Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento

Resumen

Medición de la capacidad de eflujo de colesterol in vitro en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora como un biomarcador para la ateroesclerosis. En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Resumen

Atherosclerosis conduce a enfermedades cardiovasculares (ECV). No está todavía claro si la concentración de colesterol-HDL (cHDL) desempeña un papel causal en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, un factor importante en las primeras etapas de formación de la placa de ateroma es capacidad de eflujo de colesterol de HDL (la capacidad de las partículas de HDL colesterol de los macrófagos de aceptar) para evitar formación de espuma de la célula. Este es un paso clave para evitar la acumulación de colesterol en el endotelio y una parte del transporte de colesterol inverso (ECA) para eliminar el colesterol por el hígado. Capacidad de eflujo de colesterol en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora que puede utilizarse como marcador de aterosclerosis. Tradicionalmente, [³H]-colesterol se ha utilizado en ensayos de eflujo de colesterol. En este estudio, nuestro objetivo es desarrollar una estrategia más segura y más rápida con fluorescente etiquetado-colesterol (colesterol de NBD) en un ensayo celular rastrear el proceso de absorción y eflujo de colesterol en macrófagos THP-1-derivados. Por último, optimizar y estandarizar el método de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Introducción

Según la Organización Mundial de la salud, las principales causas actuales de muerte en todo el mundo son la cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular (que representa un total de 15,2 millones de defunciones)¹. Ambos son las enfermedades cardiovasculares (ECV) que pueden estar precedidas por la aterosclerosis y la ruptura de placas de ateroma en los vasos sanguíneos^2,3.

Aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria del pared vaso en el que los macrófagos, células T, mastocitos y células dendríticas infiltran en el endotelio y acumulan de la sangre, ev....

Protocolo

Para este estudio, se obtuvieron aprobación del Comité de ética (Comitè Ètic de Investigación Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de homologación de HCB/2014/0756) y consentimiento escrito informado de todos los temas.

1. al siguiente día laborable-colesterol preparación

1. Disolver la NBD-el colesterol (MW 494.63; véase Tabla de materiales) de etanol puro para obtener el caldo (2 mM). Para un vial de 10 mg, disolver el contenido del frasco entero en un volumen de 10,1 mL de etanol para obtener un stock de 2 mM.
2. Diluir el colesterol durante toda la semana de la acción en RPMI 1640 suplementado con 1....

Resultados

El objetivo del ensayo de eflujo de colesterol es determinar en vitro la capacidad de eflujo de colesterol de un determinado suero, plasma o sobrenadante que contiene las partículas de HDL. El método consiste en cargar colesterol etiquetados en una cultura de una línea celular de macrófagos estándar e induciendo el contacto con la muestra de prueba diluida en los medios de comunicación libres de FBS con las células. Por último, los niveles fluorescentes de la NBD se miden en los medios y lisado de célula. Para optimizar .......

Discusión

Etiqueta fluorescente el colesterol es una estrategia prometedora para analizar e investigar las propiedades y el metabolismo del colesterol natural in vitro. Sus principales ventajas son que puede ser tomada por las células, permite la intracelular y los estudios de distribución de la membrana y puede ser aplicado a ensayos de eflujo de colesterol como este protocolo (figura 7). Algunos esteroles etiquetados fluorescentes permiten seguimiento de colesterol in vitro incluyendo BODIPY-coleste.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
placa colectora de 96 pocillos	Corning Inc	Costar 3912	blanca Placa de 96 pocillos con fondo transparente opaco
placa de cultivo de 96 pocillos	Corning Inc	Costar 3610	blanca Placa de 96 pocillos con fondo plano y transparente
Kit de ensayo de eflujo de colesterol (basado en células)	Abcam	ab196985	comercial Kit de ensayo basado en células de alto rendimiento destinado a determinar la eflujo de colesterol
incoloro RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R7509	RPMI 1640 sin pehnol-red
Gen5 Software de análisis de datos	BioTek		versión 2.0
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	Glicina, uso no animal
Luminómetro	Biotek	SYNERGY HT	Lector de microplacas de detección múltiple
Solución de lisis 1			tampón Tris de 50 mM, NaCl de 150 mM y solución de lisis de H2O
2	interna		etanol puro y lisis celular 1:1 (v:v)
NBD-colesterol	Thermo-Fisher	N1148	22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	tamponado con fosfato  solución salina
PEG 8000	Sigma-Aldrich	202452-250G	polietilenglicol
PMA	Sigma-Aldrich	79346	Phorbol 12-merystate B-acetato.
R10	in-house		RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 5% de penicilina/estreptomicina.
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758	RPMI 1640 con 2 mM de L-glutamina que contiene 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 4,5 g/L de glucosa
THP-1 células	Sigma-Aldrich	ATCC, línea de monocitos #TIB-202	derivada de la leucemia de un bebé de un año
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754

solución de