Artículo de método

Terapia génica inspirado POLICATIÓN recubrimiento para protección de nanoestructuras de Origami de ADN

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DOI:

10.3791/58771

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19 de enero de 2019

 , 
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para la protección del ADN origami nanoestructuras en Mg-agotado y nucleasa medios enriquecidos con polisacárido catiónico natural Quitosana y recubrimientos sintéticos polietilamina lineal (LPEI).

Resumen

Nanoestructuras de origami de ADN tienen un inmenso potencial para ser utilizado para aplicaciones biológicas y médicas. Sin embargo, condiciones de baja en sal y nucleasas en fluidos fisiológicos inducen la desnaturalización y la degradación de uno mismo-montado nanoestructuras de ADN. En la entrega de genes no virales, degradación enzimática de la DNA es superada por la encapsulación del ADN cargado negativamente con un shell catiónico. Aquí, inspirado en avances de entrega de gene, un simple, un solo paso y una metodología robusta se presenta para la estabilización del ADN origami nanoestructuras cubriendo con quitosano y polietilamina lineal. La capa del POLICATIÓN protege eficazmente ADN origami nanoestructuras en Mg-agotado y nucleasa medios enriquecidos. Este método también preserva el direccionamiento completo de enzima y aptámeros basado en la funcionalización de nanoestructuras de ADN.

Introducción

El ADN es un bloque de construcción versátil para la uno mismo-montaje de estructuras a nanoescala1programable. El método más popular para crear nanoestructuras de ADN es la técnica de origami de ADN, que se basa en la uno mismo-montaje de un ADN trenzado circular larga, solo andamio con la ayuda de cientos de grapa sintética determinar de forma más corta hebras de2. Hoy en día, la creación de nanoestructuras de ADN en casi cualquier geometría y morfología es fácilmente factible. Nanoestructuras de ADN pueden ser site-specifically funcionalizados con alta precisión de3,4 y pueden ser programado para someterse a cambios conformacionales alostéricos5,6. Por lo tanto, utilizando el ADN como material de construcción ofrece una oportunidad única para crear nanoestructuras personalizados programables y capacidad de respuesta para aplicaciones en biodetección, diagnóstico y entrega de la droga. Sin embargo, son susceptibles a la digestión por endoy exo- nanoestructuras de ADN-nucleasas y basado en el enrejado 3D origami de ADN nanoestructuras generalmente requieren almacenadores intermediarios de alta salinidad (e.g., 5-20 mM de Mg+ 2) para mantener su integridad7,8.

La rápida degradación del ADN de las nucleasas presentes en la sangre y la matriz extracelular es un gran obstáculo para la entrega eficiente en vivo de productos genéticos en las células9. Para superar esta limitación, en la entrega de genes no virales, el ADN se mezcla con un polímero catiónico en un definido N/P cargo ratio (relación de aminas en POLICATIÓN a los fosfatos en el ADN)10. El complejo de la DNA con un polímero catiónico, conocido como polyplex, protege el ADN de la degradación mediada por la nucleasa y mejora su absorción celular11. Inspirada en los avances de entrega de genes, oligolysine12, oligolysine-polietileno glicol (PEG) copolímeros13, poly (2-dimetilamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-basado en polímeros14y virus capsid proteínas15 se han utilizado para estabilizar el ADN origami nanoestructuras.

Recientemente, se informó un método para la protección del ADN origami nanoestructuras en Mg-agotado y nucleasa-rich media utilizando el quitosano polisacárido catiónico natural y el sintético polietilamina lineal (LPEI) fue divulgado16. Este artículo es una adaptación de nuestro anterior trabajo y describe el protocolo detallado para la preparación de polyplexes, su caracterización, pruebas de la estabilidad de nanoestructuras desnudo y protegida en medios bajos en sal y ricos en la nucleasa y examinar la direccionamiento de functionalized de enzima y aptámeros ADN origami nanoestructuras sobre capa del POLICATIÓN.

