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Artículo de método

Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento

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DOI:

10.3791/58891

⸱

7 de enero de 2019

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

En este artículo

Resumen

Medición de la capacidad de eflujo de colesterol in vitro en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora como un biomarcador para la ateroesclerosis. En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Resumen

Atherosclerosis conduce a enfermedades cardiovasculares (ECV). No está todavía claro si la concentración de colesterol-HDL (cHDL) desempeña un papel causal en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, un factor importante en las primeras etapas de formación de la placa de ateroma es capacidad de eflujo de colesterol de HDL (la capacidad de las partículas de HDL colesterol de los macrófagos de aceptar) para evitar formación de espuma de la célula. Este es un paso clave para evitar la acumulación de colesterol en el endotelio y una parte del transporte de colesterol inverso (ECA) para eliminar el colesterol por el hígado. Capacidad de eflujo de colesterol en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora que puede utilizarse como marcador de aterosclerosis. Tradicionalmente, [3H]-colesterol se ha utilizado en ensayos de eflujo de colesterol. En este estudio, nuestro objetivo es desarrollar una estrategia más segura y más rápida con fluorescente etiquetado-colesterol (colesterol de NBD) en un ensayo celular rastrear el proceso de absorción y eflujo de colesterol en macrófagos THP-1-derivados. Por último, optimizar y estandarizar el método de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Introducción

Según la Organización Mundial de la salud, las principales causas actuales de muerte en todo el mundo son la cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular (que representa un total de 15,2 millones de defunciones)1. Ambos son las enfermedades cardiovasculares (ECV) que pueden estar precedidas por la aterosclerosis y la ruptura de placas de ateroma en los vasos sanguíneos2,3.

Aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria del pared vaso en el que los macrófagos, células T, mastocitos y células dendríticas infiltran en el endotelio y acumulan de la sangre, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Placas ateroscleróticas presentan un lípido cristales base y colesterol, por medidas de ecografía de alta resolución B-modo de la carótida íntima media grueso4,5. En macrófagos, eflujo de colesterol hacia las partículas de aceptador de lípidos se realiza por medio de los ATP-binding cassette (ABC) los receptores ABCA1, miembro de ATP enlace cassette subfamilia G 1 (ABCG1) y el receptor scavenger SR-BI. El desequilibrio del flujo de colesterol y de la emanación en los macrófagos se considera un proceso clave en la aterosclerosis iniciación6. Eflujo de colesterol se considera un paso clave en la eliminación de colesterol del tejido periférico para el plasma y el hígado en un proceso llamado transporte de colesterol inverso (ECA). Se transfiere colesterol de los macrófagos principalmente a apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados en la superficie de las partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL). Esferoides entonces transportan colesterol al hígado para la excreción y reutilización7,8,9.

Colesterol marcado con radio de tritio (3H) se ha utilizado tradicionalmente, en el eflujo de colesterol10. La señal de emisión de radioisótopos es altamente sensible10; sin embargo, colesterol marcado con radio presenta desventajas obvias como protocolos largos, el riesgo de exposición a la radiación ionizante y la necesidad de radiactividad especial instalaciones y equipos para manejo de emisiones radiactivas. Por el contrario, la fluorescencia se ha incorporado con éxito en las técnicas de diagnóstico debido a su simplicidad en la detección de la señal fluorescente, la gran variedad de fluoróforos disponibles y su seguridad11. Varios esteroles fluorescentes etiquetados han sido utilizados para estudiar el metabolismo del colesterol como dehydroergosterol (con fluorescencia intrínseca), colesterol de Dansilo, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterol y 22-(N-(7- Nitrobenz-2-OXA-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol presenta una absorción eficaz en células humanas12. Están disponibles dos diferentes NBD etiquetados-colesterol: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) y 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterol con parte de la 22-NBD puede satisfacer mejor estudios de eflujo de colesterol, mientras que 25 NBD de colesterol se utiliza principalmente en la membrana celular dinámica investigación13,14.

Líneas celulares típicamente utilizadas en los análisis de eflujo de colesterol in vitro son monocitos-como las células como las células THP-1 humanas derivada de la leucemia murino de células Raw 264.715y J774.1. Todas estas células pueden diferenciarse en macrófagos en vitro con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y macrófagos THP-1 derivados (dmTHP-1) mejor reflejan y mímico los macrófagos humanos16.

En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de alto rendimiento para determinar la capacidad de eflujo de colesterol de las muestras de suero de dmTHP-1, con 22-NBD-colesterol como alternativa a [3H]-colesterol. Además, comparamos la técnica fluorescente optimizada con el estándar análogo radioactivo.

