Artículo de método

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

DOI:

10.3791/58933

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15 de febrero de 2019

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1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Resumen

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Trasplante de la célula de (HSPC) madre y progenitoras hematopoyético ha sido una terapia de la piedra angular para la leucemia y otros cánceres durante casi medio siglo, subyace la única cura conocida de infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y muestra la inmensa promesa en el tratamiento de enfermedades genéticas tales como la talasemia beta. Nuestro grupo ha desarrollado un protocolo de terapia del gene modelo HSPC en primates no humanos (NHPs), permitiendo a los científicos optimizar muchos de los mismos reactivos y técnicas que se aplican en la clínica. Aquí, describimos los métodos para purificar el CD34+ HSPCs y subconjuntos de células madre hematopoyéticas (HSC) que persiste a largo plazo de cebada de la médula (BM). Técnicas idénticas pueden ser empleadas para la purificación de otras fuentes de la HSPC (por ejemplo, sangre periférica movilizada células madre [PBSCs]). Se describe, es un protocolo de 2 días en el que las células son purificadas, cultivadas, modificadas con lentivirus (LV) y preparadas para infusión en el huésped autólogo. Lecturas claves de éxito incluyen la pureza de la CD34+ HSPC población, la capacidad de HSPCs purificadas para formar colonias morfológicamente distintas en medios semisólidos y, lo más importante, eficiencia de modificación genética. La ventaja clave de la terapia génica HSPC es la capacidad de proporcionar una fuente de larga vida células que dan lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas. Como tales, estos métodos se han utilizado para terapias de modelo para el cáncer, enfermedades genéticas y enfermedades infecciosas. En cada caso, eficacia terapéutica se establece al mejorar la función de clara progenie HSPC, incluyendo células de sangre rojas, células T, células B o subconjuntos mieloides. Los métodos para aislar, modificar y preparar HSPC productos son directamente aplicables y traducible a múltiples enfermedades en pacientes humanos.

Introducción

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Terapia génica de la célula de vástago es un medio poderoso para abordar una amplia gama de patologías humanas. La terapia génica HSPC es un enfoque especialmente atractivo, debido a i) la relativa facilidad de la recogida de estas células de pacientes, ii) la riqueza del conocimiento que está disponible en cuanto a fenotipos de superficie celular y ex vivo parámetros de cultura y, como el campo se amplía, porque iii) presenta los científicos con una caja de herramientas cada vez más de estrategias de modificación génica adaptados a varias enfermedades de interés. Estamos investigando activamente HSPC enfoques de terapia de gen desde varios ángulos, incluyendo la ciencia básica de Biología HSPC, el engraftment de HSPCs modificado gen en modelos preclínicos in vivo y la aplicación a las poblaciones de pacientes. Nosotros y otros hemos caracterizado el fenotipo de superficie celular de funcionalmente distintas HSPC subconjuntos1,2,3, la movilización y regímenes de acondicionamiento que maximizan el rendimiento de la HSPC y engraftment minimizando toxicidad4,5y el gene de la modificación y edición de gene estrategias que se ajustan a una amplia gama de maligno, genética y enfermedades infecciosas6,7,8, 9,10. La función y el engraftment de HSPCs gene modificado pueden evaluarse en un número de modelos de animales grandes y pequeños, como ratones, perros, NHPs. En particular, modelos NHP son ventajosos porque muchos reactivos, por ejemplo, anticuerpos específicos para proteínas de superficie de célula HSPC como CD34 y CD90, pueden ser utilizados indistintamente en humanos y células NHP. Además, en contraste con los ratones, animales grandes, como NHPs permiten una mejor aproximación de la magnitud de la modificación genética necesaria para la eficacia clínica. Finalmente, NHPs son el estándar de oro para el modelado de patologías humanas tales como HIV-1 infección11 y son un modelo emergente para candidato anticáncer y anti-VIH inmunoterapias12,13.

El propósito de este protocolo es exponer métodos para purificar, modificar genéticamente y preparación de productos de infusión HSPC NHP. Aunque fuera del alcance de este protocolo, previamente hemos demostrado que estos productos engraft en anfitriones NHP autólogos, dan lugar a todos los linajes hematopoyéticos y proporcionan eficacia terapéutica en una amplia gama de modelos de enfermedad1. También hemos caracterizado el clonality de engrafting HSPCs y construido una plataforma para el seguimiento de la cinética, tráfico y el fenotipo de HSPCs individuales y su progenie, siguiente trasplante autólogo1,14. Los métodos presentados aquí han sido desarrollados con los siguientes objetivos: i) al aislar HSPCs altamente puros y subconjuntos HSC engrafting a largo plazo, ii) para mantener HSCs primitivo durante ex vivo de la cultura y iii) eficacia gene-modificar ya sea a granel HSPCs o a largo plazo engrafting subconjuntos HSC. Empleamos asistida magnética celular clasificación (MACS), así como de células activado por fluorescencia (FACS), para aislar a fenotípicamente/funcionalmente HSPC poblaciones distintas, consistentes con los métodos de muchos grupos2,15, de la clasificación 16. El mantenimiento de HSCs primitivos en la cultura (es decir, minimizar la diferenciación de estas células en progenitores comprometidos que dan lugar a completamente diferenciados subconjuntos linfoides y mieloides) es una faceta esencial del protocolo descrito aquí. Aunque anteriormente hemos caracterizado enfoques para ampliar HSPCs manteniendo un fenotipo primitivo17,18, aquí, se describe un protocolo que se centra en el mantenimiento de las HSCs vía un mínimo (48 h) y define ex vivo de la cultura.