Protocolo

1. preparación de solución madre de POLICATIÓN

  1. Solución madre LPEI
    1. Añadir 10 mg de LPEI en un vaso de vidrio que contiene < 10 mL de H2O.
    2. Para disolver completamente LPEI, agregar ácido clorhídrico (32%) hasta llegar a pH 2.0.
    3. Ajustar el pH a 7.0 agregando NaOH (10 M).
    4. Ajustar el volumen a la concentración final de 1 mg/mL.
    5. Filtrar la solución LPEI a través de una membrana de 0,22 μm.
  2. Solución madre de quitosano
    1. Disolver 16,6 mg de lactato de oligosacáridos de quitosano (Mw ~ 5 kDa, 60% composición de oligosacárido, desacetilado de la quitina en un 90%) en 1 mL de medio acuoso ácido acético (10%) para preparar una solución madre con una concentración de 10 mg/mL.

2. purificación de ADN Origami nanoestructuras

  1. Mezclar 100 μl de la muestra de origami de ADN (de 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (denotado como TB) incluyendo 18 mM MgCl2) con el volumen equivalente de 22 mM MgCl2 suplido TB (100 μL) en un tubo de 1,5 mL.
  2. Añadir 200 μL de tampón de purificación (15% (w/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA y 505 mM NaCl). Mezclar suavemente por inversión del tubo.
  3. Girar la muestra a 16.000 × g a temperatura ambiente (r.t.) durante 25 minutos.
  4. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón 16 mM MgCl2 suplido TB. El sobrenadante y el sedimento contienen exceso hebras discontinuas y el origami de ADN precipitado, respectivamente.
  5. Incubar la muestra durante un día en r.t. a 650 rpm en un Termomezcladores. Este paso es para la completa resuspensión de origami de ADN.

3. electroforesis en Gel de agarosa (edad)

  1. Añadir 1,6 g de agarosa y 80 mL de buffer x TAE 0.5 (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, ácido acético de 10 mM, pH 8) en un vaso de vidrio para preparar un gel de agarosa al 2%. Microondas por 5 minutos agitar el contenido del vaso durante 1 minuto en baño de agua. Añadir 352 μl de MgCl2 (2,5 M) para preparar el gel con 11 mM de MgCl2. La mancha el gel con 10 μl de tinción del gel de DNA.
  2. Verter la solución de gel en una caja de gel seco y coloque un peine de electroforesis de gel. Deje que la solución se solidifican en r.t. para 15-30min.
  3. Suplemento el buffer corriente (0,5 x Tampón TAE) con 11 mM de MgCl2.
  4. Mezclar 10-20 μl de la muestra con 20% de 6 x de buffer de carga (glicerol al 30% (v/v), 0.25% (p/v) azul de bromofenol, 0.25% (p/v) xileno cyanol FF) y cargarlos en los pocillos del gel de agarosa.
  5. Correr el gel a 70 V en el r.t. de 2.5 - 3 h.
  6. Visualizar el gel con un escáner de rayos UV.

4. negativa tinción microscopia electrónica de transmisión (nsTEM)

  1. Aplicar 5 μl de la nanoestructura diluida o el polyplex sobre una rejilla TEM Cu400 resplandor-descargado recubiertas de carbón. Dejar absorber durante aprox. 1 minuto.
  2. Drenar el exceso de líquido desde el borde de la rejilla por un pedazo de papel de filtro.
  3. Aplicar 5 μl de una solución acuosa 2% uranilo acetato y espere 1 minuto.
  4. Utilice el borde de papel de filtro para drenar completamente el líquido desde el borde de la cuadrícula.
  5. Deje que la parrilla seque completamente antes de inyectar en el TEM.

5. Polyplex formación

Nota: Ejemplo ilustrativo para la preparación de un polyplex compuesto por ADN origami y quitosano en relación N/P 0.01-8.

