Artículo de método

Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

DOI:

10.3791/58806

⸱

26 de enero de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial terapéutico considerable y atraen creciente interés en el campo biomédico. MSCs son originalmente aislados caracterizados de la médula (BM), y adquirió de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB) y del cordón umbilical (Cu). MSCs son una población heterogénea de células con capacidad para (1) adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar, expresión de marcadores (2) superficie de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenotipos de /HLA-DR– –y (3) diferenciación del trilineage en adipocitos, osteocitos y condrocitos, tan definidos por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT). Aunque el BM es la fuente más usada de MSCs, la naturaleza invasiva de aspiración BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. Por el contrario, MSCs fetales obtenidos de la UC tienen ventajas como la vigorosa proliferación y capacidad de diferenciación. No hay ninguna preocupación ética para el muestreo de la UC, como normalmente se considera como desechos médicos. UC humano comienza a desarrollarse con un continuo crecimiento de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación y sigue creciendo hasta llegar a 50-60 cm de longitud, y puede ser aislado durante el período de entrega de todo recién nacido. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, hemos utilizado deriva de UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-MSCs de fetos/recién nacidos 19-40 semanas de gestación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre mesenquimales (MSCs) son originalmente aisladas y caracterizado de la médula (BM)1,2 pero también puede obtenerse una gran variedad de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales 3. MSCs son reconocidos como una población heterogénea de células que puede proliferar y diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. Además, MSCs poseen la capacidad de migrar a sitios de lesión, inhiben y modulan la respuesta inmune y remodelar y reparar lesiones. En la actualidad, MSCs de diferentes fuentes han atraído un interés creciente como fuente para terapia celular contra un número de enfermedades intratables, como injerto - versus - host disease, infarto de miocardio, infarto cerebral4,5 .

Aunque el BM es la fuente más bien caracterizada de MSCs, la invasividad de la aspiración de BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. En cambio, MSCs fetales obtienen de apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB), y del cordón umbilical (Cu) tienen ventajas como menos éticos preocupaciones con respecto a la toma de muestras y robusta la proliferación y diferenciación capacidad6 , 7. entre los apéndices fetales que normalmente se desechan como residuos, UCB y UC se consideran un órgano fetal, mientras que la placenta se considera del fetomaternal. Además, placenta y UCB deben ser muestreados y recogidos en el momento exacto de la entrega del recién nacido, mientras que la placenta y UC pueden ser recogido y procesado después de la entrega del recién nacido. Por consiguiente, la UC es una fuente prometedora de MSC para celular terapia8,9.

UC humano comienza a desarrollarse con la progresiva expansión de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación, crece hasta 50-60 cm de longitud y puede ser aislado durante todo el período de recién nacido entrega10. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, utilizamos derivados del UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales11,12. En este protocolo, describimos cómo aislar y caracterizar MSCs UC de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

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Protocolo

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El uso de muestras humanas para el presente estudio fue aprobado por el Comité de ética de Kobe posgrado escuela de medicina de la Universidad (homologación Nº 1370 y 1694) y realizado de conformidad con los lineamientos aprobados.

1. aislamiento y cultivo de UC-MSCs

Nota: UC-MSCs se han aislado con éxito, cultivadas, y ampliado (más número de paso 4) de más de 200 UCs sometidos a este protocolo. Entre más de 200 UCs, 100% han mostrado éxito aislamiento UC-MSC, menos del 5% han demostrado contaminación accidental, a menos de 15% presentan detención del crecimiento, y más del 80% han demostrado exitosa expansión de UC-MSC.

