Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

Resumen

Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.

Resumen

Hay una variedad de estrategias de patógenos bacterianos que se emplean para sobrevivir y proliferar una vez dentro de la célula eucariota. El supuesto 'citosólicas' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, pseudomallei de Burkholderia, Francisella tularensisy Rickettsia spp.) tengan acceso al citosol de la célula infectada por físicamente y enzimático degradando la membrana primaria de vacuolares. Una vez en el citosol, estos patógenos tanto proliferan, así como generan fuerzas mecánicas suficientes para penetrar en la membrana plasmática de la célula huésped para poder infectar nuevas células. A continuación, os mostramos cómo esta etapa terminal del ciclo celular de infección de L. monocytogenes (Lm) puede ser cuantificada por ensayos de unidad formadora de colonias y citometría de flujo y dar ejemplos de cómo ambos efectos de factores codificados de patógeno y huésped esto proceso. También mostramos una correspondencia estrecha de Lm dinámica de infección de cultivos de células infectadas in vitro y los de las células hepáticas derivadas de ratones infectaron in vivo. Estos ensayos de función son relativamente simples y pueden fácilmente ampliarse para pantallas de alto rendimiento basado en el descubrimiento de moduladores de la función de la célula eucariota.

Introducción

Modelos experimentales de infección son inherentemente difíciles debido a su dependencia de las condiciones iniciales del estado de la hostia, patógeno, las diversas estrategias de infección del patógeno y la dificultad de atribuir los procesos impulsados por el anfitrión y el patógeno basado en los resultados. La bacteria Listeria monocytogenes (Lm) se ha convertido en un patógeno ideal para sondear respuestas de defensa del anfitrión debido a su maleabilidad genética y microbiológica, su estrategia de infección celular rápida y procesual y el relativamente claro relación entre sus fenotipos de infección del nivel celular y organísmica. La infección celular de Lm procede a través de cuatro fases¹: (i) invasión celular que concluye con Lm encasillarse dentro de una vacuola; (ii) Lm-dirigido de la disolución de la membrana de la vacuola y lanzamiento de Lm en el citosol; (iii) intracitosólico replicación; y la penetración física (iv) de la membrana plasmática que resulta en cualquiera de los dos la infección de células directamente adyacentes (tales como una hoja epitelial) o en células solitarias, lanzamiento de Lm en el medio extracelular. Cada una de estas fases son promovidos por específicos Lm-codifican factores (denominados 'factores de virulencia') que, cuando borra, causar infección defectos en modelos celulares y animales. Esta estrategia de infección general se ha desarrollado independientemente por un número de los llamados patógenos 'citosólica'².

Formadoras de colonias (UFC) de unidad ensayos se emplean extensamente para evaluar tanto in vitro (es decir, celular), así como in vivo (es decir, organísmica) los resultados de la infección. Además de su alta sensibilidad, particularmente para infecciones en vivo, UFC ensayos proporcionan una lectura inequívoca para la invasión de patógenos y supervivencia/proliferación intracelular. Ensayos de UFC se han utilizado para analizar los determinantes de célula Lm y host que afectan a la infección. Tan informativo como han sido estos estudios previos analizar la invasión celular y replicación intracitosólico, ensayos de UFC no, a lo mejor de nuestro conocimiento, se han utilizado para seguimiento de la cuarta fase del proceso de infección de Lm : escape celular. Aquí, describimos relativamente simple vía de escape como celular (en lo sucesivo, 'aparición') puede ser controlado por análisis de UFC (así como por el flujo cytometry) y mostrar ejemplos de cómo ambos factores codificados de patógeno y huésped regulan esta fase de la Lm ciclo de infección. El análisis de la fase terminal del ciclo celular de infección de Lm puede posibilitar identificar patógeno adicional y anfitrión célula específica de infección factores y actividades.

Protocolo

Ratones fueron tratados humanamente conforme a todas las directrices gubernamentales apropiadas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y su uso fue aprobados para este estudio todo en el cuidado de los animales institucional Universidad de Miami y el Comité uso (protocolo 16-053).