  1. Calcular el número de aminas por POLICATIÓN utilizando la fórmula-1 (tabla 1).
  2. Medir la concentración de origami de ADN purificado utilizando un espectrofotómetro ultra violeta a 260 nm. Utilice 2 μl de tampón de TB como el espacio en blanco para calibrar la máquina. Calcular la "nmol de fosfato" utilizando la fórmula 2.
  3. Preparar 15 μl de la estructura del ADN origami incluyendo 1 nmol de fosfato.
  4. Utilizar Fórmula 3 para calcular el volumen del kitosán, que es necesario para la preparación de la polyplex en N/P 0.01-8. Por ejemplo, para preparar el polyplex 8 N/P, se necesita 1,8 μl de quitosano (0,8 mg/mL) (N/P es 8 nmol de fosfato es de 1, peso molecular de quitosano es 5.000 g/mol, concentración de la solución madre de quitosano es de 0,8 mg/mL y el número de aminas por quitosano es 28). Añadir 13.2 μl de TB a 1,8 μl de quitosano (0,8 mg/mL). Añadir 15 μl de solución de quitosano (0,8 mg/mL) a 15 μl de origami de la DNA del paso 5.3 para obtener un ADN origami-quitosano polyplex con NP 8. El polyplex se forma espontáneamente.
  5. Repita el paso 5.4 preparar polyplexes en diferentes proporciones de N/P.
  6. Realice una edad como se describe en el paso 3 (figura 1A). Incluir el origami de ADN desnudo como control.
  7. La imagen la polyplex como se describe en el paso 4 (figura 2).

    Fórmula-1) número de grupos de la amina por POLICATIÓN
    figure-protocol-1

    Fórmula-2) mol de fosfato
    =figure-protocol-2

    Fórmula-3) Volumen (μL) de polycations
    =figure-protocol-3

6. desencapsulación con sulfato de dextrano

  1. Calcular el número de grupos sulfato por sulfato de dextrano usando formula-4 (tabla 2).
  2. Calcular el volumen de sulfato de dextrano para el decomplexation de polyplex en un predefinido A cociente de P utilizando la fórmula 5. La carga P proporción es la relación entre los grupos de sulfato de cargadaanión (A) a los grupos de fosfato (P) del origami de ADN. Una cantidad excesiva de sulfato de dextrano es necesario para una eficiente decomplexation de la polyplexes (p. ej. 500-1.000). Por ejemplo, a decomplex la polyplex preparado en la sección 5 (polyplex contiene 1 nmol de fosfato) en el A / 1.000 P, 3,6 μl de dextrán sulfato 40 kDa (50 mg/mL) se necesita (A / P es 1.000 nmol de fosfato es 1, el peso molecular del sulfato de dextrano 40.000 g/mol la concentración de la solución stock de sulfato de dextrano es de 50 mg/mL y el número de sulfato es 220). Añadir 3,6 μl de sulfato de dextrano (50 mg/mL) a la polyplex paso 5.4 y mezclar bien.
  3. Si trabaja con un quitosano polyplex, añadir NaOH para facilitar el proceso de decomplexation. Agregar NaOH a una concentración final de 10 mM. Omita este paso para LPEI polyplexes.
  4. Realice una edad como se describe en el paso 3 (figura 1B). Incluyen un origami de ADN desnudo y polyplex como control.

    Formula-4) número de grupos sulfato por Polyanión =
    figure-protocol-4

    Fórmula-5) Volumen (μL) de sulfato de dextrano
    =figure-protocol-5

7. estabilidad hacia la depleción de Mg

  1. Lavar 20 μl de un origami de ADN o la polyplex correspondiente (incluyendo 2 nmol fosfato) con 4 x 600 μl de tampón de Mg-cero (5 mM Tris, 1 mM EDTA y 30 mM NaCl) usando la columna de ultrafiltración (MWCO ~ 3 kDa). Girar cada colada a 14.000 g × a r.t. 3-5 minutos.
  2. Recoger la solución restante (80 μL) e incube a 37 ° C durante un día a 650 rpm en un Termomezcladores.
  3. Si pruebas LPEI polyplex, añadir 2,5 μl de MgCl2 (500 mM) para una concentración final de 16 mM de MgCl2. Añada 7 μl de dextrán sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a la A / 1.000 P) para desentrañar el núcleo nanoestructuras de ADN (decapsulation, ver paso 6).
    Nota: Omita este paso si se trabaja con quitosano polyplex o origami de ADN desnudo.
  4. Seguir nsTEM la proyección de imagen como se describe en el paso 3 (figura 2).