La modificación eficaz de HSPCs y HSC subconjuntos es un objetivo central de este protocolo. Entre varios enfoques hemos divulgado, dos son los más investigados en ensayos clínicos: modificación genética mediada por LV y nucleasa-mediated gene edición1,6,19. Estrategias gene-edición para utilizan uno de un número de plataformas de nucleasa para modificar específicamente un gen específico de interés, por ejemplo, C-C chemokine receptor tipo 5 (CCR5) para el tratamiento de VIH infección7,19 o Bcl11A para el tratamiento de hemoglobinopatías6. Aquí, nos centramos en la modificación genética de LV-mediada, en la cual cargas transgénicas semirandomly integran en el genoma1,8,20. Una ventaja clave de los enfoques de LV es la capacidad para entregar grandes cantidades de material genético (hasta 8 o 9 kilobases). Aunque estrategias gene-edición se están desarrollando para un transgen de interés integrar sólo en un lugar especificado por recombinación homóloga donantes (HDR), estos métodos requieren más desarrollo in vitro y en modelos animales pequeños. Por el contrario, vectores de LV se han utilizado extensivamente en NHPs y en pacientes21,22. Lo importante, el protocolo descrito aquí, que utiliza habían cebada BM como una fuente partida de la HSPC, puede ser fácilmente y ampliamente adaptado, por ejemplo, para aislar PBSCs. Como se describió anteriormente, aprovechamos el alto grado de similitud genética entre NHPs y los seres humanos para utilizar reactivos que son aplicables a ambas especies. Por último, este enfoque ha sido adaptado para modificar otros subconjuntos hematopoyéticos, es decir, T las células12,23,24; la llegada de los eficaces métodos de inmunoterapia de T-cell ha confiado pesadamente en la misma plataforma de LV en este protocolo. Estos métodos son apropiados para cualquier investigador interesado en la biología de la HSPC o modificación genética mediada por LV. Por ejemplo, podría utilizarse el protocolo de purificación de la HSPC presentado aquí para caracterizar nuevos subconjuntos de HSC-enriquecido, como se describió anteriormente1,15,25. Asimismo, la transducción de LV métodos presentados aquí podrían del mismo modo ser aplicada y desarrollada por numerosos tipos celulares y preguntas experimentales, tanto en modelos in vitro e in vivo.

En Resumen, se presentan métodos para aislar y modificar genéticamente HSPCs NHP. Estos métodos pueden ser muy fácilmente adaptables para otras especies y otras fuentes de HSPCs. Este protocolo minuciosamente investigado muestra gran promesa en el modelaje de las eficaces terapias para numerosas enfermedades humanas.

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Protocolo

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NHP autotrasplantes, cebado (movilización), la colección de células y la modificación genética se llevan a cabo constantes con protocolos previamente publicados26. Todos los procedimientos experimentales son revisados y aprobados por la Comisión de uso del Fred Hutchinson Cancer Research Center y la Universidad de Washington y de institucional Animal Care (protocolo #3235 - 01). Todos los estudios se realizan en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud ("la guía"); los animales fueron asignados aleatoriamente a los estudios.

1. enriquecimiento de CD34+ HSPCs y cultura durante la noche (día -1)

