Micronización mecánica de Lipoaspirates para la terapia regenerativa

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener la fracción vascular estromal de tejido adiposo a través de una serie de procesos mecánicos, que incluyen múltiples centrifugados y emulsificación.

Resumen

Fracción vascular estromal (SVF) se ha convertido en una herramienta regenerativa para varias enfermedades; sin embargo, la legislación regula estrictamente la aplicación clínica de células usando colagenasa. Aquí, presentamos un protocolo para generar una mezcla inyectable de SVF células y matriz extracelular nativa del tejido adiposo mediante un proceso puramente mecánico. Lipoaspirates se pone en una centrífuga y rota a 1.200 x g durante 3 minutos. La capa media se recoge y se separa en dos capas (alta densidad grasa en la parte inferior) y baja densidad grasa en la parte superior. La capa superior se emulsiona directamente cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa en la capa de aceite se recoge y se define como la matriz extracelular (ECM) / gel de SVF. Se recoge el aceite en la capa superior. Aproximadamente 5 mL de aceite se añade a 15 mL de grasa de alta densidad y emulsionado cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa es SVF/ECM-gel. Después del trasplante del ECM o SVF-gel en ratones desnudos, el injerto es cosechado y evaluado por la examinación histologic. El resultado demuestra que este producto tiene el potencial para la regeneración en el tejido adiposo normal. Este procedimiento es un procedimiento de disociación mecánica simple y efectiva para condensar las células SVF incrustadas en su natural apoyo ECM con fines regenerativos.

Introducción

Terapias con células madre ofrecen un cambio de paradigma para la regeneración y reparación de los tejidos por lo que pueden ofrecer un régimen terapéutico alternativo para varias enfermedades¹. Las células madre (p. ej., células madre pluripotentes inducidas y las células madre embrionarias) tienen un gran potencial terapéutico pero son limitadas debido a la regulación de la célula y consideraciones éticas. Derivados del adiposo mesenquimales estromales/células madre (ASCs) son fáciles de obtener de lipoaspirates y no está sujeto a las mismas restricciones; así, se ha convertido en un tipo de célula ideal para medicina regenerativa práctica². Además, son nonimmunogenic y tienen recursos abundantes de grasa autóloga³.

En la actualidad, ASCs se obtienen principalmente por digestión con colagenasa-mediada del tejido adiposo. La fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo contiene ASCs, células progenitoras endoteliales, pericitos y células inmunes. Aunque obtener una alta densidad de SVF/ASC enzimático fue demostrado para tener efectos beneficiosos, la legislación en varios países regula estrictamente el uso clínico de productos basados en células con colagenasa⁴. Digerir el tejido adiposo con colagenasa durante 30 min a 1 h para obtener células SVF aumenta el riesgo de material exógeno en la preparación y la contaminación biológica. La cultura adherente y la purificación de la ASC, que dura días a semanas, requieren equipo de laboratorio específico. Por otra parte, en la mayoría de los estudios, las células SVF y ASC se utiliza en suspensión. Sin la protección de matriz extracelular (ECM) o de otro transportista, células libres son vulnerables, causar una retención celular pobre después de la inyección y comprometer el resultado terapéutico⁵. Todas estas razones limitan el uso adicional de la terapia de células madre.

Para obtener ASCs de tejido adiposo sin digestión mediada por la colagenasa, varios procedimientos de tratamiento mecánico, como centrifugación, mecánico para picar, triturar, triturar y picar, han sido desarrollados^{6,7 , 8 , 9}. estos métodos se piensan para condensar tejido y ASCs interrumpiendo mecánicamente adipocytes maduros y sus vesículas que contienen el aceite. Por otra parte, estos preparados, que contienen altas concentraciones de ASCs, demostraron un potencial terapéutico considerable como medicina regenerativa en animales modelos^8,9,10.

En 2013, Tonnard et al. introdujo la nanofat injerto técnica, que consiste en producir emulsionado lipoaspirates intersyringe procesamiento¹¹. La fuerza de corte por intersyringe cambio selectivamente puede romper adipocitos maduros. De acuerdo con sus resultados, se desarrolló un método de proceso puramente mecánico que quita la mayor parte de los lípidos y el líquido en el lipoaspirates, dejando solamente las células SVF y ECM fraccionada, que es el SVF/ECM-gel¹². Adjunto, describimos los detalles del proceso mecánico de derivados humanos el tejido adiposo para producir el gel o SVF-ECM.