8. DNasa I ensayo de titulación de nanoestructuras de Origami de ADN desnudo

  1. Mezcla 3 μl de origami de ADN desnudo incluyendo 1 nmol fosfato con 2 μl de 10 x tubos de DNasa buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), 1 μl de MgCl2 (250 mM), 12 μl de agua de PCR de 0.2 mL. Añadir 2 μl de DNasa I (10 x). Ajustar la concentración stock de la DNasa I (10 x) para obtener final DNasa I concentraciones de 0.25-2 U/mL.
  2. Incubar las muestras a 37 ° C durante 1-2 h en un termociclador.
  3. Sumergir las muestras en hielo y desactivar la actividad de nucleolytic mediante la adición de 2 μl de 500 mM Ditiotreitol (DTT) y 2,5 μl de EGTA (33 mM).
  4. Analizar las muestras con una edad como se describe en el paso 3.

9. estabilidad de Polyplexes hacia la DNasa I

  1. Mezcle 4 μL de un polyplex (incluyendo 1 nmol de fosfato, preparado en diferentes proporciones de N/P) con 1,5 μl de una DNasa buffer (x 10), 8 μl de TB y 1,5 μl de DNasa I (100 U/mL) en una PCR de 0,2 mL del tubo.
  2. Incubar la muestra durante 24 h a 37 ° C en un termociclador.
  3. Añadir 2 μl de proteinasa K (20 mg/mL) digestión de la ADNsa I. Incubar 30 min a 37 ° C en un termociclador.
    Nota: en lugar de digestión enzimática, desactivación química de la ADNsa I por agregar 1,5 μl de TDT (500 mM) y 2 μl de EGTA (33 mM) puedo realizar.
  4. Añadir 3,6 μl de dextrán sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a la A / 1.000 P) para desentrañar el núcleo nanoestructuras de ADN.
  5. Realice edad como se describe en el paso 3 (Figura 3A, figura 3). Incluyen origami de ADN fresco como control para medir y comparar las intensidades de la banda en el gel.
  6. Suprimir la banda en la edad y el extracto el origami de ADN por una restricción de congelar columna de extracción basado en el protocolo suministrado por el proveedor.
  7. Seguir nsTEM la proyección de imagen como se describe en el paso 4 (figura 2).

10. estabilidad hacia el suero bovino Fetal (FBS)

  1. Mezcle 4 μL de origami de ADN desnudo o su correspondiente polyplex (incluyendo 1 nmol de fosfato) con 17 μl de TB + 10% FBS en PCR de 0,2 mL tubos. Utilizar equipos recién descongelada.
  2. Incubar la muestra a 37 ° c en un termociclador durante 24 h.
  3. Sumergir la muestra en un baño de hielo.
  4. Si pruebas el polyplex, realizar el proceso de desencapsulación añadiendo 3.6 μl de dextrán sulfato-40 kDa (50 mg/mL). Además, agregar NaOH si se trabaja con polyplexes de quitosano (ver paso 6.3)
  5. Realice una edad como se describe en el paso 3. Incluir el origami de ADN fresco como control para medir y comparar las intensidades de la banda en el gel.
  6. Suprimir la banda de la edad y el origami de ADN del extracto por una columna de extracción congelación de squeeze.
  7. Añadir 2 μl de proteinasa K (20 mg/mL) a la solución extraída del origami del ADN (20 μl) en un tubo PCR de 0,2 mL. Incubar durante 30 min a 37 ° C en un termociclador para digerir las proteínas del suero a las nanoestructuras.
  8. Lavar la muestra con 5 x 500 μl de TB incluyendo 16 mM MgCl2 utilizando la columna de ultracentrifugación (MWCO ~ 100 kDa) para lavar la proteinasa K (MW ~ 28,9 kDa) lejos. Girar cada colada a 14.000 g × a r.t. 3-5 minutos.
  9. Realizar la proyección de imagen nsTEM como se describe en el paso 4 (figura 3).
    Nota: La muestra extraída del gel del paso 10.6 puede ser utilizada directamente para la proyección de imagen de nsTEM. Sin embargo, la proyección de imagen puede ser muy difícil debido al acoplamiento de las proteínas del suero a las nanoestructuras de origami de ADN. Por lo tanto, se recomienda tratamiento de proteinasa K (pasos 10.7 10.9) para facilitar el proceso de proyección de imagen.