  1. BM de la cosecha y condicionan.
    1. Movilizar el NHPs con factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) durante 4 días como se describió anteriormente26.
    2. Sedar a los animales con 100 mg/kg de ketamina y 0,03 mL/kg de dexmedetomidina (valores de 0,5 mg/mL). Administrar analgésicos (p. ej., buprenorfina SR) en el momento del sorteo.
    3. Usando tijeras, afeitar el pelo del animal desde el extremo proximal del húmero o fémur hueso y frote la piel con exfoliante con base de yodo o una solución antiséptica similar, alternan con alcohol y repetir x 3. Como un anestésico adicional, infundir el periostio con bupivacaína (2 mg por sitio, valores de 5 mg/mL).
    4. Coloque la aguja de aspiración de médula ósea (16 G) en el sitio de entrada perióstico (cavidad medular) y perforar la piel, penetrando la cavidad medular con un movimiento de rotación. Retire el estilete de la aguja de aspiración y reserva en un campo estéril para su uso posterior.
      Nota: Elegir el sitio perióstico de la entrada a la cavidad medular en una zona del hueso que no está cubierto por músculos y donde paisaje y forma del hueso es visible o puede sentir fácilmente a través de la piel (comúnmente hacia el extremo proximal o distal del hueso).
    5. A la aguja de la BM, acople una jeringa prellenada que contiene una mezcla de solución de anticoagulante citrato dextrosa (ACD-A) y heparina (20 USP/mL, 1 mL por 9 mL de médula ósea para ser recogidos).
    6. Tire el émbolo hacia atrás suavemente oscilando la extremidad y girándola, para agitar la jeringa para mezclar anticoagulante y aspire. Gire la aguja y vuelva a colocarlo a lo largo de la aspiración y la retirada a un mayor porcentaje de células en el espacio de la médula ósea.
    7. Una vez que se recoge la muestra, retire la aguja y aplique presión al sitio de aspiración hasta que el sangrado se detenga.
      Nota: Según el volumen necesario, se pueden dibujar de la médula de uno a cuatro miembros (dos húmeros, dos fémures) durante una sola colección. No más de 20 mL se deben recoger de cada miembro, y el volumen total recogido debe constituir no más del 10% del peso del animal (10 mL/kg).
    8. Si recibir aspirados de múltiples extremidades, combinar y registrar el volumen.
    9. Deje que el Postanestésica recupera de NHP.
      1. Revertir los efectos de la dexmedetomidina con atipamezole de 0.03 mL/kg (valores de 5 mg/mL) después del procedimiento. Proporcionar analgésicos (p. ej., buprenorfina SR) según lo prescrito por personal veterinario clínico durante al menos 48 h después del procedimiento o, a discreción del veterinario clínico, basan en signos clínicos.
      2. Devolver el animal a su jaula hogar después del procedimiento y seguimiento cada 15-20 min, hasta que el animal es capaz de sentarse por su propia. Vigilar el animal diariamente por el personal veterinario hasta que se determine que el sitio de aspiración es sanado. Además, vigilar para detectar cualquier signo de inflamación, infección o dolor.
    10. En paralelo al procesamiento de células, la condición de la misma NHP con myeloablative irradiación de cuerpo entero (TBI): 1.020 cGy a un ritmo de 7 cGy/min administrar radiación en dosis fraccionadas durante los 2 días antes de la infusión de células.
  2. Hemolyze del BM.
    1. El BM se dividen en tubos cónicos de 50 mL (10-12 mL por tubo) y añadir tampón hemolítico para llevar el volumen a 50 mL (tabla 1). Incubar las células en la temperatura ambiente (RT) hasta que son sometidas a lisis pero no más de 7 min centrífuga a 800 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante de la pellet(s), dejando de 2 a 5 mL de volumen/tubo. Resuspender el precipitado en el volumen residual.
      Nota: Muestras sometidas a lisis con éxito cambian de color, de un color rojo oscuro a un rojo claro transparente.
    2. Añadir 10-15 mL de tampón hemolítico o el sedimento. Retire cualquier coágulos usando filtros de celular de 70 μm. Añadir hemolítico tampón hasta 50 mL, incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugado a 800 x g durante 5 minutos.
    3. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de tampón de MACS (tabla 1). Filtrar nuevamente a través de un tamiz celular de 70 μm. Enjuague el tubo y el filtro con 40 mL de MACS tampón hasta 50 mL.
  3. Enriquecer el CD34+ las células de los muestras hemolizados glóbulos blancos (GB) utilizando protocolos estándar.
    1. Girar las células a 800 x g durante 15 minutos Revise los tubos para asegurarse de que no hay remolinos de células son evidentes en el parte superior/medio. Si las células están presentes por encima de la pelotilla, girar otra vez a mayor velocidad (hasta 1.000 x g máximo) y hasta 10 minutos.