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Protocolo

Para este estudio, se obtuvieron aprobación del Comité de ética (Comitè Ètic de Investigación Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de homologación de HCB/2014/0756) y consentimiento escrito informado de todos los temas.

1. al siguiente día laborable-colesterol preparación

  1. Disolver la NBD-el colesterol (MW 494.63; véase Tabla de materiales) de etanol puro para obtener el caldo (2 mM). Para un vial de 10 mg, disolver el contenido del frasco entero en un volumen de 10,1 mL de etanol para obtener un stock de 2 mM.
  2. Diluir el colesterol durante toda la semana de la acción en RPMI 1640 suplementado con 10% fetal bovina sérica y 5% penicilina/estreptomicina (R10 medio) para alcanzar una concentración final de 5 μM (e.g., obtener 10 mL de colesterol durante toda la semana en concentración final de 5 μM) por diluir 25 μL del stock de NBD-colesterol (2 mM) en medio de R10. Este volumen es suficiente para una placa de 96 pocillos.

2. célula de cultivo y siembra (día 2)

  1. Células THP-1 en cultivo en medio de R10 a 37 ° C, 5% CO2. Ajuste a 0,3 x 106 células/mL cada 3 días.
  2. Semilla de las células en un plato blanco de 96 pocillos con fondo plano, claro en 0.2 x 106 células/pozo en medio de la R10 (100 μL por pozo).
  3. Tratar las células con 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, de un stock de 10 μM) por 48-72 h, incubando a 37 ° C, 5% CO2 para diferenciar THP-1 células en dmTHP-1.
    Nota: Se recomienda utilizar 5 μL del stock PMA (10 μM) en 500 μL de medio de R10. Antes de esto, preparar un μM 10 valores PMA al disolver un vial de liofilizado 1 g en 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), alícuota y stock a-20 ° C.
  4. Alternativamente (sugerencia) combinan pasos 2.2 y 2.3 para la mejor homogeneización. Preparar 10 mL de células THP-1 en un tubo de 15 mL, añadir 200 μL de caldo PMA (10 μM), mezcle suavemente e inmediatamente sembrar 100 μL por pocillo en la placa. Incube las células como se describe en el paso 2.3.

3. Apolipoproteína B agotado suero (masturbo) PREPARACION (el dia 2 o 3)

  1. Para preparar una solución de polietilenglicol (PEG), diluir glicina en PBS 10% (con estéril H2O) a una concentración de 200 mM a pH 7.4. Añadir 40 mL de glicina de 200 mM a 10 g de PEG 8000 para obtener PEG 20% (p/v). La solución vigorosamente para homogeneizar la mezcla.
  2. Aplicar 4 piezas 20% de PEG por 10 partes de suero o plasma en cada muestra de suero o plasma en un tubo de 1,5 mL y deja la mezcla en hielo para 25 min17 (por ejemplo, para 100 μL del plasma o suero, agregar 40 μL de 20% PEG solución).
  3. Centrifugue el precipitado PEG-Apolipoproteína B a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  4. Descartar el precipitado. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
    Nota: Sugerimos preparar la masturbo el día 3 (fresco). Si no es posible, prepare la masturbo el día 2 y guardar a 4 ° C durante la noche.

4. al siguiente día laborable-colesterol celular carga (día 2)

  1. Descartar el medio de cultivo de la dmTHP-1 y lavan las células dos veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Carga las células con 5 μM NBD-colesterol (100 μL por pozo) en medio de R10 e incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.

5. incubación con aceptores de colesterol (día 3)

  1. Descartar el medio y lavan las células dos veces con PBS.
  2. Incubar las células con 2 – 5% masturbo o la concentración deseada de aceptador purificada de lípidos (HDL, ApoA, ApoE, etc.) diluido en Medio RPMI 1640 incoloro (100 μL por pozo) para 4 – 6 h a 37 ° C.
    Nota: Incluir un control negativo (C-) de incoloro Medio RPMI 1640 sin aceptadores y un control positivo (C +) (por ejemplo, masturbo desde un pool de donantes sanos) o esferoides purificadas. Nota que el control positivo aplica especialmente cuando las muestras del paciente (condiciones de enfermedad) son analizadas (figura 1 complementaria).
  3. Preparar un stock de 200 mL de la solución de lisis celular 1 (tampón de Tris 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). La mezcla la proporción de solución 1 a 1:1 (v: v) de lisis celular con etanol puro para obtener la solución de lisis 2.