11. el direccionamiento de la enzima peroxidasa de rábano (HRP) de la prueba-functionalized Origami de ADN sobre la capa con Polycations

  1. Purificar el uno mismo-montado biotinilado-NR (biotina-NR) como se describe en el paso 2.
  2. Incubar 200 μL de biotina purificado-NR (36 nM, en 16 mM complementados buffer TB) con 200 μL de conjugado HRP-estreptavidina (540 nM, en solución tampón de TB). Añadir 4.8 μl de MgCl2 (500 mM) a una concentración final de 14 mM. Incubar a r.t. por 12 h a 650 rpm en un Termomezcladores
  3. Purificar el HRP-functionalized NR (HRP-NR) por un método de purificación PEG (como se describe en el paso 2) para eliminar las enzimas HRP independientes. Resuspender el precipitado HRP-NR en TB incluyendo 16 mM MgCl2.
  4. Μl de la mezcla 6,5 de purificada HRP-NR (36 nM) con 6,5 μl de polycations de las concentraciones de variante para preparar el polyplex en relación N/P de 1, 2, 4, 10 y 20 (usando Fórmula 3).
  5. Repita pasos 11.2 11.4 no biotinilado NR. Como la enzima HRP puede obligar a no específicamente al origami de ADN, el origami de ADN biotinilado no, que se trata con enzimas HRP y PEG purificada (similar a biotina-NR), servirá como testigo en el ensayo.
  6. 6.5 mezcla μl de agua destilada con 6,5 μl de polycations de variante concentraciones correspondientes a las proporciones definidas de N/P de 1, 2, 4, 10 y 20. Muestras de tesis sirvan como el grupo blanco.
  7. Agregar la solución preparada en pasos 11.4-11.6 (12.5 μl) a una placa de 96 pocillos, incluyendo 72,5 μl de tampón HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH de 0.05% Tritón X-100, DMSO 1%, 7.4) y mezclar bien.
  8. Añadir 10 μl de 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Añadir 5 μl de H2O2 (12 mM) y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo. H2O2 inicia la reacción.
  10. Medir la absorbancia a 421 nm durante 4 h con un lector de placas multimodo (Figura 4A).

12. prueba la direccionabilidad de unión a la hemina aptámeros (HBA)-functionalized Origami de ADN sobre la capa con Polycations

  1. Purificar el HBA funcionalizados-NR (HBA-NR) como se describe en el paso 2. Resuspender el precipitado HBA-NR en TB con 6 mM de MgCl2 (mayor concentración de sal conduce a la agregación de HBA-NR).
  2. Mezclar 10 μl de HBA-NR (40 nM) con 10 μl de polycations a diferente concentración a preparar polyplex de proporciones definidas de N/P de 1, 2, 10 y 20.
  3. Mezclar 10 μl de desnudo-NR (40 nM) o agua destilada con 10 μl de polycations en concentraciones variables correspondientes a la relación N/P de 1, 2, 10 y 20.
  4. Agregar la solución de 20 μl preparado de pasos 12.2 y 12.3 a la placa de 96 pocillos, incluyendo 60 μL de tampón HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH de 0.05% Tritón X-100, DMSO 1%, 7.4) y mezclar bien. Incluir al menos una muestra en blanco, reemplazar la solución de polyplex o POLICATIÓN 20 μl (de pasos 12.2 y 12.3) con agua.
  5. Añadir 5 μl de la hemina (0,04 mM) seguido de 10 μl de ATBS (15 mM). Colocar la placa sobre un agitador orbital durante 5 minutos.
  6. Añadir 5 μl de H2O2 (12 mM) y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.
  7. Medir la absorbancia a nmover 421 30 min con el lector multimodo (Figura 4B).