Protocolo

Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión ética en Nanfang Hospital, Cantón, China. Tejido adiposo se obtuvo de donantes sanos que dieron consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Nanfang Hospital institucional Animal cuidado y uso y realizados según los lineamientos de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (China).

1. ECM/SVF-gel de preparación

1. La cosecha de grasa.
   1. Realizar liposucción en un ser humano con una cánula selectora de 3 mm, que contiene varios agujeros del lado agudo de 1 mm de diámetro, en -0.75 atm de presión de aspiración.
   2. Recoger 200 mL de lipoaspirates en una bolsa estéril.
2. Preparar grasa Coleman.
   1. Transferencia de la lipoaspirates en cuatro tubos de 50 mL y permite la cosecha todavía reposar 10 minutos.
   2. Recopilar la grasa en la capa superior en dos tubos de 50 mL con una pipeta de Punta ancha para transferir y desechar la porción de líquido en la capa inferior.
   3. Utilizando tubos de 50 mL, centrifugados la capa de grasa x 1.200 g a temperatura ambiente (RT) por 3 minutos.
   4. Definir la capa superior (aproximadamente 80 mL) como grasa Coleman.
   5. Transferencia el 2/3 superiores de la grasa Coleman a un tubo de 20 mL usando una pipeta de Punta ancha y definir esta parte como baja densidad grasa.
   6. Transferencia el 1/3 inferior de la grasa Coleman a otro tubo de 20 mL usando una pipeta de Punta ancha y definir esta parte como la grasa de alta densidad.
3. Productos ECM o SVF-gel de grasa de baja densidad.
   1. Utilizando dos jeringas de 20 mL, conectadas por un conector de Luer-Lock hembra a hembra (con un diámetro interno de 2,4 mm) para intershift de 20 mL de grasa de baja densidad.
   2. Mantener la velocidad de desplazamiento estable (a 20 mL/s) y repetición de 6 x a 8 x.
   3. Centrifugado la mezcla a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos.
   4. Recoger la porción de aceite en la parte superior en un tubo de 10 mL utilizando una pipeta de Punta ancha a temperatura ambiente para su uso posterior.
   5. Recoger la sustancia pegajosa en la capa media, que es SVF/ECM-gel (figura 1A), utilizando una pipeta de Punta ancha y deseche el líquido en la capa inferior.
4. Productos ECM o SVF-gel de grasa de alta densidad.
   1. Añadir 5 mL de aceite (tomado del paso 1.3.4) a 15 mL de grasa de alta densidad.
   2. Intershift la grasa mixta entre jeringas 6 x 8 x hasta un flocular se observa dentro de la emulsión.
   3. Centrifugado la mezcla a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos.
   4. Deseche la porción de aceite en la parte superior.
   5. Recoger la sustancia pegajosa en la capa media (ECM/SVF-gel) usando una pipeta de Punta ancha y deseche el líquido en la capa inferior.
   6. Mezclar el gel ECM/SVF de pasos 1.3.5 y 1.4.5.

2. nude modelo SVF/ECM-gel del injerto

1. Anestesiar los ratones nude (8 semanas viejo, mujer) con isoflurano (1-3%) Anestesia Inhalatoria en una sala de operación animal.
2. Transferencia del ECM o SVF-gel en una jeringa de 1 mL.
3. Conecte la jeringa de 1 mL con una cánula de infiltración embotado.
4. Inserte la cánula por vía subcutánea cada flanco del ratón.
5. Inyectar 0,3 mL del ECM o SVF-gel.

3. tejido cosecha en 3, 15 y 90 días después de la inyección de la ECM o SVF-gel

1. Anestesiar los ratones con isoflurano (1-3%) anestesia inhalatoria.
2. Sacrificar a los ratones por el método de la dislocación cervical.
3. Hacer una incisión en la línea media de la piel dorsal del ratón con tijeras quirúrgicas.
4. Disecar y los injertos de grasa en ambos lados del ratón de la cosecha. Incrustar los injertos de grasa en el paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante la noche.
5. Deshidratar el tejido en el aumento de las concentraciones de etanol: etanol al 70%, dos cambios, 1 h; un cambio en etanol al 80%, 1 h; un cambio en etanol al 95%, 1 h; etanol al 100%, tres cambios, 1,5 h cada uno; xileno, tres cambios, 1,5 h cada uno.
6. Infiltrarse en el tejido con cera de parafina (58-60 ° C), dos cambios, 2 h.
7. Incorporar el tejido en bloques de parafina. Cortar secciones en un espesor de aproximadamente 4 μm y ponerlos en las diapositivas.

