Las células de la zona marginal B (MZBs) responden a la fuerza de esquileo del flujo por reorientar su ruta de migración el flujo. Este protocolo muestra cómo grabar y analizar la migración utilizando una unidad de fluidos, bomba, sistema de proyección de imagen del microscopio y software libre.
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Artículo de método
Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro
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Resumen
Resumen
Las células de la zona marginal B (MZBs) son una población de células B que residen en las zonas marginal esplénicas de ratón que envuelven los folículos. Para llegar a los folículos, MZBs debe migrar la fuerza de esquileo del flujo de sangre. Aquí presentamos un método para el análisis de esta migración MZB fluir-inducido in vitro. En primer lugar, MZBs están aislados del bazo de ratón. En segundo lugar, MZBs son colocados en ligandos de integrinas en diapositivas cámara de flujo, expuestas al flujo del esquileo y fotografiadas con un microscopio al migrar. En tercer lugar, imágenes de las migración MZBs son procesados utilizando la célula automática MTrack2 seguimiento de plugin de ImageJ y las pistas de la célula resultante se cuantifican utilizando la herramienta de quimiotaxis Ibidi. Los datos de migración revelan cómo rápidamente las células mueven, con qué frecuencia cambian de dirección, si el vector de flujo afecta la dirección de migración y que ligandos de integrinas están involucrados. Aunque utilizamos MZBs, el método puede ser fácilmente adaptado para el análisis de migración de ningún leucocito que responde a la fuerza de esquileo del flujo.
Introducción
Las células inmunes son las células más móviles del cuerpo humano y a menudo deben lidiar con la fuerza de esquileo del flujo sanguíneo y linfático. Sin embargo, hay relativamente pocos estudios sobre la migración de inducida por la fuerza de esquileo de leucocitos1,2,3,4,5. Aquí presentamos un protocolo confiable y cuantitativo para analizar la respuesta de una célula inmune al flujo in vitro. Realizar el análisis no requiere la fabricación de componentes, y todos los equipos y consumibles están comercialm....
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Protocolo
Todos los experimentos que implican el uso de animales han sido aprobados previamente por el Landesverwaltungsamt Halle (Sajonia-Anhalt), Alemania, según todas las pautas de la Facultad de medicina de la Universidad de Magdeburg de OVGU.
1. purificación de células MZB
-
Leucocitos aislados.
- Sacrificar un 8 a 16 semanas de edad ratón y quitar el bazo16. Disociar el bazo en 5 mL de tampón de celda helada [solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,5% albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (BSA)], usando un Disociador de tejido o majar suavemente el bazo a través de una ....
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Resultados
Se utilizó el protocolo descrito para comparar la migración de MZBs en portaobjetos recubiertos con ICAM-1 sin flujo (0 dyn/cm2) y expuestos a esfuerzo cortante flujo (4 dyn/cm2). Las células fueron seguidas automáticamente con MTrack2 y la pista que archivos eran overlaid en las películas de migración celular de no flujo (0 dyn/cm2) y (4 dyn/cm2) para mostrar la distribución y forma de las pistas (Figura 4A). Pista.......
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Discusión
Aquí describimos un método para el análisis de la migración de las células que detectan la fuerza de esquileo del flujo y responde modificando su migración. Un análisis de MZBs demostró que MZBs migran espontáneamente en ICAM-1 y en presencia de flujo, migrará el flujo. En nuestro trabajo anterior, mostramos que MZBs no migrar el flujo en VCAM-1, pero en cambio permanecen fijos en su lugar. La zona marginal esplénica murina contiene principalmente ICAM-1, mientras que la pulpa roja contiene ICAM-1 y VCAM-1. De estos dato.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 a K.-D.F.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de celdas VWR, 70 y micro; m | VWR | 10199-656 | |
| Filtros de preseparación, 30 µ m | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Kit de aislamiento celular MZB y FOB | Miltenyi | 130-100-366 | |
| B220 CD45R, clon RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 | |
| CD21 / CD 35, clon 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 | |
| CD23, clon B3B4, PE | Biolegend | 101608 | |
| HBSS | Biochrom | L2035 | |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 | |
| BSA fracción V de albúmina, sin ácidos grasos | Roth | "0052.3" | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 796-IC-050 | |
| Ibidi µ-portaobjetos VI 0,4, hidrófobo, sin recubrimiento | Ibidi | 80601 | |
| Juego de perfusión, blanco, 50 cm, 0,8 mm | Ibidi | 10963 | |
| Ibidi Sistema de bombeo | Ibidi | 10902 |
Referencias
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A.
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Reimpresiones y permisos