Resultados

Se diseñaron tres nanoestructuras de origami de ADN de diferentes configuraciones, incluyendo un nanorod (NR), un nanobottle (NB) y una nanoestructura de estructura metálica (WN) (los modelos 3D de las nanoestructuras se ilustran en la figura 2). El NR y el NB se diseñaron basándose en un enrejado cuadrado y panal, respectivamente, utilizando caDNAno17 y el WN se creó utilizando el software de Daedalus18. Un protocolo integral para el diseño y montaje propio de nanoestructuras de ADN ha sido ya publicado19,20,21,22. La grapa de forma específica filamentos se ordenó, uno montados y más purificados basado en un protocolo descrito por Stahl et al. 23 (paso 2).

Polyplexes se caracterizaron por el gel retraso análisis y proyección de imagen de nsTEM. Al mezclar el origami de ADN con el polycations, un cambio en la banda de nanoestructura desnuda hacia el cátodo se observó (figura 1A). Esto se puede atribuir al equilibrado de la carga negativa de fosfato aumentan grupos a unirse a polycations y el tamaño total del complejo. Agregar una cantidad extra de polianiones como el sulfato de dextrano puede revertir la formación de polyplex. En este sentido, sulfato de dextrano de peso molecular más alto (MW ~ 40 kDa) demostró ser más eficiente para el decomplexation comparado con sulfato de dextrano de bajo peso molecular (MW ~ 4 kDa) (figura 1B).

Mientras que la proyección de imagen polyplexes LPEI por tinción negativa de acetato de uranilo TEM, era difícil a la imagen de las partículas. Fue presumido que LPEI pueda interferir con acetato de uranilo de unión a la espina dorsal del fosfato debido a la estrecha protección de origami de ADN. Por lo tanto, antes de la proyección de imagen de nsTEM, una cantidad excesiva de sulfato de dextrano fue añadida al LEPI polyplexes. Las nanoestructuras de origami de ADN desentraña no demostraron ninguna muestra de defecto ni descomposición. Por el contrario, polyplexes de quitosano fueron reflejadas con éxito sin necesidad de tratamiento Polyanión (figura 2).

Nanoestructuras de ADN desnudos todos (independientemente de sus distintas configuraciones) fueron desnaturalizados totalmente después de un día de incubación a 37 º C en buffer Mg-cero, según lo confirmado por proyección de imagen de nsTEM. Por el contrario, nanoestructuras con LPEI o quitosano en N/P≥1 permanecieron intacta. Asimismo, DNasa I titulación ensayos demostraron la susceptibilidad de nanoestructuras desprotegido hacia la digestión enzimática. Mientras desnudas nanoestructuras fueron totalmente digeridos en presencia 1 DNasa U/mL después de 2 h, LEPI o quitosano origami de ADN había encapsulado se quedo intacta en Mg-cero buffer suplementado con 10 U/mL DNasa I durante un mínimo de un día (figura 2). Mayor estabilidad a la digestión nucleolytic fue alcanzada por aumento de la relación N/P de la polyplexes. Además, LPEI protege las nanoestructuras de ADN más eficientemente en comparación con el quitosano (figura 3A, figura 3C), probablemente debido a la mayor densidad de carga de LEPI y por lo tanto, mayor afinidad hacia el ADN24 . No se observaron diferencias al usar LPEI de diferente peso molecular (figura3B).

El direccionamiento de grupos funcionales en nanoestructuras de ADN después de encapsulado en una carcasa de polímero es una característica importante. Además, se examinó la compatibilidad de la capa del POLICATIÓN con la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y la Unión a la hemina aptámeros (HBA) funcionalizados ADN origami. Tres líneas discontinuas biotinilado se salía de la superficie de la NR y luego funcionalizados con streptavidin HRP conjugada (tres enzimas por origami de ADN). El catalítico altamente activo (Kd: 439 nM) HBA aptámeros PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') fue elegido para estos experimentos25. Hasta 24 líneas discontinuas se salía de la superficie NR con un enlazador de 5 nm de longitud (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') seguido de la PS2. M secuencia (24 aptámeros por origami de ADN). Ningún obstáculo notable de enzimática o aptámeros actividad fue observada sobre capa de origami de la DNA funcionalizados HRP o HBA con LPEI y quitosano en variante de proporciones (figura 4A-B) N/P16. Sin embargo, la cinética de la enzima HRP ha sido dramáticamente cambiada después al origami de ADN (figura 4C).

