Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.
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Artículo de método
Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing
En este artículo
Resumen
Resumen
VIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de "choque y muerte" se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.
Introducción
A pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5' promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir la producción de virus in vitro y en vivo de latente infectados descanso CD4 + T células4,5,6,7 ,8. Entre las LRAs probado, HDACi (inhibidores de la HDAC) y apuesta bromodominios inhibidores (BETis) inducen la decondensation de la cromatina y la liberación de la transcripción positivo alargamiento factor b (P-TEFb) respectivamente, dando lugar a posteriores aliviar de la transcripcional represión en el LTR 5' y la activación del VIH expresión9,10,11,12,13. Sin embargo, la magnitud de reactivación alcanzada por estos LRAs fue limitada como sólo un modesto aumento en células asociadas unspliced VIH mRNA (RNA), indicativo de la transcripción viral, observó ex vivo14,15. Importante, estos LRAs también no pudieron inducir una reducción en la frecuencia de las células infectadas latente.
Expresión de VIH puede ser más restringido por empalme ineficiente16 así como defectos en la exportación nuclear de multiplicar empalmado HIV RNA (RNA MS)17. Así, se necesitan identificables nuevas clases de LRAs que son más potentes y pueden afectar distintos aspectos de la integración después de la producción de virus. Además, se requiere el desarrollo de nuevos ensayos que ayudan a definir los compuestos óptimos para invertir eficientemente latencia.
Aquí, se presenta un protocolo, que utiliza un enfoque de alto rendimiento para la evaluación funcional del impacto de intervenciones basadas en LTR del VIH transcripción y splicing. En Resumen, un nuevo dual basada en LTR color reportero sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figura 1) se utiliza para evaluar reactivación de VIH mediante citometría de flujo. En este reportero fluorescente, la expresión de mRNA de VIH unspliced (4 kb) conduce a la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), mientras que la expresión de mRNA empalmado (2 kb) daría lugar a la expresión de la proteína fluorescente Discosoma SP rojo (DsRed). Brevemente, hemos utilizado una proteína fluorescente de fusión Env-EGFP, gp140unc. EGFP, donde la secuencia de codificación de EGFP fue colocada en el marco de forma truncada y no hendida de la envoltura (Env). Cambios fueron introducidos para ablar del sitio de la hendidura evitando la disociación de la Env gp120 y gp41-EGFP y truncar la proteína gp160 antes el dominio de la transmembrana creando un análogo soluble de la Env, que facilita el plegamiento correcto y expresión de EGFP. A la expresión dentro de una célula, Rev se localiza en el núcleo donde interviene en la exportación nuclear-citoplásmico de la env de 4 kb mRNA mediante la interacción con el elemento de respuesta rev (RRE). El truncamiento de la Env no comprometiera RRE, que se encuentra entre gp120 y gp41 y el A7 3' sitio del empalme. En este sistema, que empalma en el VIH-1 empalme donante 4 (SD4) y el empalme aceptador 7 (SA7) resultados en la producción de 2 kb mRNA que codifican una proteína Rev no funcional truncada en el aminoácido 38 unida a proteína fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed fue insertado en el exón 2nd de Rev en el aminoácido 38 por superposición extensión18. Para facilitar la exportación nuclear de mRNA unspliced, un vector de expresión mamífero codificación Rev (pCMV-RevNL4.3) fue co transfectado con el constructo de reportero fluorescente (figura 2). Esta construcción única reportera aquí descrita es útil en la evaluación de alto rendimiento de la transcripción del VIH y empalme, sin necesidad de usar vectores virales.
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Protocolo
Nota: Procedimientos de clonación, transformación y la secuencia son discutidas en otra parte18,19. Los protocolos aquí a partir de la transfección de los vectores de expresión mamíferos (figura 3).
1. construcción de transfección de células HEK293T con la reportera de Color Dual
- Cultivar células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Después de descongelar, los experimentos de células HEK293T de paso 2 - 3 veces antes de usarlos en la transfección. Esto le daría el tiempo de las células para recuperarse del procedimiento de descongelación.
PRECAUCIÓN: Contaminación por micoplasma de cultivos celulares sigue siendo un grave problema. Buenas prácticas de laboratorio y la prueba rutinaria de cultivos celulares son esenciales para disminuir el riesgo de contaminación por micoplasma y evitar difusión20. - Dividir las celdas 1:2 un día antes de sembrar y transferirlas en medio DMEM fresco. Cultivar las células durante 24 h en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
- El día antes de la transfección, quitarlo del medio del frasco de aspiración y lavar las células con tampón fosfato (DPBS) solución salina de Dulbecco libre de calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg2 +) para eliminar los restos de suero.