    2. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de buffer de MACS, observando el volumen exacto. Contar las células en una dilución 1: 100 o 1:1,000 usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
      Nota: Este conteo total de glóbulos blancos es el número de enriquecimiento previo.
    3. Añadir el tampón Mac para llevar la concentración de células 1 x 108 células/ml. Si es necesario, primero repita 1.3.1 - 1.3.2 (p. ej., debido a un conteo bajo de enriquecimiento previo). Reserva de 5 x 106 células en buffer de MACS para el subconjunto HSC tinción (enriquecimiento de la muestra).
    4. Añadir no conjugada anti-CD34 anticuerpo (clon 12.8, Tabla de materiales)27 a las restantes células de enriquecimiento previo a una concentración final de 40 μg/mL (1 x 108 células/mL). Incubar la suspensión de células a 4 ° C en un agitador de tubo (véase la Tabla de materiales) durante 25-30 minutos.
    5. Uso MACS almacenador intermediario para llevar el volumen a 50 mL y centrifugar las células a 800 x g por 5 min aspirar el sobrenadante, resuspender las células en 50 mL de tampón de MACS y vuelta otra vez a 800 x g durante 5 minutos.
    6. Degas 100 mL de tampón de MACS con dos tubos de filtro, envolver con papel de cera, por 25-30 min o hasta listo para utilizar la entrada de aire.
    7. Calcular el volumen necesario de granos magnéticos: 1 mL de granos/109 células. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células 108 células/mL, después se agregan los granos. Por ejemplo: 3 x 109 células + 3 mL de granos + 27 mL de MACS de búfer a 30 mL de volumen total.
    8. Incubar la suspensión de células a 4 ° C en un agitador de tubo de 25-30 min.
    9. Durante adquirir imanes para las columnas; Plan de uso de 0.6 x 109 células por columna. Colocar las columnas en el imán y colocar un tubo cónico de 50 mL por debajo de cada columna para recoger el flujo a través. Preparar un tubo cónico de 15 mL y el émbolo para cada columna de elución (paso
    10. Cuando haya finalizado la incubación en el paso 1.3.8, añadir el tampón de MACS a 50 mL y centrifugado a 800 x g por 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender las células en desgasificada buffer de MACS (2 mL por columna). Pipetee suavemente para evitar la introducción de burbujas.
    11. Sin permitir que la columna funcione en seco, agregar 1 mL de tampón de MACS desgasificada a cada columna, seguido de 2 mL de la suspensión celular. Enjuague el filtro y el tubo original con desgasificada buffer de MACS y dividir la solución igualmente entre las columnas (6 mL/columna); Luego, añadir 7 mL de desgasificada buffer de MACS para el lavado final.
    12. Suavemente tire la columna del imán (empuje la parte posterior superior) y recoger el último goteo en el tubo de flujo. Añadir 5 mL de tampón de MACS desgasificada a cada columna y aplicar el émbolo para eluir las células en el tubo cónico estéril de paso 1.3.9. No recoja líquido después de que aparezcan burbujas.
  4. Contar las células en el enriquecido y el flujo (FT) tubos con una relación de dilución de 1:10. Mantener las células en hielo. Alícuota 1 x 106 células de la fracción enriquecida de CD34 y 5 x 106 células de las fracciones FT para el análisis por citometría de flujo. Almacenar la fracción FT a 4 ° C hasta que concluye el control de calidad (paso 2).
    Nota: El número de CD34+ las células necesarias para el engraftment acertado del multilineage de la NHP es dependiente de la frecuencia de la CD34 enriquecida con HSC+CD90+CD45RA subconjunto– . Basado en una frecuencia media de 3% - 5% y el requisito mínimo de 122.000 CD34+CD90+CD45RA células– por kilogramo de cuerpo peso1, se recomienda proceder con un total de al menos 2.5 x 106 y hasta 10 x 10 6 CD34 de las células+ por kilogramo de peso corporal.
  5. Añadir MACS tampón para el CD34+ enriquecido fracción un 50 mL en total, centrifugado a 800 x g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células 106 células/mL en medios de la HSPC (tabla 1).
    1. Placa las células a una densidad de 106 células/mL en ventilación, cultivo de tejidos (TC)-tratado de frascos de T-75, 10-20 mL por frasco e incúbelos durante la noche en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Descansar los frascos longitudinalmente (no de pie).
      Nota: Si lo desea, CD34 adicional+ células o CD34– FT puede ser criopreservado en 90% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) + 10% dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 1 x 106 a 5 x 106 células/mL y luego lento enfriado por en - 80 ° C (por ejemplo, utilizar contenedores de congelación). El rendimiento promedio de recuperación de células cryopreserved es dependiente en el CD34+ pureza y comúnmente oscila entre 50% y 80% con una viabilidad de > 80%.