figure-results-1
Figura 1 : Imágenes representativas de la edad de formación polyplex y desencapsulación. (A) el ensayo de cambio de movilidad electroforética para NB mezclado con quitosano en relación N/P de 0.01-8. Cada compartimento contiene 1 nmol NB. La primera vía es la referencia NB. (B) desencapsulación de polyplexes por sulfato de dextrano polyanionic (DS). Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2 : Mancha negativa las fotografías TEM de origami de ADN y polyplexes. Imágenes 3D de la modelo y nsTEM de nanoestructuras de origami de ADN desnudo (columnas 1 y 2). micrografías de nsTEM de polyplexes LPEI (después decapsulation) y quitosano polyplexes (columnas 3 y 4). nsTEM imágenes de origami de ADN desnudo y protegido (polyplex) sometidas a depleción de Mg (columnas 5, 6 y 7), degradación enzimática (columnas 8 y 9), digestión del suero (columnas 10 y 11) un día a 37 ° C. LPEI-5 kDa fue utilizado en este ensayo. Nanoestructuras de ADN desnudos se degrada más allá de la detección en una edad en la presencia de 1 U/mL DNasa I o TB + 10% FBS después de 2 h de incubación a 37 ° C. Barras de escala: 100 nm. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3 : Resultados representativos de la ADNsa I ensayos de protección. (A) la ADNsa I ensayo de protección para el polyplexes de WN con LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa y LPEI-25 kDa en relación N/P de 2, 4, 8 y 10. Las muestras fueron sometidas a 10 U/mL DNasa I para 24 h a 37 ° C. El último carril es el control WN. Los polyplexes fueron decapsulated antes de cargar el gel. (B) la intensidad de la banda media normalizada para polyplexes de loros de DNA con diferente LPEI extraído de edad imagen-A. El eje Y representa la intensidad de banda media normalizada. (C) la ADNsa I ensayo de protección de quitosano-WN polyplexes preparado en N/P ratios de 1, 2, 4, 10 y 20. Las muestras fueron sometidas a 10 U/mL DNasa I para 24 h a 37 ° C. 6 Lane es el control polyplex (N/P 20). El último carril es el control WN. Todos polyplexes de quitosano fueron decapsulated previa carga en el gel. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: resultados de la representante de análisis de origami colorimétrico funcionalizados del enzima y del aptámero de ADN. (A) el ensayo colorimétrico de nanoestructuras funcionalizadas de enzima (HRP-NR) cubierto con Quitosan 3,7 h después del comienzo de la reacción. (B) ensayo colorimétrico de nanoestructuras funcionalizadas aptámeros (HBA-NR) cubierto con Quitosan, 6 minutos después de la iniciación de la reacción. El eje Y representa la absorbancia normalizada. (C) supervisar el ensayo colorimétrico de HRP y HRP-NR con el tiempo. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Polímeros catiónicosQuitosanoLPEI-5 kDaLPEI-10 kDaLPEI-25 kDa
Peso molecular del polímero (kDa)551025
Peso MOLECUALR de monómero (g/mol)161434343
Número de Amina por monómero1111
Número de Amina por polímero28116232581

Tabla 1. Cálculo del número de grupos de la amina por POLICATIÓN.

Peso molecular del sulfato de dextrano (kDa)440
Peso molecular del monómero (g/mol)366366
Número de sulfato por monómero22
Número de sulfato por polímero22220

Tabla 2. Calcular la cantidad de grupos sulfato por Polyanión.

Discusión

En la uno mismo-Asamblea de origami de ADN, las hebras discontinuas típicamente agregan en 5-10 relación exceso al andamio. Estas hebras discontinuas exceso también se unen a la polyplexes en la gama monometer POLICATIÓN y forma que son más difíciles de separar del ADN origami polyplexes. Por lo tanto, un paso crítico en la formación de polyplex es quitar las hebras discontinuas exceso y utilizar nanoestructuras de origami de ADN bien purificada.