- Dispensar 5 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) en el recipiente de la cultura y colocar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 2 a 5 min.
- Cuando las células son separadas, añadir 5 mL de DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS para inhibir aún más la actividad de tripsina, que puede dañar las células.
- Resuspender suavemente transfiriendo la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.
- Diluir las células 1:10 en tinción de azul de tripán (0.4%).
- Contar las células vivas que no toman trypan azules usando un microscopio (objetivo de 10 x) y una hematimetría.
- Calcular el número de células viables por mililitro tomando el promedio de lo recuento de células y multiplicando por 10.000 y por el factor de dilución (1:10) desde el trypan blue stain.
- Placa de 2 x 104 células en 100 μL de medio DMEM suplementado con 10% de SBF sin antibióticos en una placa de 96 pozos de fondo plano para 24 h.
- Para cada bien, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 y 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera ADN en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente. Para los experimentos sin Tat, use un vacío emparejado Tat vector pcDNA3.1 (-).
Nota: Se recomienda el uso de ADN libre de endotoxinas. Por eso, preparar ADN libre de endotoxina mediante un kit de purificación de ácidos nucleicos midi o maxiprep. Determine la pureza de ADN midiendo la relación 260/280 de OD, que debe estar entre 1.7 y 1.9. - Mezclar el reactivo de lípidos antes de su uso, luego diluir 0.65 μL en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Combinar el ADN diluido con el reactivo de lípidos diluidos.
- Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. La solución puede aparecer turbia.
Nota: Proceda al paso 1.15. dentro de 30 minutos. - Dispensar 100 μL por pocillo de los complejos de ADN reactivo lipídico mediante goteo sobre las células.
- Mezclar suavemente, meciendo la placa hacia adelante y hacia atrás.
-
Incube la placa durante 5 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.
- Cada mezcla de reacción es suficiente para la transfección de un solo bien (96 pocillos). Ajustar la cantidad y volumen de los componentes según el número de fármacos y la combinación que sería probado y cuentas para variaciones de pipeteo. Todas las condiciones se prueban generalmente en triplicado.
- Transfectar pozos adicionales con 100 ng de plásmido EGFP y DsRed-Express ADN CMV-conducido por compensación.
2. tratamiento de HEK293T Transfected las células con latencia agentes de inversión
Nota: Antes de cada ensayo, determinar la condición fisiológica de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a dosis altas y bajas de la droga en ensayo de proliferación celular.
- Diluir cada ERS la concentración adecuada de trabajo con medio de cultivo (por ejemplo,, 1 μM para JQ1(+)).
PRECAUCIÓN: Reconstituir los fármacos liofilizados con el solvente apropiado a una concentración de 10 mM. Guarde todo stock LRAs a-80 ° C en una alícuota de solo uso (5 μ) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. - Cuidadosamente aspirar el medio de transfección con un multicanal y reemplace por 100 medio μL conteniendo ERS apropiado (tabla 1). Añadir medio muy suavemente junto a la pared del pozo para evitar el desprendimiento de las células HEK293T transfected, que desprenda fácilmente de la superficie de la placa de cultivo.
- Incube la placa durante 48 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.
3. tinción de células Transfected con el tinte de viabilidad pueden corregir para el análisis de citometría de flujo
PRECAUCIÓN: Eliminación de desechos y células muertas es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad.
- Separar las células en los medios de comunicación con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pozo y transfiriendo suavemente hacia arriba y abajo (~ 5 veces) con un multicanal, evitando la formación de espuma de los medios de comunicación. Si es necesario, separar las células de la placa utilizando 35 μl por pocillo de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar con medio que contiene el suero.
- Transferir las células a una placa de 96 pocillos fondo V.
- Girar las células durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C, y luego aspirar con cuidado el medio/PBS sin tocar las células.
- Lavar las células al menos 1 vez con 200 μL de PBS libre de suero, proteína.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante inclinando la placa y retirando el tampón de lavado sin tocar las células.
- Preparar una solución de trabajo de viabilidad pueden corregir tinte diluyendo la viabilidad tinte 1: 1000 en PBS libre de suero, proteína. Preparar 50 μl de la mancha diluida por pozo.
Nota: Tintes de viabilidad están disponibles en una gama de colores adecuadas para el uso con láser azul, rojo y violeta. Preparar una solución stock de viabilidad pueden corregir tinte resuspender un frasco de la tintura liofilizada (componente A) con 50 μL de DMSO anhidro (componente B). Conservar a-20 ° C en un solo uso alícuota (1 μL cada), protegido de la luz. - Añadir 50 μL de colorante diluido viabilidad a cada pozo y mezclar las células pipeteando arriba y abajo con un multicanal.