1. preparar las células para la infección

1. Propagar la línea macrófago-como célula de ratón RAW 264.7 en medios de cultivo tisular DMEM suplementados con 10% de suero fetal de ternero (en adelante denominado DMEM/FCS) utilizando un matraz de 125 mL y una incubadora de cultivo de tejidos mantenidos a 37 °C/5% CO₂.
2. El día antes de la infección, use un raspador celular para eliminar las células del frasco de expansión y recoger en un tubo cónico de 15 mL tapón. Centrifugar las células a 800 x g por 10 min, decantar el sobrenadante y suspender el precipitado de células en 1 mL de DMEM/FCS (sin antibióticos) y determinar su titulación utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
3. Ajustar el título a 2 x 10⁶ células/mL y añadir 0,10 mL (2 x 10⁵ células) a los pocillos de una placa de cultivo de tejido bien 48. Asegúrese de que la suspensión de células cubre toda la superficie del pozo.
   1. Células de la placa en pozos adicionales para un origen posterior de medios condicionados. También colocar 0,10 mL de DMEM/FCS en tres pozos adicionales para servir como un 'no control de la célula'.
4. Incubar durante una noche en una incubadora de cultivo de tejidos en 37 °C/5% CO₂. Al día siguiente, no quite de la incubadora hasta que el inóculo de la bacteria está preparado y listo para usar.

2. preparación de Listeria monocytogenes (Lm) para la infección

1. Inocular 2 mL de infusión de cerebro corazón (BHI) con una sola Colonia de una placa de agar recién rayado (< 2 días) de Lm e incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 130 vueltas/min.
2. Al día siguiente, Añadir 0,10 mL de la cultura durante la noche a 2 mL previamente calentado BHI y continuar incubando a 37 ° C con agitación hasta que la densidad óptica (OD₆₀₀) esté entre 0.4 y 0.6.
3. Determinar titulación bacteriana aproximada usando una fórmula de conversión derivado empíricamente. En nuestro laboratorio, una exponencial creciente cultura de Lm en BHI es aproximadamente 1,3 x 10⁹ colonias formando unidades (UFC) /do₆₀₀. Minimizar la cantidad de tiempo que las culturas bacterianas están expuestas a temperatura ambiente.
4. Justo antes de la infección ajustar el título a 5 x 10⁷ UFC/mL con DMEM/FCS precalentado como diluyente.

3. infección

1. Trabajar de forma rápida y precisa, añadir 20 μl (1 x 10⁶ UFC; multiplicidad de infección, MOI = 5) del recién preparado Lm inóculo (paso 2.4 arriba) a los pocillos inclinando ligeramente el plato y cuidadosamente colocando la punta de la pipeta en los medios de comunicación que lo recubre;
   Nota: evitar tocar las paredes del pozo con la punta de la pipeta.
2. Suavemente pipeta el contenido de cada pocillo para completa mezcla; No agite ni inclinación significativamente la placa como esto extenderá Lm sobre las paredes del pozo. Devuelva la placa de cultivo celular a 37 °C/5% CO₂ incubadora.
3. Preparar una solución de gentamicina 10 μg/mL usando medios condicionados de pozos no infectadas como diluyente.
4. A los 30 minutos post infección (mpi), cuidadosamente Añadir 30 μl de la solución de gentamicina (concentración final 2.5 μg/mL) y pipeta el contenido del así como antes y la placa de cultivo celular vuelta a 37 °C/5% CO₂ incubadora.
5. En mpi 60, cosecha pocillos adecuados para ensayo de UFC (momento mpi 60) o análisis FCM (como se describe a continuación en las secciones 4 y 5, respectivamente).
6. Para los pozos restantes, en varias ocasiones después de eso ya sea células como antes o para el análisis de la aparición de Lm totalmente retirar los medios de comunicación bien y reemplazar con 150 μL de medios condicionados gentamicina-libre de la cosecha.

4. toma de muestras, procesamiento y análisis de intracelular y emergentes Lm por ensayo de UFC

1. Para cosechar, Incline levemente el plato y retire con cuidado los medios de comunicación todo el pozo. Añadir 0,50 mL de agua destilada estéril (dsH₂O) al pozo. Después de 30 s, transferir el lisado de agua resultante (10⁰) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y agitar vigorosamente por 10 s.
2. Preparar 10^-1 y 10^-2 diluciones agregando ya sea 4.5 μl o 50 μl de agua lisado a 450 μl de dsH₂O y brevemente vortex para asegurar una mezcla completa.
3. Extensión 50 μl del 10⁰, 10^-1 y 10^-2 muestras en placas de agar caldo (LB) de lisogenia.
4. Ensayo de emergentes Lm (paso anterior 3.6), quitar 10 μl de los medios de comunicación de sobreposición y dividirlo en alícuotas de dos 5 μl: a una parte alícuota añadir 5 μl de DMEM/FCS y a la segunda alícuota agregar 5 μl de DMEM/FCS que contiene 5 μg/mL gentamicina. El control de este último distingue entre extracelular Lm (gentamicina sensible) e intracelular Lm (gentamicina resistente) en el UFC posteriores análisis.
5. Después de 5 min a temperatura ambiente, agregar 90 μl de dsH₂O, vortex vigorosamente durante 10 s y extensión 50 μL en placas de agar LB.
6. Enumerar Lm colonias en placas de agar LB después de 2 días de incubación a 37 ° C.