2. Control de calidad de las células CD34-enriquecido (día -1)

  1. Preparar muestras para citometría de flujo.
    1. Suspender las muestras reservadas de cada etapa de aislamiento ya mencionado (pre enriquecimiento, FT y fracciones enriquecidas de CD34) en tampón FACS en una concentración de 10 x 106 células/mL y transferir 100 μl de cada suspensión celular (tabla 1) a un tubo de FACS.
      Nota: Muestras de control deben incluir células sin manchas de cada etapa de aislamiento (por ejemplo, 5 x 105 células) para el ajuste de forward scatter (FSC), lado scatter (SSC) y autofluorescencia en cada canal de fluorescencia. Además, cuentas de compensación solo manchado para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo se requerirá ajustar la compensación entre canales adyacentes (tabla 2 y tabla 3).
    2. Añadir anticuerpos deseados (p. ej., anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA y anti CD90), según las instrucciones del fabricante, para una prueba (1 x 106 células en 100 μL) (tabla 3). Incubar por 20 min a 4 ° C. Añadir 3 mL de tampón FACS y centrifugado a 800 x g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante, resuspender en 100 μl de tampón FACS y analizar en un citómetro de flujo apropiado (criterio 2.2).
  2. Preparar el clasificador celular citómetro de flujo para el análisis.
    Nota:     se recomienda realizar el análisis en la misma máquina que se utilizará para clasificar en el paso 2.3 de la célula.
    1. Generar un protocolo como FSC/SSC, CD45/CD34 y CD45RA/CD90 (tres diagramas de flujo). Haga clic en un diagrama de flujo y añadir el diseño de la jerarquía de la población .
    2. Haga clic izquierdo en la trama de la FSC/SSC, seleccione la función de puerta de polígono y dibujar una puerta para excluir los desechos y células muertas. Destacar la nueva puerta y cámbiele el nombre a la dispersión en la ventana Inspector.
      Nota: Esto se denomina automáticamente como P1.
    3. Haga clic derecho en el centro de la trama de flujo CD45/CD34, desplácese para Mostrar las poblacionesy la trama de la dispersión de la puerta. Dibujar una puerta rectangular alrededor del CD45intCD34+ de las células a excluir no CD34 células y células nonhematopoietic, como bien como residual las plaquetas y los eritrocitos (CD45–). Cambiar el nombre de la puerta CD34+.
    4. El diagrama de flujo CD45RA/CD90 en el CD34 de la puerta+ población. Dibujar tres subgates independiente alrededor CD90+CD45RA células– (enriquecidas de HSCs), CD90–CD45RA células– (enriquecidas para progenitores multipotentes y Eritro-mieloide [MPPs/EMP]) y CD90–CD45RA + las células (enriquecidas de progenitores mieloides lympho [la]). Cambiar el nombre de las puertas y HSC, MPP-EMP, LMP, respectivamente.
    5. Cuando termine, asegúrese de que la jerarquía de la población contiene seis entradas jerárquicamente organizadas en el orden siguiente: 1) todos los eventos; 2) dispersión; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Asegúrese de que los diagramas de flujo y la forma de la puerta se ven como se ilustra en la figura 4.
    6. Ejecute sin manchas pre enriquecimiento glóbulos blancos para ajustar la tensión de FSC y SSC, todos los canales de fluorescencia (cuadro 2, ejemplo 5). Ejecutar cuentas de compensación solo manchado para ajustar la compensación entre canales adyacentes (tabla 2, las muestras 1-4). Todo queda sin mancha y tinción de las muestras con el ajustado y Protocolo, para documentar la eficacia del enriquecimiento de CD34 (tabla 2, muestras 6-9).
      Nota: Mantener la muestra final (tabla 2, muestra 10) para el análisis de flujo simultáneo y celda de clasificación en el paso 2.4.
  3. Configura el clasificador de células para la purificación de tipo de subconjuntos de CD34 en ensayos (CFC) de la célula formadora de colonias.
    Nota:     si se utiliza una máquina diferente para el análisis (paso 2.2), configurar el protocolo en el clasificador de la célula como se ha descrito en los pasos 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Ajuste el ángulo/voltaje de las corrientes de izquierda y derecha en el software de celular clasificador para depositar las células en tubos de 15 mL que contiene medio de CFC. Configurar el ángulo de la corriente de lado para evitar desalineamiento. Step-Wise, ajustar el ángulo de la corriente del lado desviado hasta las células clasificadas el medio de CFC y no el lado del tubo porque muy pocas células se ordenan.
    2. En el navegador, abra la carpeta de hojas de trabajo Global y crear un nuevo diseño de tipo utilizando el botón en el menú superior de la ventana del navegador. Cambie la entrada en el menú desplegable dispositivo de recolección 2 tubos, la entrada en el menú desplegable de precisión 4 vías pureza o unicelular y establezca los eventos de destino a 800-1.200 celdas. Haga clic en el campo de ubicación de tipo (izquierda o derecha), seleccione la entrada agregar en el menú y elegir la población a ordenar en el menú.
  4. Ordenar las células para los ensayos de CFC.
    Nota:     clasificación de los ensayos de CFC se realiza sólo con las células del producto enriquecido con CD34 (tabla 2, muestra 10).
    1. Muestra 10 de cargar, grabar eventos de 2.000-3.000 y ajuste fino de las puertas de la especie para adaptarse a las poblaciones de fuerza y destino de la señal.
    2. Cuando la instalación haya finalizado, adquirir células (cuadro 2, ejemplo 10). Adquirir datos como se describe en el paso 2.2.3, ajustar el flujo de 500-1.000 células/s y ordenar 800-1.200 células de i) la puerta de la dispersión, ii) el CD34+ puerta, iii) la puerta HSC, iv) la puerta de MPP-EMP y v) la puerta de la LMP en tubos separados que contengan 3,6 mL de CFC Medio.
      Nota: Clasificación para los ensayos de CFC se realiza sólo con las células del producto enriquecido con CD34 (tabla 3, muestra 10). Las células de la dispersión y CD34+ puertas deben ordenarse en forma individual, mientras que HSCs, MPP-EMPs y LMPs pueden ser clasificados simultáneamente en la posición de titular del tubo izquierdo y derecho.
    3. Vórtice y dispense 1 mL de la suspensión celular a cada uno de lo nontissue estéril, 3 x 3,5 cm, tratados con cultura de Petri. Incube las células a 37 ° C durante 10-14 días en un contenedor secundario (por ejemplo, un plato de Petri de 15 cm).
    4. Días 10-11 postplating, contar las colonias individuales de todas las tres placas por condición, basada en la morfología de las colonias.