4. hematoxilina y eosina

1. Desparafinizar las diapositivas de bloque de parafina por sumergiéndolas en xileno I, II y III (10 min).
2. Rehidratar las secciones de tejido al pasar a través de la disminución de las concentraciones (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) de baños de etanol durante 3 minutos.
3. Enjuague las secciones del tejido en agua destilada (5 min).
4. Mancha de las secciones de tejido en hematoxilina durante 5 minutos.
5. Enjuague las secciones de tejido en el chorro del grifo durante 20 min decolore en alcohol ácido al 1% (1% ácido clorhídrico en alcohol al 70%) para 5 s. enjuague en agua de grifo hasta que las secciones azul nuevo.
6. Añadir dos o tres gotas de colorante de la eosina Y directamente sobre el portaobjetos con una pipeta y permiten el colorante durante 10 minutos.
7. Lave los portaobjetos en agua 1-5 minutos.
8. Deshidratar el portaobjetos en el aumento de las concentraciones (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) de etanol durante 3 minutos.
9. Limpiar el portaobjetos en xileno I y II durante 5 minutos.
10. Montar las diapositivas en los medios de montaje.

5. inmunofluorescente de tinción

1. Desparafinizar las secciones de tejido en xileno I, II y III (5 min).
2. Rehidratar las secciones de tejido al pasar a través de diferentes concentraciones (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) de baños de alcohol durante 3 minutos.
3. Incubar las secciones en una solución de 3% H₂O₂ en metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos.
4. Enjuague los portaobjetos 2 x con agua destilada, 5 minutos cada uno.
5. Las diapositivas de la gota en una cesta portaobjetos. Añadir 300 mL de tampón citrato 10 mM (pH 6.0) e incubar los portaobjetos a 95-100 ° C durante 10 minutos.
6. Enfriar el portaobjetos en RT por 20 min.
7. Enjuague los portaobjetos 2 x con tampón fosfato salino (PBS), 5 minutos cada uno.
8. Añada 100 μl de suero bovino fetal 10% en las diapositivas e incubar en cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hora.
9. Incubar las secciones con la solución de anticuerpo primario (conejillo de Indias anti-ratón Perilipin, 1: 400) a 4 ° C durante la noche.
10. Enjuague los portaobjetos con PBS 3 x, 5 minutos cada uno.
11. Incubar las secciones con la solución de anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-guinea pig-488) por 2 h a TA.
12. Enjuague los portaobjetos con PBS 3 x, 5 minutos cada uno.
13. Limpie el agua alrededor de la sección con papel limpio.
14. 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y Alexa Fluor 488 conjugado proteína la gota en el círculo para cubrir la sección de la diapositiva.
15. Monte el cubreobjetos y deje secar en la oscuridad.
16. Observe las diapositivas con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Después de procesar la grasa Coleman a gel o SVF-ECM, el volumen de petróleo desechado ocupa 80% del volumen final, y sólo el 20% de tejido adiposo conservado bajo la capa de aceite se considera como ECM o SVF-gel (figura 1A). ECM/SVF-gel tiene una textura suave de tipo líquido que le permite ir a través de una aguja fina 27 G; sin embargo, Coleman grasa se compone de una estructura grasa integral con fibras grandes y sólo puede ir a través d...

Discusión

Terapia Regenerativa de células madre ha mostrado un gran beneficio potencial en diferentes enfermedades. ASCs son candidatos terapéuticos porque son fáciles de obtener y tienen la capacidad de reparación de los tejidos y la regeneración de nuevos tejidos¹⁵. Sin embargo, existen limitaciones a la expansión de su uso clínico, ya que requiere procedimientos complicados para aislar células y colagenasa para el procesamiento de⁶. Por lo tanto, es esencial desarrollar una técnic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 488-isolectina conjugada GS-IB4	Sondas moleculares	I21411
conejillo de indias anti-ratón perilipina	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
pipeta de punta ancha	Celltreat	229211B
Microscopio confocal	Leica	TCS SP2
desnudo agradable	Universidad Mdical del Sur	/
microscopio óptico	Olympus	/
tubo de 50 mL	Cornig	430828
bolsa estéril	Laishi	/
micrótomo	Leica	centrífuga CM1900
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