5. toma de muestras, procesamiento y análisis de intracelular y emergentes Lm por citometría de flujo (FCM)

1. Preparar RAW 264.7 células como se describe en los pasos 1.1-4. Ajuste las células 1 x 10⁶ células/mL y añadir 1 mL (1 x 10⁶ células) a los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos.
2. Preparar el inóculo de la bacteria como se describe en el paso 2.1-2.3 e infectar células con volumen de inóculo correspondiente a un MOI de 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. En 1,5 horas post infección (hpi), recogen los medios de comunicación del primer conjunto de pozos y coloque en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 500 μl de paraformaldehído al 4% (PFA) y coloque en hielo hasta que todos los pozos han sido procesados.
4. Para recoger intracelular Lm, añadir 1 mL de dsH₂O al pozo y después de 60 s, transferir el lisado de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 500 μl de 4% PFA. Vortex vigorosamente durante 10 s y el lugar en el hielo hasta que todos los pozos han sido procesados. (Procesamiento de las muestras se describe en el paso por debajo de 5.8).
5. Para los pozos restantes, eliminar los medios de comunicación y reemplazar con 1 mL de DMEM/FCS con 5 gentamicina μg/mL para matar extracelular Lm y volver rápidamente las células a incubadora.
6. Después de 30 min (2 hpi) quitar medios y reemplazar con DMEM/FCS sin gentamicina.
7. Después de 2 y 4 h (hpi de 4 y 6) tomar la segunda y tercera vez puntos recogiendo los medios de comunicación y lisados como pasos 5.3 y 5.4.
8. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 7 minutos eliminar sobrenadante sin pellets inquietante.
9. Suspender cada sedimento en Cóctel de 50 μl de 4% la coloración PFA y 15 μl de phalloidin. Incubar los tubos en la oscuridad a 4 ° C por 20 minutos.
10. Después de la incubación añadir 1 mL de tampón FACS a cada tubo y pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
11. Girar los tubos a 10.000 x g durante 7 minutos eliminar sobrenadante sin pellets inquietante.
12. Suspender cada pellet en 400 μL de tampón FACS para uso inmediato, o 200 μL de tampón FACS y 200 μL de 4% PFA si la almacena para su posterior análisis.
13. Ejecutar las muestras una por citometría de flujo y analizar los datos recogidos.

6. toma de muestras, procesamiento y análisis de la colonización de Lm y las respuestas de Host en el hígado