  1. Recoger UC.
    1. Preparar un tubo de plástico de 50 mL, una tijera aséptico y una botella de 500 mL de alpha modificaron medio esencial mínimo de Eagle (alfa MEM) a 4 ° C.
    2. Asépticamente corte UC con una tijera quirúrgica en aproximadamente 5-10 cm de longitud y recoger poco después del nacimiento del recién nacido por cesárea.
    3. Inmediatamente Coloque la UC en un tubo de plástico de 50 mL y agregar 20-30 mL de alfa MEM en el tubo.
    4. Almacenar la UC a temperatura ambiente (RT) hasta que se transporta al laboratorio.
      Nota: UC aséptica puede almacenarse en medio libre de suero a temperatura ambiente hasta por 2 días. Por lo tanto, se puede recoger UC Obtenido de hospitales vecinos si es entregada al laboratorio dentro de 2 días.
  2. Diseccionar el UC.
    1. Preparar una bandeja de plástico, esterilizar las tijeras y pinzas, pipetas de 10 mL, pipetas de 25 mL, dos platos de cultivo de tejidos de 60 mm, con tampón fosfato salino (PBS), mezcla de enzima purificada (véase Tabla de materiales, reconstituida con PBS estéril a una concentración de 13 Wünsch unidades/mL y se almacenó a-80 ° C) y una botella de 500 mL de medio con suero reducido (véase Tabla de materiales).
    2. Calentar el PBS, mezclas de enzima purificada, medio reducido suero y de la cultura media [alfa MEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% solución antibiótico-antimicótico (AA) almacenados a 4 ° C] a RT.
    3. Sacar de la UC desde el tubo y colóquelo en una bandeja de plástico.
    4. Pesan y diseccionar 5 g de la UC con una tijera esterilizada.
    5. Vierta 10 mL de etanol al 70% sobre la UC para la esterilización con una pipeta de 10 mL.
    6. Lave la UC con 10 mL de PBS dos veces con una pipeta de 10 mL.
    7. Coloque la UC en un plato de cultivo de tejidos esterilizados 60 mm (ver figura 1, paso 1).
    8. Añadir 10 mL de medio de suero reducido en el plato.
    9. Agregar 0,5 mL de enzima purificada mezclas para alcanzar una concentración final de aproximadamente 0.62 Wünsch unidades/mL.
      Nota: El uso de mezclas de enzima purificada en lugar de colagenasa tradicional se ha demostrado para mejorar el rendimiento y viabilidad de UC-MSCs aislada de UC.
    10. Trocear la UC 2-3 mm con tijeras esterilizadas y pinzas (ver figura 1, paso 2).
      Nota: Este proceso tarda unos 30 minutos.
    11. Incubar las piezas de la UC a 37 ° C durante 30 minutos en un incubador de 5% CO2 .
    12. Cortar las piezas parcialmente digeridos de la UC en trozos más pequeños que fluyen fácilmente a través de una pipeta de 25 mL.
      Nota: Este proceso tarda unos 30 minutos.
    13. Incubar los pedazos más pequeños de la UC a 37 ° C durante 15-45 minutos en un incubador de 5% CO2 .
      Nota: Incubación debe continuar hasta que los homogenados se vuelven viscosos. El tiempo de digestión total es aproximadamente de 120 min. En caso de utilizar UCs de prematuros, sin embargo, el tiempo de digestión puede ser acortado debido a los fáciles de cortar y digeridos.
  3. Aislar el UC-MSCs.
    1. Preparar cuatro tubos de plástico de 50 mL y una botella de 500 mL de medio de cultivo.
    2. El homogeneizado de la UC se dividen en dos tubos de plástico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, con aproximadamente 7,5 mL en cada tubo.
    3. Añadir 20 mL de medio de cultivo en cada tubo y mezclar bien.
    4. Filtrar cada homogenado UC 100 μm células colador colocado encima de un nuevo tubo de recogida de 50 mL, utilizando una pipeta de 25 mL para recoger las células derivadas de UC.
      Nota: Este proceso tarda unos 15 minutos cada uno, como la solución de comunicaciones unificadas digerida es pegajosa.
    5. Centrifugar dos tubos a 1.000 x g durante 5 minutos.
    6. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y deséchelo.
    7. Resuspender el pellet celular en dos tubos con 5 mL de medio de cultivo.
    8. Transferir la suspensión de células en una nueva placa de 60 mm y la cultura a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 (ver figura 1, paso 3).
  4. Cultura UC-MSCs.
    1. Calentar el PBS, tripsina-EDTA (0.25 w/v%) y medio de la cultura (alfa MEM con 10% FBS y 1% AA) a RT.
    2. Cuando las células se unen a una placa de 60 mm, retire el medio de cultivo y lavado con 5 mL de PBS dos veces para eliminar los residuos y células de sangre rojas.
      Nota: Adjunto las células aparecen generalmente en 3-5 días después de la galjanoplastia inicial (ver figura 1, paso 4).
    3. Reemplazar el medio de cultivo dos veces por semana e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 hasta 90-100% de confluencia.
      Nota: Esto toma generalmente 7-14 días después de la galjanoplastia del inicial.
    4. Células de lavado con 5 mL de PBS dos veces, Añadir 0,5 mL de tripsina-EDTA e incuban a 37 ° C durante 5-10 minutos.
    5. Cuando las células se convierten en redondeados y separado, añadir 9 mL de medio de cultivo y mezclar bien para inactivar la tripsina.
    6. Transferir la suspensión de células en cultivo a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 y nueva placa de 100 mm (ver figura 1, paso 5).
    7. Reemplazar el medio de cultivo dos veces por semana e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 hasta 90-100% de confluencia.
      Nota: Esto toma generalmente 4-8 días después de la galjanoplastia del inicial.
    8. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces, añadir 1 mL de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C durante 5-10 minutos.
    9. Cuando las células se convierten en redondeados y separado, añadir 9 mL de medio de cultivo y mezclar bien para inactivar la tripsina.
    10. Transferir la suspensión de células en dos nuevas placas de 100 mm y la cultura a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 (ver figura 1, paso 5).
    11. Repetir subcultivo (1:2 divisiones) hasta el décimo paso (ver figura 1, paso 5).
      Nota: Porque las células cultivadas bajo condiciones menos confluentes tienden a llegar a la anterior detención de proliferación, es importante para las células de paso con relación split 1:2.
    12. Utilice las células en el paso de quinta a octava para análisis superficial del marcador de la célula, análisis de la diferenciación de la célula y otros experimentos.
      Nota: Para mantener la proliferación vigorosa durante el tiempo que sea posible, las células se cultivan generalmente en más de 70-80% condiciones confluente.