3. Gene modificación de CD34+ HSPCs y la recuperación durante la noche (día 0)

  1. Diluir 2,5 mL de solución de CH-296 de 1 μg/μl a 50 μg/mL en 50 mL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS, véase la Tabla de materiales).
  2. Prepare frascos para la transducción de LV.
    1. Determinar el número aproximado de nontissue-cultura (no TC)-tratado de frascos necesarios (generalmente a partir de los recuentos de células determinados en el paso 1.4). Plan para placa de 1 x 107 células en 10 mL de medio cada frasco de T-75 (1 x 108 células total requeriría 10 frascos) y son tratados de TC no una placa de 12 pozos (transducción falsa condición). Añadir HBSS estériles y 50 μg/mL CH-296 la existencia del paso 3.1 a cada matraz/placa, en una concentración de 2 μg/cm2. Para frascos de T-75, use 3 mL de 50 μg/mL CH-296 + 7 de HBSS; para la placa de 12 pozos, use 160 μl de 50 μg/mL CH-296 + 340 μl de HBSS por pozo.
    2. Deje que los platos sientan imperturbado en RT en un banco limpio o en la campana de 2 h. aspirado CH-296 y reemplazarlo con un volumen similar de HBSS estéril + 2% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min, aspirar la HBSS y la BSA y lavar los platos con un volumen similar de HBSS estéril que contiene 2,5% 1 M HEPES, pH 7.0. Aspirar antes de platear las células (paso 3.4).
      Nota: Siguiente paso 3.2.2, no permita que las placas/frascos secar. Las placas que contienen los estériles HBSS + 2.5% 1 M HEPES se llevan a cabo a 4 ° C durante la noche (es decir,, preparar en el día -1).
  3. Cosecha y transduce la CD34 de las células+ de día -1.
    1. Con una pipeta de 10 mL, enjuagar células ligeramente adherentes por el lavado repetido, suave de cada frasco de cultivo con HBSS estéril. Asegúrese de que todas las células se separará (si es necesario, toque/palmada el frasco para aflojar las células).
    2. Centrifugar las células a 800 x g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de la transducción de señales a una concentración de 1 x 106 células/mL. Una vez que todas las células han sido recogidas, determinar el recuento celular, usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    3. Añadir 1 mL de la suspensión celular (1 x 106 células) a un pocillo de la placa de 12 pozos CH-296-revestida (para la muestra control transduced mock). Dividir el resto de las células entre los frascos de T-75 (paso 3.2.2), agregar aproximadamente 10 mL (1 x 107 células) por frasco. Permitir que las células se adhieran a la capa CH-296 por incubación a 37 ° C, 5% CO2 durante 30 minutos, con los tapones de ventilación.
    4. Descongelar los medios condicionados de virus (VCM, Tabla de materiales) y determinar la concentración en unidades infecciosas por mililitro (UI/mL)28,29,30,31,32 . Añadir el volumen adecuado de VCM en cada matraz T-75 de paso 3.3.3 e incubar las células a 37 ° C, 5% CO2.
      Nota: Si se realiza un simple transducción, incubar durante una noche; Si se realiza una doble transducción, repetir este stepapproximately 6 - 8 h después de la primer transducción sin un lavado y una recuperación de la fase y, a continuación, incubar durante una noche. Por ejemplo, para un frasco (1 x 107 células) con una deseada multiplicidad de infección (MOI) de 10, añadir 1 mL de virus dosificado en 1 x 108 UI/mL.

4. cosecha y preparación para infusión (día 1) de la célula

  1. Cosecha de las células.
    1. Recoger las células transduced y falsa como se describe en pasos 3.3.1 - 3.3.2. Realizar lavados secuenciales con 10 mL de HBSS, transfiriendo los lavados al tubo cónico con las células. Asegúrese de que todas las células hayan sido retiradas de los frascos, tapping/abofetear a los frascos si es necesario.
    2. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de HBSS. Combinar los tubos que contienen las células de la misma condición. Enjuague con 10 mL de HBSS y añadir a la suspensión de células. Determinar las cuentas de celular utilizando un hemocitómetro. Llevar el volumen celular total a 50 mL en HBSS y centrifugar a 800 x g durante 5 minutos.
  2. Pulso de prostaglandina E2 (PGE2) y preparar los reactivos para el producto de la infusión.
    1. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células transduced (no simulado) de 5 x 106/ml en medios de la HSPC sin citoquinas. Añadir 10 mM PGE2 a una concentración final de 10 μm. Incubar las células en hielo por 2 h, los remolinos suavemente cada 30 minutos.
    2. Durante el paso 4.2.1, Inactive por calor el suero autólogo (Tabla de materiales), envolver el recipiente en papel de cera e incubación a 56 ° C durante 30 minutos preparan el 2% de suero autólogo en mezcla (500 μl del suero inactivado con calor + 24,5 mL de HBSS), de HBSS bien, y Guarde la mezcla en hielo hasta su uso. También, durante el paso 4.2.1, recoger células transduced mock en una placa de 12 pozos por pipetear las células hacia arriba y hacia abajo con fuerza. Añadir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL, lavar 3 x con 1 mL de HBSS y agregar los lavados al misma tubo cónico de 15 mL.
    3. Después de 2 h de incubación de la PGE2, se lavan las células 2 x por centrifugación a 800 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante. Después del segundo lavado, resuspender las células en un volumen adecuado de la HBSS para contar, utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
      Nota: Las células se agrupan con frecuencia después de un pulso de PGE2, que puede hacer para el recuento de menos fiable. Si es así, utilice la cuenta de célula de paso 4.1.2 en lugar de paso 4.2.3.
  3. Reserva de células transduced y simulacros para el control de calidad (paso 5) del producto de infusión: 5 x 105 a 1 x 106 células por flujo citometría celular clasificación (pasos 5.1 y 5.3) y de aproximadamente 1 x 106 células de cultivo líquido (paso 5.2) y Colonia reacción en cadena de polimerasa (PCR) (paso 5.4).
  4. Preparar el producto de la infusión.
    1. Con el resto de las células transduced, realizar un tercer lavado en 50 mL de HBSS, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de HBSS + 2% de suero autólogo (preparado en el paso 4.2.2). Extraer la solución de 10 mL en una jeringa de 20 mL con una aguja de 16,5 G. Lavar el tubo con 10 mL de HBSS + suero 2% auto y sacar la colada en la misma jeringa para llevar el volumen total a 20 mL. La tapa de la jeringa con la tapa de la aguja, etiqueta de la jeringa y coloque en hielo para transporte/infusión.
    2. Incorporar el producto de células transduced en el huésped autólogo, situado dentro de un centro de investigación animal acreditados, a través de un catéter venoso central33,34. Monitorear recuento los animales trasplantados sanguíneo completo (CBCs) y química sanguínea y realizar estudio específico gene-marca ensayos adaptados al proyecto1,6,19.

