Autorradiografía como un método sencillo y potente para la visualización y caracterización de dianas farmacológicas

Resumen

El método de autorradiografía se utiliza habitualmente para estudiar atascamiento de radioligands para las secciones de tejido para la determinación de la farmacología cuantitativa o cualitativa.

Resumen

Autorradiografía in vitro tiene como objetivo visualizar la distribución anatómica de una proteína de interés en tejidos de animales experimentales como en seres humanos. El método se basa en la unión específica de un radioligando a su destino biológico. Por lo tanto, las secciones de tejido congelado se incuban con la solución así, y el atascamiento al objetivo posteriormente se localiza por la detección de radiactividad, por ejemplo, mediante el uso de película fotosensible o las placas de la proyección de imagen de fósforo. Autoradiograms digitales resultantes muestran notable resolución espacial, que permite la cuantificación y localización de unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Por otra parte, la cuantificación permite la caracterización farmacológica de la afinidad del ligando por medio de constantes de disociación (K_d), constantes de inhibición (K), así como la densidad de sitios de unión (B_max) en los tejidos seleccionados. Así, el método proporciona información sobre la localización del objetivo y la selectividad del ligando. Aquí se ejemplifica la técnica autorradiográfica caracterización del ácido alta afinidad γ-hidroxibutírico (GHB) sitios en tejido fino del cerebro mamífero, con especial énfasis en consideraciones metodológicas sobre el análisis de enlace de Unión parámetros, la elección de la radioligand y el método de detección.

Introducción

Autorradiografía es un método que proporciona imágenes de decaimiento radiactivo. La técnica se utiliza habitualmente para el estudio de la distribución en los tejidos de una proteína de interés en vitro basada en una interacción farmacológica específica entre un compuesto radiomarcado y su objetivo. Esto proporciona información directa acerca de la selectividad del ligando el destino. Autorradiografía in vitro también se puede utilizar para la determinación cuantitativa de parámetros de enlace farmacológico de radioligands, tales como la constante de disociación (K_d) y la densidad de sitios de unión (B_max), así como para determ....

Protocolo

Manejo de los animales fue realizado cumpliendo con las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés.

Nota: El protocolo descrito aquí cubre preparación de tejido (es decir, tejido de cerebro de ratón), el ensayo autorradiográfica en vitro en suficiente detalle para configurar el método en un nuevo laboratorio, la exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo así como posterior análisis densitométrico de autoradiograms (figura 2) con el objetivo de localizar y cuantificar la Unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Comparación histológica, se i....

Resultados

Utilizando el protocolo descrito, la distribución anatómica de los sitios de unión de alta afinidad GHB se visualizó con el análogo radiolabelled de GHB [³H] HOCPCA en cerebro de ratón, que fue cortado en secciones coronales, sagitales y horizontales (figura 3 ). Se observaron altos niveles de enlace en el hipocampo y la corteza, enlace inferior en striatum y no vinculante fue detectados en cerebelo, correspondiente a los patrones de expresión divu.......

Discusión

La calidad de un ensayo autorradiográfica más a menudo se determina por la sensibilidad del radioligando. Un factor que contribuye es el radioisótopo seleccionado, que es dado por la disponibilidad de los ligandos conocidos o por la viabilidad de técnicas específicas de etiquetado para ligandos con actividad específica adecuada(es decir, la cantidad de radiactividad por la mole de la unidad de un radioligando)²³y con cantidades limitadas de degradación química. Un gran número de radioliga.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol absoluto	Merck Millipore	107017
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Placa de imagen	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensible al tritio
Acetato violeta de cresilo	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (medio de montaje no acuoso para microscopía)	Merck Millipore	100579
Compuesto O.C.T., 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Portaobjetos Superfrost Plus VWR		631-9483	portaobjetos de microscopio
Tissue-Tek Set de tinción manual para portaobjetos	Sakura Finetek Dinamarca ApS	4451
Tritium Estándar en Glas	Productos químicos radiomarcados estadounidenses, Inc.	ART 0123
Sustituto de xileno	Sigma-Aldrich	A5597