2. marcador superficial expresión de UC-MSCs

  1. Preparar las células en una placa de 100 mm y disociar con 1 mL de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5-10 minutos.
  2. Añadir 9 mL de medio de cultivo y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.
  3. Aspirar el sobrenadante y deséchelo.
  4. Resuspender el pellet celular con 10 mL de PBS y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos repetir este lavado dos veces.
  5. Resuspender las células con buffer de flujo cytometry (FCM) (PBS conteniendo EDTA 2 mM y 10% bloqueo reactivo) ~ 1 × 106 células/ml.
  6. Transferencia de 50-100 μl de la suspensión celular en un tubo de 1.5 mL; Añadir ficoeritrina (PE)-conjugado anticuerpos contra CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 y HLA-DR; e incubar en hielo durante 45 minutos.
  7. Células de lavado con FCM búfer doble y añadir 50-100 μl de solución de tinte de viabilidad de 0.2% (véase Tabla de materiales).
  8. Incubar a RT durante 15 min, células de lavado con tampón de FCM dos veces y células filtrantes a través de un tamiz celular de 70 μm.
  9. Recorren las células de la FCM y analizar los resultados obtenidos utilizando el software de la FCM según las instrucciones del fabricante.

3. Trilineage diferenciación de MSCs UC

  1. Realizar la adipogénesis.
    1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 5 x 103 células/mL.
    2. 1 mL de la suspensión celular en una placa de 12 pozos de la placa e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 ~ 24 h.
    3. Reemplazar el medio de cultivo con medio de diferenciación adipogenic (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 para 2-3 semanas. Cambiar el medio de diferenciación de adipogenic dos veces a la semana.
    4. Lavar las células con PBS tres veces.
    5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
    6. Lavar las células con PBS tres veces y con isopropanol 60% tres veces.
    7. Preparar una solución de 0,5% aceite rojo O disolviendo 84 mg de aceite O rojo en 10 mL de isopropanol al 100% y la adición de 6,7 mL de agua destilada. Se tiñen las células con 1 mL de solución 0,5% aceite rojo O a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    8. Lavar las células con isopropanol 60% tres veces y visualizar al microscopio.
  2. Realizar la osteogénesis.
    1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 1 × 104 células/mL.
    2. 1 mL de la suspensión celular en una placa de 12 pozos de la placa e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 ~ 24 h.
    3. Reemplazar el medio de cultivo con medio de diferenciación de osteogeneic (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 1-2 semanas. Cambiar el medio de la diferenciación osteogénica dos veces a la semana.
    4. Lavar las células con PBS tres veces.
    5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
    6. Lavar las células con PBS tres veces.
    7. Preparar 2% rojo de alizarina S solución disolviendo 200 mg de alizarina roja S con 10 mL de agua destilada. Se tiñen las células con 1 mL de solución 2% rojo de alizarina S a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    8. Lavar los pocillos con PBS 3 veces y visualizar al microscopio.
  3. Realizar la condrogénesis.
    1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 1,6 × 107 células/mL.
    2. Coloque una gota de 5 μl de la suspensión celular en el centro del pozo de una placa de 12 pozos (micromass culturas) e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 2-3 h.
    3. Agregar cuidadosamente 1 mL de medio de diferenciación condrogénica (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 4-7 días. Cambio medio de diferenciación condrogénica dos veces a la semana.
    4. Lavar las células con PBS tres veces.
    5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
    6. Lavar las células con PBS tres veces.
    7. Preparar la solución de azul de toluidina 0,05% disolviendo 250 mg de azul de toluidina con 500 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.1. Se tiñen las células con 1 mL de solución de azul de toluidina 0,05% a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    8. Lavar las células con PBS tres veces y visualizar al microscopio.