5. Control de calidad

Nota: Citometría de flujo y separación celular se realizan después de que las células se infundieron en los animales como parte del seguimiento se describe en el paso 4.4.2. Datos de citometría de flujo se utiliza inmediatamente después del trasplante para determinar la composición de fenotípicamente definidos subconjuntos de célula de vástago y del progenitor en el producto de la infusión (pasos 5.1 y 5.3), mientras que el análisis de la CFC de ensayos se realiza 12-14 días postinfusion para determinar la eficacia de la modificación genética por Colonia PCR (paso 5.4).

  1. Realizar citometría de flujo y CFC clasificación de los productos de infusión.
    1. Analizar las células mediante citometría de flujo y purificar tipo de subconjuntos de CD34 para los ensayos de CFC, como se describe en la sección 2. Ensayos de semillas CFC de simulacros y transduced células CD34 (el producto de infusión después del pulso de la PGE2).
    2. Ordenar un máximo de 800 células por condición y vortex, placa, cultura y cuenta la CFC ensayos tal como se describe en el paso 2.4. Después de contar, escoger las colonias de los ensayos de la CFC para llevar a cabo colony PCR como se describe en el paso 5.4.
  2. Cultivo líquido
    1. Células de la placa para cultivo líquido en medios de la HSPC en 1 x 106/ml en placas no tratadas por el TC. En posttransduction días 2, 5 y 12, de la cosecha y contar las células por citometría de flujo. Celda de clasificación para los ensayos de CFC no es necesario.
    2. En los días 2 y 5, replate 33% de las células en fresco HSPC los medios de comunicación en el 1 x 106/ml. Congelar el 33% de las células en tampón de extracción de ADN para la PCR cuantitativa en tiempo real. Use el 33% de las células por citometría de flujo como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
    3. Utilizar estos datos de paso 5.2.2 para analizar la composición fenotípica de la progenie hematopoyética. Determinar la frecuencia de células CD34 + y fenotípicamente definidos subconjuntos como se describe en el paso 2.2.2 dentro de cada muestra. Comparar la composición de CD34 de las células+ entre las condiciones para determinar el efecto de la modificación genética.
      Nota: CD34+ las células deben mantener su expresión a lo largo de toda la cultura y contiene todos los subconjuntos fenotípicos. Una pérdida de CD90+CD45RA células– o una sobrerepresentación de subconjuntos fenotípicas puede indicar efectos directos o indirectos de la modificación genética.
  3. Cuantificar la expresión del transgén (proteína fluorescente por ejemplo., verde [GFP]) por citometría de flujo (opcional y dependiendo de la configuración experimental), adaptando el protocolo del paso 2.2.
    1. Añadir tres diagramas de flujo mostrando SSC/transgen (p. ej., SSC/GFP). Puerta de la primera parcela de HSCs, la segunda el MPPs-EMP y el tercero en LMPs. parcela cada transgénico versus (p. ej., GFP) y crear puertas llamados HSC-GFP++MPP-EMP-GFP y LMP-GFP+, respectivamente.
    2. Cuando termine, la jerarquía de la población tiene que contener nueve entradas jerárquicamente organizadas en el orden siguiente: 1) todos los eventos; 2) dispersión; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Nota: Cualquier expresión del transgén en cultivo líquido (e.g., días 5 y 12) reflejará mejor la eficacia de modificación genética determinada por PCR de Colonia en el paso 5.4. Puntos anteriores del tiempo en cultivo líquido sobrestiman la expresión del transgén, por LVs incómodas. Del mismo modo, clasificación de flujo de las células GFP+ para los ensayos el día 1 de CFC resultará en muchas colonias positivas falsas.
  4. Realizar PCR de Colonia.
    1. Después de la cuenta en los pasos 2.4.4 y 5.1.1, escoger colonias solo en 50 μl de tampón de extracción de ADN, utilizando un μl 10 o 20 μl pipeta y pipeta hacia arriba y hacia abajo para transferir las colonias a un tubo de un PCR tubo 8 tira tapa. Escoge ocho colonias de la condición falsa y 88 colonias de la condición transduced para generar una placa completa de 96 pocillos. Añadir 50 μl de tampón de extracción de ADN a cada pocillo.
    2. Extraer ADN de las colonias, utilizando un termociclador y el siguiente programa: 65 ° C/20 min y 99 ° C/10 min a 4 ° C mantener. Planea mover el ADN a-20 ° C tan pronto como sea posible para una calidad óptima.
    3. Llevar a cabo colony PCR para cuantificar células transduced LV, comparando el número de colonias de LV+ , usando las cartillas de Lenti F/R, a colonias total, usando las cartillas de la actina F/R y control (Tabla de materiales).