Otros métodos se han desarrollado para la estabilización de nanoestructuras de ADN como la ciclización de hebras de ADN mediante una reacción de clic26. Como hebras discontinuas alquino y modificado de la azida son necesarios para la formación de anillos entrelazados de monocatenario, esta técnica es limitada para la estabilización de pequeñas nanoestructuras tal catenane de ADN, y no es fácilmente escalable para mayor origami de ADN estructura tales como los utilizados en el presente Protocolo. Recientemente, Gerling et unal.27 informó un método para crear ciclobuteno covalente pirimidina dimer (CPD) vínculos entre vecinos thymidines en nanoestructuras de ADN mediante la irradiación ultravioleta. Aunque este método es selectivo de sitio y escalable, su eficacia en la protección de origami de ADN es mucho menor que la capa del POLICATIÓN. Por ejemplo, objetos de origami de ADN CPD-estabilizado soportan sólo 0,4 U/mL DNasa I para 1 h, mientras que polyplexes eran estables en presencia de 10 U/mL DNasa I para al menos un día.

En Resumen, la terapia génica inspirado chitosan y LPEI capa es un bajo costo, un solo paso y eficiente método para abordar la estabilidad a largo plazo de nanoestructuras de origami de ADN en Mg-agotado y nucleasa medios enriquecidos. La reversibilidad de la formación polyplex facilita su aplicación en pasos múltiples pruebas diagnósticas donde la protección de origami de ADN contra nucleolytic la degradación o agotamiento de la sal es crucial en un solo paso pero puede causar problemas en otros pasos como ADN amplificación. Además, POLICATIÓN capa es un enfoque potencial para la mejora de la captación celular de nanoestructuras de origami de ADN para aplicaciones de administración de medicamentos28.

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés relacionados con este informe.

Agradecimientos

Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo acuerdo no. 686647 de la subvención. Imágenes TEM se registraron en un Morgagni a 80 kV en el centro de EM de la Vienna Biocenter base instalaciones GmbH (VBCF). Nos gustaría agradecer a Tadija Kekic por asistencia en el diseño gráfico y Elisa De LIano para el diseño de la nanoestructura de estructura metálica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 veces; Tampón de reacción de DNasa INew England Biolab (NEB)B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-ácido 6-sulfónico) sal diamónica)Alfa AesarJ65535
Columnas de ultracentrifugación AmiconMerck Millipore UCF500308, UCF510024
Oligosacárido de quitosano lactato (Mn ~ 4000-6000, > 90% desacetilado, 60%. Composición oligosacáridoSigma-Aldrich523682
hebras de fibra específicas de diseñoIntegrate DNA Technologies (IDT)
Sal sódica de sulfato de dextrano (Mr ~ 4 kDa)Sigma-Aldrich75027
Sal sódica de sulfato de dextrano (Mr ~ 40 kDa)Sigma-Aldrich42867
Colorante de carga de gel de ADN (6 veces;)ThermoFischer sceintificR0611
DNasa I (sin RNasa)New England Biolab (NEB)M0303
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)Sigma-AldrichE3889
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) BioUltra, anhidro, ≥ 99% (valoración)Sigma-AldrichEDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extracción Columnas de centrifugadoBiorad7326165
HeminSigma-AldrichH9039
HEPESSigma-AldrichH3375
Slución de perixde hidrógeno (32% en peso)Sigma-Aldrich216763
LPEI-25 kDaPolysciences, Inc23966-1
NuPAGE Agente reductor de muestras (500 mM de ditiotreitol (DTT))ThermoFischer sceintificNP0004
Polietilenglicol (PEG, MW ~ 8000 Da)Carl RothO263.1
Polietileno, lineal, promedio Mn 10,000, PDI ≤ 1.2Sigma-Aldrich765090
Polietilenimina, lineal, promedio Mn 5.000, PDI ≤ 1.3Sigma-Aldrich764582
Proteinasa K solución (20 mg/ml)ThermoFischer sceintificAM2548
HRP conjugado con estreptavidinaThermoFischer sceintificN100
SYBER tinción de gel de ADN seguraThermoFischer sceintificS33102

Referencias

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