1. Preparar la Lm para la infección como se describe en el paso 2.1-2.3.
2. Calcular la cantidad necesaria de subcultura para deseado título de 3 x 10⁶ UFC/mL.
3. Justo antes de la infección diluir la cantidad de bacterias calculadas con precalentado de Hank balanceado sal solución (HBSS) en un volumen final de 1 mL. Este es el inóculo de entrada que se inyecta en el ratón.
4. Utilizando una jeringa de insulina de 100U G½ 28, dibujar 100 μl (3 x 10⁵ UFC) del inóculo de entrada y eliminar cualquier burbuja de aire visible.
5. Coloque el ratón (cepa C57BL/6; los machos entre 6 y 12 semanas de edad) en el sistema de seguridad de tenencia y utilice agua tibia (no más de 45 ° C) para dilatar la vena de la cola, luego inyecte el inóculo entrado en la vena.
6. Placa 10^-2 y 10^-3 diluciones del inóculo entrada en placas de LB agar 10bcm e incubar durante una noche a 37 ° C para determinar la dosis de entrada actual.
7. A las 18 hpi, eutanasia humanamente ratón (CO₂ asfixia seguida por dislocación cervical) y peritoneo de ratón abierto corte tijera estéril para recoger del lóbulo frontal del hígado usando pares independientes de pinzas y tijeras para el exterior y dentro de el ratón. Colocar el hígado en una placa de Petri en el hielo de 6 cm.
8. Cortar el hígado en cubos pequeños y colocar en un frasco de vidrio con una barra de agitación magnética. Añadir 2 mL de colagenasa de 2 mg/mL D reconstituido en DMEM sin FCS. Incube los frascos a 37 º C en un agitador magnético para 30−45 min. Una vez que el tejido está homogeneizado, añadir 3 mL de DMEM/FCS para inactivar la colagenasa.
9. Filtrar las células a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo cónico, agregar DMEM/FCS más si es necesario.
10. Centrifugar las células a 800 x g de pellets a 4 ° C durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y suspender el precipitado de células en 500 μl de tampón ACK para lyse las células de sangre rojas.
11. Incube las células a temperatura ambiente durante 5 minutos en buffer ACK. Suspender las células en 1 mL de DMEM/FCS.
12. Centrifugar las células a 800 x g de pellets a 4 ° C durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y suspenda en 1 mL de DMEM/FCS. Entonces, contar las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
13. Transferencia de 1 x 10⁶ células tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y vuelta a la pelotilla. Luego suspender en 1 mL de dsH₂O y de vortex para lisar las células. Placa 50 μL en placas de LB en sin diluir y 10^-2 diluciones e incubar a 37 ° C para enumerar Lm para análisis de UFC.
14. Transferir 1 x 10⁶ células FACS tubos para cada muestra de tejido según las cuentas de celular y con 1 mL de tampón FACS.
15. Centrifugar las células a 800 x g de pellets a 4 ° C por 10 min y retirar el sobrenadante.
16. Preparar un cóctel de anticuerpos que contiene los anticuerpos de interés basándose en la concentración recomendada para cada anticuerpo y tampón FACS. Consulte Tabla de materiales utilizados en el análisis de cantidades recomendadas.
17. Suspender el sedimento en 100 μl de anticuerpo cóctel e incubar tubos en la oscuridad a 4 ° C por 30 minutos.
18. Después de la incubación, añada 2 mL de tampón FACS a cada tubo y suspender las células.
19. Centrifugar las células a 800 x g de pellets a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Luego suspender el pellet en 400 μL de tampón FACS para uso inmediato, o 200 μL de tampón FACS y 200 μL de 4% PFA si va a guardar para más tarde.
20. Analizar las células mediante citometría de flujo (ver paso 5.13).

Resultados

Evaluación del papel de patógeno y codificada en host factores que afectan la infección celular
Usando las condiciones de infección descritas, 0.15% de la entrada de tipo salvaje Lm se recupera después de 1,5 h de incubación conjunta con macrófagos cultivados (figura 1A). En el subsecuente de 1,5 h de incubación Co (3 h post infección, hpi), hubo un aumento de 4 veces en la recuperación de viable Lm y de ...

Discusión

Debido a su programa de infección celular rápida y procesual, Lm es un patógeno ideal para actividades celulares que afectan a la infección. Se han identificado una serie de factores del huésped que afectan ya sea positiva o negativamente a Lm infección celular^11,12,13,14. Estos dos host factores caracterizados en nuestro laboratorio, Perforin-2 y el hemo regulados inhibidor (...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Búfer de lisado ACK	Gibco
Perlas de compensación reactiva de amina ArC	Life Technologies	A10346
BHI (Brain Heart Infusion) caldo	EMD Milipore	110493
Colador de Células, 70 µ m	VWR	10199-656
Colagenasa D	Roche	11088858001
DMEM media	Gibco	11965-092
Tubos FACS	BD Falcon	352054
FBS - Calor inactivado	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' Solución salina equilibrada	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB agar	Células de cultivo MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas amarillas fijables	Life Technologies	L349S9
Faloidina de rodamina	Thermo Fischer	R415
SP6800 Jeringa	Sony
28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP Cultivo de tejidos 48 placas de pocillos	MIDSCI	TP92048
TPP Cultivo de Tejidos 6 Placas de Pocillos	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
antígeno
CD11b	Biolegend		Flurochrome = PE Cy5, Dilución = 1/100, Clon = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrome = AF 647, Dilución = 1/100, Clon = N418
CD45	Biolegend		Flurochrome = APC Cy7, Dilución = 1/100, Clon = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrome = PE, Dilución = 1/100, Clon = BM8
Invitrogen			Vivo/MuertoFlurocromo = AmCyN, dilución = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurocromo = PacBlue, dilución = 1/200, clon = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurocromo = AF 700, dilución = 1/200, clon = M5/114.15.2
NK 1.1	biolegend		flurocromo = BV 605, dilución = 1/100, clon = PK136