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Resultados

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El protocolo descrito anteriormente está diseñado para aislar y modificar genes de NHP CD34+ HSPCs, que posteriormente puede ser infundido en el host autólogo (figura 1 y figura 2). Al seguir este protocolo, generalmente obtenemos hasta 8 x 109 leucocitos total de cebada BM de macacos de cola de cochino y, doble a veces, esa cantidad de macacos rhesus. En ambas especies, el número de CD34+ HSPCs q...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vector de LV ingeniería es el método mejor caracterizado gene-modificar tipos de células como CD34+ HSPCs, para el posterior trasplante in vivo. El protocolo descrito aquí está diseñado para maximizar el número de HSPCs gen modificado que persisten a largo plazo en vivo y proporcionan beneficios clínicos en pacientes con diversas enfermedades malignas, infecciosas y genéticas. Aunque han surgido estrategias gene-edición durante la última década, las células modificadas de LV son los mejores estudiados in vitro...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Helen Crawford para la preparación de este manuscrito, Jim Woolace para diseño gráfico y Veronica Nelson y Devikha Chandrasekaran para participar en el desarrollo del protocolo. El desarrollo de este protocolo fue apoyado por subvenciones del NIH Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (R01 AI135953 y AI138329 a H.P.K.) y nacional del corazón, pulmón y Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 y U19 HL129902 a H.P.K.), así como NIH P51 OD010425 y, en parte, a través del centro del cáncer de NIH/NCI, apoyo beca P30 CA015704. H.P.K. es un investigador de Medicina Molecular de Markey y recibió el apoyo como el recipiente inaugural de la Cátedra José Carreras/E. Donnall Thomas dotado para la investigación del cáncer y la Cátedra Fred aparador para celular y Gene Therapy.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Solución salina equilibrada de Hank'sGibco14175095
solución salina tamponada con fosfatoGibco14190-144
Penicilina/estreptomicinaGibco15140-122
DimetilsulfóxidoSigma AldrichD2650-100
100% EtanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Suero bovino fetal inactivado por calorSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2,5 mL, 1 µ g/µ L)TaKaRAT100B
Albúmina sérica bovinaSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rata anti-ratón IgM perlas magnéticasMiltenyi Biotec130-047-301
Factor de células madre humanas recombinante (SCF)Peprotech300-07
Trombopoyetina humana recombinante (TPO)Peprotech300-18
Tirosina quinasa 3 (FLT-3) humana recombinante similar a FMS (FLT-3)Peprotech300-19
Sulfato de protaminaSigmaP-4505
14 mL Tubo de fondo redondo de polipropilenoCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
Separadores QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColumnasMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
Matraces T-75 tratados con TCBioexpressT-3001-2
Matraces T-75 sin tratamiento TCThermo-Fisher13680-57
Jeringas de 20 mLBD Biosciences302830
Agujas de 16,5 GBD Tapade 305198
BD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentre QE09050
Tapón de tira de 8 tubos PCR Tubes USAscientific1402-2708
Termociclador de 96 pocillosThermo-Fisher4375786
Filtros de preseparaciónMiltenyi Biotec130-041-407
Colador, célula; BD Halcón; Estéril; Malla de nylon; Tamaño de malla: 70um; Color: blanco; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Rotador de tubosMiltenyi130-090-753
3 mL Jeringas Luer-LockThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm placa de cultivo celularCorning430165
60 mm x 15 mm placa de cultivo celularCorning
placa de cultivo celular de 150 mm x 25 mmCorning430599
Frascos no tratados con TCFalcon353133
Qiagen Qiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10Biolegend328110
PE-CF594 Ratón Anti-Humano CD34 Clon:563BD horizonte562449
APC-H7 Ratón Anti-Humano CD45RA Clon: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Ratón Anti-NHP CD45 clon:d058-1283BD Biosciences561291
Suero autólogorecolectado de un huésped autólogo y criopreservado antes de la movilización y recolección de HSPC CD34+N/ABeard, B. C. et al. Selección eficiente y estable mediada por MGMT de células madre repobladas a largo plazo en primates no humanos. Revista de Investigación Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Selección eficiente y estable mediada por MGMT de células madre repobladas a largo plazo en primates no humanos. Revista de Investigación Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anticuerpo anti-CD34, clon 12.8Kiem LabN/ABeard, BC et al. Selección eficiente y estable mediada por MGMT de células madre repobladas a largo plazo en primates no humanos. Revista de Investigación Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Injerto policlonal multilinaje de células modificadas con el gen Cal-1 y selección in vivo después de la infección por SHIV en un modelo de primate no humano de SIDA. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGTCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Injerto policlonal multilinaje de células modificadas con el gen Cal-1 y selección in vivo después de la infección por SHIV en un modelo de primate no humano de SIDA. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Cbase de actina F: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Injerto policlonal multilinaje de células modificadas con el gen Cal-1 y selección in vivo después de la infección por SHIV en un modelo de primate no humano de SIDA. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Cbase de actina R: GAAGCATTTGGGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Injerto policlonal multilinaje de células modificadas con el gen Cal-1 y selección in vivo después de la infección por SHIV en un modelo de primate no humano de SIDA. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
de punta de jeringa de precisión430196 Extracción de ADN

Referencias

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