Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.
Artículo de método
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Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.
Este manuscrito describe un método simple y reproducible para realizar un ensayo de fagocitosis. La primera parte de este método implica la construcción de un vector pET-SUMO-EGFP (SUMO = pequeño ubiquitin-like modifier) y expresión de la proteína de fluorescencia verde (EGFP) en Escherichia coli (BL21DE). Expresión de EGFP e. coli es coincubated con los macrófagos por 1 h a 37 ° C; el grupo control negativo se incuba en hielo para la misma cantidad de tiempo. Entonces, los macrófagos están listos para la evaluación. Las ventajas de esta técnica incluyen sus pasos sencillo y fagocitosis puede ser medida por ambos microscopio de flujo citómetro y fluorescencia. La expresión de EGFP e. coli son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte incluso después de que los macrófagos son fijados con paraformaldehido. Este método no sólo es adecuado para la evaluación de las líneas celulares de macrófagos o macrófagos primarios en vitro pero también conveniente para la evaluación de la fagocitosis de granulocitos y monocitos en células mononucleares de sangre periférica. Los resultados muestran que la capacidad fagocitaria de los macrófagos peritoneales de ratones jóvenes (ocho semanas de edad) es mayor que la de los macrófagos de ratones (16 meses de edad) años de edad. En Resumen, este método mide la fagocitosis de macrófagos y es conveniente para estudiar la función del sistema inmune innato.
Ensayos de fagocitosis del macrófago se utilizan a menudo para el estudio de la función inmune innata. La respuesta inmunitaria innata puede indicar susceptibilidad a la infección. Líneas celulares de macrófagos son ampliamente utilizadas en estudios de Inmunología. Sin embargo, el paso extendido puede causar la pérdida de gene y compromete las funciones inmunológicas en estas líneas celulares. Así, los macrófagos peritoneales primarios son el objeto ideal para estudiar la función de células1.
Aunque fue probablemente intacto en el cuerpo de la respuesta inmunitaria innata, la capacidad fagocítica puede disminuir con....
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Todos los procedimientos fueron realizados en los institutos nacionales de salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los protocolos fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Dalian Universidad médica. Dieciséis meses de edad (con un peso de 30-35 g) y ocho semanas de edad se obtuvieron ratones de C57BL/6 (específicos del patógeno-libre) machos (20-25 g) SPF SPF animal del centro de la de la Universidad médica de Dalian. Todos los ratones se mantuvieron en el alojamiento de los animales con acceso a agua y alimento ad libitum. La temperatura se mantuvo a 20-24 ° C, humedad fue 40% - 70%, e iluminación era oscuro de 12 h ....
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El vector pET-SUMO utiliza un pequeño modificador de ubiquitina-como para permitir la expresión de proteínas nativas en la e. coli. Fusión de SUMO puede mejorar considerablemente la solubilidad EGFP, lo que le permite ser detectado fácilmente. Si la expresión de EGFP con éxito es inducida por lactosa, se observan colonias verdes en la oscuridad (figura 1A). Puntos verdes, que representan la expresión de EGFP e. coli, se observan bajo un micr.......
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Los pasos de este protocolo están muy simple y sencilla. Uno de los pasos críticos es inducir la expresión de EGFP en e. coli. Generalmente, cuando un gen de eucariotes, como EGFP, está previsto expresar en procariotes como la e. coli, existe el riesgo de que la proteína forma agregados inactivos (cuerpos de inclusión), que cambia la estructura nativa de la proteína y la actividad. Utilizando el vector pET-SUMO y construyendo el plásmido pET-SUMO-EGFP, la proteína de la fusión de EGFP-SUMO expresado con.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
La Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31800046) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Liaoning (Nº 20170540262) apoyan este trabajo. Este trabajo fue realizado en los laboratorios del centro de investigación científica en el segundo Hospital de Dalian Medical University. Los autores desean agradecer a Xiao-Lin Sang su asistencia con la citometría de flujo y Bo Qu y Dong Chuan Yang por su asistencia en la producción de vídeo.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II Citómetro de flujo | BD Biosciences-Biotina | ||
| anti-ratón CD16/32 Anticuerpo | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Sistema de expresión de proteínas | Invitrogen | K300-01 | |
| Servicio de síntesis génica personalizado Takara | Biotech. | - | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) | Anticuerpo | D1306 | |
| F4/80-PE para FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Microscopio invertido | Leica | Microsystems-PE | |
| Rat IgG2a, κ-control de isotipo | Biolegend | Cat400507 | |
| Solución de trabajo conjugada con colorante de fluorescencia de faloidina 633 | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Medio de tioglicolato | Sigma-Aldrich | T9032 |
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