LB se utilizó como inductor, produciendo la expresión de EGFP. Si la EGFP se expresa correctamente, se observan colonias verdes amarillentas con UV luz en la oscuridad. (B) la microscopía de fluorescencia de EGFP expresar e. coli. La señal verde representa expresión de EGFP e. coli. Barra de escala = 50 μm. (C) imágenes multicanal de la fluorescencia de los macrófagos que se phagocytosing la e. coli. Las células se incubaron con expresión de EGFP e. coli (verde) por 1 h, seguido de un lavado con PBS, fijación con paraformaldehído al 4% y la coloración para la F-actina con solución de trabajo conjugado phalloidin 633 (rojo) y DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Resultados de la citometría de flujo. (A) análisis de citometría de flujo representativo de los jóvenes, ancianos y grupos de control. Los macrófagos peritoneales fueron manchados con F4/80-PE después de acoplamiento con expresión de EGFP e. coli. F4/80+ y células EGFP+ eran raras en la negativa control y control (grupo 4: Grupo joven en el hielo) grupos. Las parcelas de citometría de flujo joven y envejecida representan grupos 5 y 6, respectivamente. (B) los resultados de los análisis de citometría de flujo de los grupos de jóvenes y mayores. Una prueba de Mann-Whitney fue utilizada para examinar la diferencia entre estos dos grupos. La proporción de F4/80+ y células EGFP+ en el grupo de jóvenes fue significativamente mayor que en el grupo de edad (*P < 0.05). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: configuración para microscopía de fluorescencia del grupo. Dos grupos, el grupo de edad (16-month-old C57BL/6, n = 3) y el grupo de jóvenes (8 semanas de edad C57BL/6, n = 3), se utiliza para preparar los macrófagos peritoneales. Los macrófagos peritoneales de cada ratón se añadieron para separar pozos. Se añadieron aproximadamente 2 x 105 células en un volumen de 100 μl a cada pocillo; Luego, se añadieron aproximadamente 2 x 107 expresión de EGFP e. coli las células en un volumen de 10 μl a cada pozo y coincubated por 1 h a 37 ° C.

Tabla 2: configuración para citometría de flujo del grupo. El primarios macrófagos peritoneales de los ratones jóvenes y mayores se fijaron como seis grupos. Grupo 1 fue fijado como control de isotipo; grupos 2 y 3 se establecen como único control positivo para el canal PE o EGFP, respectivamente. Para asegurar que la fluorescencia internalizada es específica de la fagocitosis, el grupo 4 se incubó en hielo. La fagocitosis se detiene en el hielo debido a la baja temperatura. El tiempo de incubación fue de 1 h para todos los grupos.

Los autores no tienen nada que revelar.