- Tinción para 10-15 min a 4 ° C, protegido de la luz.
- Lavar 1 - 2 veces con 150 μL de tampón de lavado (PBS con 1% bovinos albúmina sérica y 2 mM EDTA).
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Fijar las células con 100 μL de formaldehído al 1% recién preparado en tampón de lavado durante 10-15 min a 4 ° C en la oscuridad.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es muy tóxico. Preparar la solución de formaldehído 1% en una campana de humos para evitar la inhalación mientras que usa guantes y gafas de seguridad para la protección. - Lavar las células 1 - 2 veces con 100 μL de tampón de lavado.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 70 μL de tampón de lavado.
Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Células fijas podrían ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad para el análisis al día siguiente en el citómetro de flujo.
4. EGFP y mediciones DsRed por citometría de flujo y análisis de datos
Nota: Analizar la transcripción del VIH (% EGFP) y empalme (% DsRed) en un citómetro de flujo. Filtrar la muestra antes de la carrera con un celular-filtro 70 μm o 100 μm de malla de nylon para evitar la obstrucción de la boquilla.
- Poner en marcha el citómetro y la computadora por lo menos 10 minutos antes para calentar los láseres.
- Antes de correr las muestras y comenzar la adquisición de datos, llenar el depósito de la vaina con solución salina 0.9% y aseguran que una pastilla de hipoclorito de sodio se agrega al tanque de residuos.
- Compruebe la célula de flujo para las burbujas de aire.
- Verificar que los detectores y los filtros son adecuados para el experimento.
Nota: Para EGFP, uso del láser azul (488 nm) y 530/30 paso de banda, mientras que DsRed Express óptimo se detecta usando el laser amarillo (561 nm) y paso de banda de 610/20. Un láser azul (488 nm) y paso 610/20 también puede ser utilizado para detectar DsRed expresión. - Comprobar el funcionamiento del citómetro y sensibilidad a través de detectores ejecutando el cuentas de calibración.
- Ajustar el avance (FSC-A) y voltajes de scatter (SSC-A) de lado con mancha muestra que la población principal es en la pantalla y claramente discernible.
Nota: FSC (luz dispersada hacia delante) es una medida de la luz difracción en un ángulo plano, que depende del volumen de la célula (célula superficie o tamaño), mientras que SSC (lado dispersada luz) es una medida de la difracción de la luz en un ángulo recto, que es proporcional a granularidad de la célula y complejidad interna. - Realizar compensación manual o automática mediante las muestras teñidas solo asegurar mínimo contagio de EGFP + población en el detector DsRed y viceversa.
PRECAUCIÓN: Por compensación, utilice una muestra de las células que expresan cada una de la proteína fluorescente de color único como células teñidas con el tinte de viabilidad pueden corregir individualmente. No utilice cuentas de compensación FITC y PE para compensaciones de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed debido a diferentes características espectrales. Controles de compensación deben ser lo suficientemente brillantes para resolver positiva y negativa de la población. - Crear parcelas y fijar las puertas usando la fluorescencia menos uno controla (FMO).
- Adquirir y registrar un mínimo de 10.000 eventos de células viables por muestra. Ejecutar ejemplos a velocidad media o baja para evitar dobletes pasando por la intercepción de láser. Utilizar pulso de compuerta geometría como SSC-A frente a SSC-H para eliminar dobletes. Comprobar la estabilidad del funcionamiento mediante el trazado de tiempo versus SSC-A ver cómo incluso el flujo es durante el funcionamiento.
- Al final de la carrera, limpiar los fluidos de citometría de flujo con detergentes concentrados y agua durante 5 minutos.
- Apagar el sistema, deseche la basura y volver a llenar el tanque de la vaina después de la adquisición.
- Analizar los datos utilizando un software de análisis de datos de citometría de flujo. Excluyen restos celulares y mata (dobletes) basado en la dispersión hacia delante y lateral, a continuación, eliminar las células muertas con la mancha de tinte de viabilidad (negativa población = células vivas). Identificar las células que expresan EGFP y DsRed (figura 4), así como el porcentaje de producto empalmado DsRed /(DsRed + EGFP) (figura 5).
- Determinar el efecto del LRA en la transcripción del VIH y empalmar mediante la comparación de las células no tratadas y las células expuestas al individuo o a una combinación de LRAs (figura 5).
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Resultados
Resultados representativos se muestran en la figura 5 para la expresión del VIH-1 unspliced (EGFP) y empalma (DsRed) productos después del tratamiento con el inhibidor de bromodominios JQ1. JQ1(+) y Tat aumentaron significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP (FC 2.18 y 4,13 sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de unspliced transcripciones. Por otra parte, JQ1(+) aumentó significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed (...