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Resultados

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Los procedimientos de colección de la UC a la cultura MSC se resumen en la figura 1. UC de aproximadamente 5-10 cm de longitud se puede recoger en todos los recién nacidos por cesárea. UC comienza a desarrollarse en 4-8 semanas de gestación y continúa creciendo hasta 50-60 cm de longitud, como se muestra en la figura 2. Hay dos arterias (A), una vena (V), forro de cable (CL) y jalea (WJ de Wharton) en UC, como se muestra en la

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Discusión

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MSCs pueden aislarse de una variedad de tejidos y son una población heterogénea de células que express no todos los mismos marcadores fenotípicos. Aquí delineamos un protocolo que guía la recolección y disección de la UC de neonatos prematuros y de término y permite el aislamiento y la cultura de la UC-MSCs. Siguiendo este protocolo, hemos aislado con éxito UC-MSCs que cumplan con los criterios ISCT19 de fetos/bebés entregados en 19-40 semanas de gestación y demostrado que representan algunos aspe...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scientific Research (C) (número: 25461644) y jóvenes científicos (B) (concesión de números: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de plástico de 50 mLAS One Coporation, Osaka, JapónViolamo 1-3500-22
Placa de 12 pocillosAGC Techno Glass, Tokio, JapónIwaki 3815-012
Plato de 60 mmAGC Techno Glass, Tokio, JapónIwaki 3010-060
Colador de células (100 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2360
Colador de células (70 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical, Osaka, Japón135-15175
Suero fetal bovinoSigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Medio sérico reducidoThermo Fisher Scientific, Waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiótico-antimicóticoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical, Osaka, Japón209-16941
PBSTakara BIO, Shiga, JapónT900
Mezclas de enzimas purificadasRoche, Mannheim, AlemaniaLiberase DH Research Grade 05401054001
PE anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD14BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347497Lote: 3220644, RRID: AB_400312
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD19BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ340364lote: 3198741, RRID: AB_400018
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD34BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555822Lote: 3079912, RRID: AB_396151
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD45BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555483Lote: 2300520, RRID: AB_395875
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD73BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ550257 Lote: 3057778, RRID: AB_393561
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD90BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555596Lote: 3128616, RRID: AB_395970
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra CD105BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ560839Lote: 4339624, RRID: AB_2033932
anticuerpo primario de ratón conjugado con PE contra HLA-DRBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347367 Lote: 3219843, RRID: AB_400293
Ratón conjugado con PE IgG1 k isotipoBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555749Lote: 3046675, RRID: AB_396091
Ratón conjugado con PE IgG2a k isotipoBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555574Lote: 3035934, RRID: AB_ 395953
Isotipo IgG2b k de ratón conjugado con PEBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Lote: 3098896, RRID: AB_396086
Tinte de viabilidadBD Bioscience, Franklin Lakes, NJTinción de viabilidad fijable 450 562247
Reactivo bloqueanteDainippon Pharmaceutical, Osaka, JapónBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSAria  III Clasificador
Software FCMBioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
Medio de diferenciación adipogénicoInvitrogen, Carlsbad, CAKit de diferenciación de adipogénesis StemPro A10070-01
Medio de diferenciación osteogénicaInvitrogen, Carlsbad, CAKit de diferenciación de osteogénesis StemPro A10072-01
Diferenciación condrogénica medio Invitrogen, Carlsbad, CAKit de diferenciación de condrogénesis StemPro A10071-01
Policiencia de formaldehído, Warrigton, PA16% Formaldehído ultrapuro EM Grado # 18814
Aceite Rojo OSigma Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarina Roja SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Azul de toluidinaSigma Aldrich, St. Louis, MO
Microscopio198161 Keyence, Osaka, JapónBZ-X700
de células BD

Referencias

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