6. captura de señal fluorescente (día 3)

  1. Detección de colesterol durante toda la semana de los medios de comunicación
    1. Retire el medio celular de las placas y recoger en una nueva placa de 96 pocillos blanca con un fondo plano opaco.
    2. Para una detección de señal óptima de la fluorescencia en las muestras de los medios de comunicación, añada 100 μL de etanol puro en 100 μL de cada muestra media para obtener una proporción de 1:1 en la placa de 96 pocillos blanca.
    3. Mantenga la placa con los medios de comunicación tratada a otra medida de la intensidad de fluorescencia (FI) en una longitud de onda de 463⁄536 nm (excitación/emisión) en el luminómetro.
  2. Detección de NBD-colesterol intracelular
    1. Lavan las células dos veces con PBS.
    2. Para obtener el colesterol intracelular, lyse las células por incubación con 100 μL de solución de lisis 2 por pozo y agitar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 25 minutos.
    3. Para la captura de una detección de señal óptima de la fluorescencia en las muestras de lisado de células, la intensidad de fluorescencia de los lysates de la célula en el mismo blanco placa de 96 pocillos con fondo claro plano (el mismo plato en el que las células fueron sembradas en el paso 2.2).
  3. 6.3 medir la intensidad de fluorescencia (FI) en el luminómetro y ajuste el parámetro de sensibilidad a 50 en el software (véase Tabla de materiales).

7. Análisis de resultados

  1. Expresar la tasa de colesterol de la emanación de una muestra como porcentaje calculado por la fórmula:
    figure-protocol-1
  2. Obtener la medida final del eflujo de colesterol (CE) restando el CE del control negativo (ejemplo cargado con NBD-colesterol pero incubados con Medio RPMI 1640 descolorido sin aceptores de colesterol) de la CE de un dado muestras:
    figure-protocol-2

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Resultados

El objetivo del ensayo de eflujo de colesterol es determinar en vitro la capacidad de eflujo de colesterol de un determinado suero, plasma o sobrenadante que contiene las partículas de HDL. El método consiste en cargar colesterol etiquetados en una cultura de una línea celular de macrófagos estándar e induciendo el contacto con la muestra de prueba diluida en los medios de comunicación libres de FBS con las células. Por último, los niveles fluorescentes de la NBD se miden en los medios y lisado de célula. Para optimizar ...

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Discusión

Etiqueta fluorescente el colesterol es una estrategia prometedora para analizar e investigar las propiedades y el metabolismo del colesterol natural in vitro. Sus principales ventajas son que puede ser tomada por las células, permite la intracelular y los estudios de distribución de la membrana y puede ser aplicado a ensayos de eflujo de colesterol como este protocolo (figura 7). Algunos esteroles etiquetados fluorescentes permiten seguimiento de colesterol in vitro incluyendo BODIPY-coleste...

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Divulgaciones

Los autores desean declarar que ellos son inventores de la patente (18382337.6-1118, EPO; 17 de mayo de 2018) titulado "Método para determinar el eflujo de colesterol" basado en este método.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido parcialmente financiado por FIS (PS12/00866) las becas de la investigación del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España; El de Fondo Europeo para Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) y el programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Los autores agradecen la Retrovirología y Viral laboratorio de Inmunopatología del Institut d ' Investigacions Biomèdiques de agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos a T. Escribà, C. Rovira y C. Hurtado por su asistencia y Cufí S. desde el conocimiento y la oficina de transferencia de tecnología para su orientación en la protección de la invención.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placa colectora de 96 pocillosCorning IncCostar 3912blanca Placa de 96 pocillos con fondo transparente opaco
placa de cultivo de 96 pocillosCorning IncCostar 3610blanca Placa de 96 pocillos con fondo plano y transparente
Kit de ensayo de eflujo de colesterol (basado en células)Abcamab196985comercial Kit de ensayo basado en células de alto rendimiento destinado a determinar la eflujo de colesterol
incoloro RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 sin pehnol-red
Gen5 Software de análisis de datosBioTekversión 2.0
GlycineSigma-AldrichG8790-100GGlicina, uso no animal
LuminómetroBiotekSYNERGY HTLector de microplacas de detección múltiple
Solución de lisis 1tampón Tris de 50 mM, NaCl de 150 mM y solución de lisis de H2O
2internaetanol puro y lisis celular 1:1 (v:v)
NBD-colesterolThermo-FisherN114822-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol
PBSSigma-AldrichP3813tamponado con fosfato  solución salina
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gpolietilenglicol
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-merystate B-acetato.
R10in-houseRPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 5% de penicilina/estreptomicina.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 con 2 mM de L-glutamina que contiene 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 4,5 g/L de glucosa
THP-1 célulasSigma-AldrichATCC, línea de monocitos #TIB-202derivada de la leucemia de un bebé de un año
Tween 80Sigma-AldrichP1754
solución de

Referencias

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