Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.
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Artículo de método
Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing
En este artículo
Resumen
Resumen
VIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de "choque y muerte" se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.
Introducción
A pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5' promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir l....
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Protocolo
Nota: Procedimientos de clonación, transformación y la secuencia son discutidas en otra parte18,19. Los protocolos aquí a partir de la transfección de los vectores de expresión mamíferos (figura 3).
1. construcción de transfección de células HEK293T con la reportera de Color Dual
- Cultivar células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Después de descongelar, l....
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Resultados
Resultados representativos se muestran en la figura 5 para la expresión del VIH-1 unspliced (EGFP) y empalma (DsRed) productos después del tratamiento con el inhibidor de bromodominios JQ1. JQ1(+) y Tat aumentaron significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP (FC 2.18 y 4,13 sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de unspliced transcripciones. Por otra parte, JQ1(+) aumentó significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed (.......
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Discusión
Dada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ' Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para modelar las .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células fuertes | |||
| HEK293T fuertes (células de riñón embrionario humano) | ATCC | CRL-3216 | Replica vectores portadores de la región de replicación SV40. |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4,5 g/L de D-glucosa + 110 mg/L de piruvato de sodio |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10099-141 | Origen Australia |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P4458 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), sin calcio, sin magnesio | Gibco | 14190-136 | |
| Tinción azul de tripán, 0,4% | Gibco | 15250 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reactivo de transfección lipídica |
| Opti-MEM I (1x) medio sérico reducido | Gibco | 31985-070 | Medio libre de suero |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| PEGFP-N1 plásmido | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expresión de EGFP en células de mamíferos, promotor CMVIE. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expresión de DsRed-Express en células de mamíferos, promotor CMVIE. |
| pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 μ M |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 μ M |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | stock a 100 μ g/mL en DMSO; concentración de trabajo 10 nM |
| Fitohemaglutinina (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock a 1 μ g/μ L en PBS; concentración de trabajo 10 μ g/mL |
| Vorinostat (VOR) | Stock de 10009929 Químicos de las Islas Caimán | a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 0,5 μ | |
| M Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 30 nM | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Kit de detección de micoplasma, basado en PCR |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | >strong<>Comments |
| >Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Citómetro de flujo (4 láseres: azul, rojo, violeta y amarillo) | |
| Kit de tinción celular | Life Technologies | L34976 | Colorante de viabilidad: para excitación de 633 o 635 nm, 400 ensayos. Los componentes A y B se proporcionan en el kit. |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Solución de formaldehído 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS& T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Perlas de calibración |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 picos) | BD Biosciences | 559123 | 3,0 - 3,4 mm |
| Solución de vaina | Chem-Supply | SA046 | 90 g de NaCl en 10 L |
| de agua HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Pastillas de liberación de cloro para la desinfección |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Agentes de limpieza concentrados del citómetro de flujo. Solución de trabajo Decon 90 5%. |
| Hipoclorito de sodio (solución al 12-13%) | Labco | SODHYPO-5L | Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo lejía 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo 7x 1%. |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Materiales | |||
| Matraces de cultivo de tejidos (75 cm2, cuello inclinado, tapa ventilada) | Corning | 430641U | |
| Placas de cultivo de tejidos (fondo plano de 96 pocillos con tapa) | Costar | 3599 | |
| Placas de cultivo de tejidos (96 pocillos con fondo en V sin tapa) | Costar | 3896 | |
| Tubos de centrífuga (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Tubos de centrífuga (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Tubos de microcentrífuga (1,5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serológico Pipeta (25 mL), estéril | Corning | CLS4489-200EA | |
| Pipeta serológica (10 mL), estéril | Corning | CLS4488-200EA | |
| Pipeta serológica (5 mL), estéril | Corning | CLS4487-200EA | |
| Depósitos de reactivos (50 mL), estéril | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con tapón de filtro de células | Corning | 352235 | Estilo de 12 x 75 mm, malla |
| nailon | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Microtubos de ensayo, a granel | BIO-RAD | 2239391 | tubos microfacs Tubo de |
| ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL, sin tapón | Tapones a presión Corning | 352008 | 12x75 mm estilo |
| Snap para tubos de ensayo de 12x75 mm | Corning | 352032 | |
| Cámara de recuento, Neubauer mejorada de doble regla de red, línea brillante (Hemocitómetro, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 cuadrados grandes de 1 mm2; Profundidad 0,100 mm; volumen 0,1 mL; superficie mínima 0,0025 mm2 |
| cubreobjetos (Menzel-Glä Grale | Scientific | HCS2026 | Microscopio de 20 x 26 mm |
| Nikon TMS | 310528 | ||
| Centrífuga 5810R refrigerada | Eppendorf | 5811000487 con rotor A-4-81 incluyendo adaptadores para tubos cónicos de 15/50 mL | |
| Lector de microplacas FLUOstar Omega | BMG Labtech | N/A | Lector de placas para ensayo de proliferación celular. Filtro 490 nm. |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Programa de adquisición y análisis de datos de citómetros de flujo, versión 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Programa de análisis de datos del citómetro de flujo, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar control de lector multiusuario, versión 5.11 | |
| Omega - Análisis de datos | BMG Labtech | MARS | em>FLUOstar análisis de datos, versión 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft Excel:mac 2011 | versión 14.0.0 | |
| Prisma | GraphPad | Prisma 7 | versión 7.0c |
Referencias
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cur....
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Reimpresiones y permisos