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Discusión
Dada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ' Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para modelar las ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células fuertes | |||
| HEK293T fuertes (células de riñón embrionario humano) | ATCC | CRL-3216 | Replica vectores portadores de la región de replicación SV40. |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4,5 g/L de D-glucosa + 110 mg/L de piruvato de sodio |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10099-141 | Origen Australia |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P4458 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), sin calcio, sin magnesio | Gibco | 14190-136 | |
| Tinción azul de tripán, 0,4% | Gibco | 15250 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reactivo de transfección lipídica |
| Opti-MEM I (1x) medio sérico reducido | Gibco | 31985-070 | Medio libre de suero |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| PEGFP-N1 plásmido | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expresión de EGFP en células de mamíferos, promotor CMVIE. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expresión de DsRed-Express en células de mamíferos, promotor CMVIE. |
| pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 μ M |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 μ M |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | stock a 100 μ g/mL en DMSO; concentración de trabajo 10 nM |
| Fitohemaglutinina (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock a 1 μ g/μ L en PBS; concentración de trabajo 10 μ g/mL |
| Vorinostat (VOR) | Stock de 10009929 Químicos de las Islas Caimán | a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 0,5 μ | |
| M Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 30 nM | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Kit de detección de micoplasma, basado en PCR |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | >strong<>Comments |
| >Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Citómetro de flujo (4 láseres: azul, rojo, violeta y amarillo) | |
| Kit de tinción celular | Life Technologies | L34976 | Colorante de viabilidad: para excitación de 633 o 635 nm, 400 ensayos. Los componentes A y B se proporcionan en el kit. |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Solución de formaldehído 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS& T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Perlas de calibración |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 picos) | BD Biosciences | 559123 | 3,0 - 3,4 mm |
| Solución de vaina | Chem-Supply | SA046 | 90 g de NaCl en 10 L |
| de agua HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Pastillas de liberación de cloro para la desinfección |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Agentes de limpieza concentrados del citómetro de flujo. Solución de trabajo Decon 90 5%. |
| Hipoclorito de sodio (solución al 12-13%) | Labco | SODHYPO-5L | Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo lejía 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo 7x 1%. |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Materiales | |||
| Matraces de cultivo de tejidos (75 cm2, cuello inclinado, tapa ventilada) | Corning | 430641U | |
| Placas de cultivo de tejidos (fondo plano de 96 pocillos con tapa) | Costar | 3599 | |
| Placas de cultivo de tejidos (96 pocillos con fondo en V sin tapa) | Costar | 3896 | |
| Tubos de centrífuga (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Tubos de centrífuga (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Tubos de microcentrífuga (1,5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serológico Pipeta (25 mL), estéril | Corning | CLS4489-200EA | |
| Pipeta serológica (10 mL), estéril | Corning | CLS4488-200EA | |
| Pipeta serológica (5 mL), estéril | Corning | CLS4487-200EA | |
| Depósitos de reactivos (50 mL), estéril | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con tapón de filtro de células | Corning | 352235 | Estilo de 12 x 75 mm, malla |
| nailon | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Microtubos de ensayo, a granel | BIO-RAD | 2239391 | tubos microfacs Tubo de |
| ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL, sin tapón | Tapones a presión Corning | 352008 | 12x75 mm estilo |
| Snap para tubos de ensayo de 12x75 mm | Corning | 352032 | |
| Cámara de recuento, Neubauer mejorada de doble regla de red, línea brillante (Hemocitómetro, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 cuadrados grandes de 1 mm2; Profundidad 0,100 mm; volumen 0,1 mL; superficie mínima 0,0025 mm2 |
| cubreobjetos (Menzel-Glä Grale | Scientific | HCS2026 | Microscopio de 20 x 26 mm |
| Nikon TMS | 310528 | ||
| Centrífuga 5810R refrigerada | Eppendorf | 5811000487 con rotor A-4-81 incluyendo adaptadores para tubos cónicos de 15/50 mL | |
| Lector de microplacas FLUOstar Omega | BMG Labtech | N/A | Lector de placas para ensayo de proliferación celular. Filtro 490 nm. |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Programa de adquisición y análisis de datos de citómetros de flujo, versión 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Programa de análisis de datos del citómetro de flujo, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar control de lector multiusuario, versión 5.11 | |
| Omega - Análisis de datos | BMG Labtech | MARS | em>FLUOstar análisis de datos, versión 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft Excel:mac 2011 | versión 14.0.0 | |
| Prisma | GraphPad | Prisma 7 | versión 7.0c |
Referencias
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- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
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