Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.
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Artículo de método
Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host
En este artículo
Resumen
Resumen
Hay una variedad de estrategias de patógenos bacterianos que se emplean para sobrevivir y proliferar una vez dentro de la célula eucariota. El supuesto 'citosólicas' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, pseudomallei de Burkholderia, Francisella tularensisy Rickettsia spp.) tengan acceso al citosol de la célula infectada por físicamente y enzimático degradando la membrana primaria de vacuolares. Una vez en el citosol, estos patógenos tanto proliferan, así como generan fuerzas mecánicas suficientes para penetrar en la membrana plasmática de la célula huésped para poder infectar nuevas células. A continuación, os mostramos cómo esta etapa terminal del ciclo celular de infección de L. monocytogenes (Lm) puede ser cuantificada por ensayos de unidad formadora de colonias y citometría de flujo y dar ejemplos de cómo ambos efectos de factores codificados de patógeno y huésped esto proceso. También mostramos una correspondencia estrecha de Lm dinámica de infección de cultivos de células infectadas in vitro y los de las células hepáticas derivadas de ratones infectaron in vivo. Estos ensayos de función son relativamente simples y pueden fácilmente ampliarse para pantallas de alto rendimiento basado en el descubrimiento de moduladores de la función de la célula eucariota.
Introducción
Modelos experimentales de infección son inherentemente difíciles debido a su dependencia de las condiciones iniciales del estado de la hostia, patógeno, las diversas estrategias de infección del patógeno y la dificultad de atribuir los procesos impulsados por el anfitrión y el patógeno basado en los resultados. La bacteria Listeria monocytogenes (Lm) se ha convertido en un patógeno ideal para sondear respuestas de defensa del anfitrión debido a su maleabilidad genética y microbiológica, su estrategia de infección celular rápida y procesual y el relativamente claro relación entre sus fenotipos de infección del nivel celular y organísmica. La infección....
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Protocolo
Ratones fueron tratados humanamente conforme a todas las directrices gubernamentales apropiadas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y su uso fue aprobados para este estudio todo en el cuidado de los animales institucional Universidad de Miami y el Comité uso (protocolo 16-053).
1. preparar las células para la infección
- Propagar la línea macrófago-como célula de ratón RAW 264.7 en medios de cultivo tisular DMEM suplementados con 10% de suero fetal de ternero (en adelante denominado DMEM/FCS) utilizando un matraz de 125 mL y una incubadora de cultivo de tejidos mantenidos a 37 °C/5%....
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Resultados
Evaluación del papel de patógeno y codificada en host factores que afectan la infección celular
Usando las condiciones de infección descritas, 0.15% de la entrada de tipo salvaje Lm se recupera después de 1,5 h de incubación conjunta con macrófagos cultivados (figura 1A). En el subsecuente de 1,5 h de incubación Co (3 h post infección, hpi), hubo un aumento de 4 veces en la recuperación de viable Lm y de .......
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Discusión
Debido a su programa de infección celular rápida y procesual, Lm es un patógeno ideal para actividades celulares que afectan a la infección. Se han identificado una serie de factores del huésped que afectan ya sea positiva o negativamente a Lm infección celular11,12,13,14. Estos dos host factores caracterizados en nuestro laboratorio, Perforin-2 y el hemo regulados inhibidor (.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Búfer de lisado ACK | Gibco | ||
| Perlas de compensación reactiva de amina ArC | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) caldo | EMD Milipore | 110493 | |
| Colador de Células, 70 µ m | VWR | 10199-656 | |
| Colagenasa D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| Tubos FACS | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Calor inactivado | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks' Solución salina equilibrada | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Células de cultivo MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas amarillas fijables | Life Technologies | L349S9 | |
| Faloidina de rodamina | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Jeringa | Sony | ||
| 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Cultivo de tejidos 48 placas de pocillos | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Cultivo de Tejidos 6 Placas de Pocillos | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| antígeno | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilución = 1/100, Clon = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilución = 1/100, Clon = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilución = 1/100, Clon = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilución = 1/100, Clon = BM8 | |
| Invitrogen | Vivo/MuertoFlurocromo = AmCyN, dilución = 1/100 | ||
| Ly6C | Biolegend | Flurocromo = PacBlue, dilución = 1/200, clon = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurocromo = AF 700, dilución = 1/200, clon = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | biolegend | flurocromo = BV 605, dilución = 1/100, clon = PK136 |
Referencias
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular ....
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Reimpresiones y permisos
