El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.
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Artículo de método
Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana
En este artículo
Resumen
Resumen
Movimiento estomático media intercambio del gas de la planta, que es esencial para la fotosíntesis y la transpiración. Apertura estomática y el cierre se logran por un aumento significativo y disminución en el volumen de la célula de guardia, respectivamente. Porque transporte transporte de iones y de agua se produce entre las células del protector y las células epidérmicas vecinas más grandes durante el movimiento estomático, la distribución espaciada de los estomas de la planta se considera una distribución óptima para el movimiento estomático. Sistemas experimentales para perturbar el patrón espaciado de estomas son útiles para examinar la importancia del patrón de espaciamiento. Se han identificado varios genes principales asociados con la distribución estomática espaciada y estomas agrupados pueden ser inducidas experimentalmente mediante la alteración de estos genes. Por otra parte, estomas agrupados pueden ser también inducidas por tratamientos exógenos sin modificación genética. En este artículo, describimos un sistema de inducción simple para estomas agrupados en Arabidopsis thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Nuestro método es fácil y directamente aplicables en líneas transgénicas o mutantes. Cloroplastos más grandes se presentan como un sello biológico celular de células de guardia agrupados inducida por sacarosa. Además, una imagen microscopio confocal representativa de los microtúbulos corticales se muestra como un ejemplo de observación intracelular de células agrupadas de guardia. Se mantiene la orientación radial de los microtúbulos corticales en agrupado células de guardia como en las células de guardia espaciadas en condiciones de control.
Introducción
El estoma de la planta es un órgano esencial para el intercambio de gases para la fotosíntesis y la transpiración, y movimiento estomático se logra por cambios significativos en las células del protector a través de la absorción de iones y la liberación de agua. Bajo el microscopio, se observa un patrón de distribución espaciada de estomas en la superficie de hojas y tallos. Esta distribución espaciada de estomas se considera a movimiento estomático, que está regulado por el intercambio de iones y agua entre las células de guardia y los vecinos de las células epidérmicas1,2. Inducción experimental para estomas....
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Protocolo
1. preparación de medio solución de 3% que contengan sacarosa 1/2 Murashige-Skoog
- Añadir 1,1 g de sales medio Murashige-Skoog y 15 g de sacarosa en un vaso.
- Añadir 490 mL de agua destilada y mezclar bien con una barra de agitación.
- Ajustar el pH a 5,8 con KOH.
- Diluir a 500 mL con agua destilada y transferir la solución en una botella mediana.
- Esterilizar la solución por autoclave (121 ° C, 20 min). Si no se utiliza inmediatamente, esta solución puede conservarse a 4 ° C después de la esterilización.
2. inducción de estomas agrupados por que contengan sacarosa solución medio tratamiento d....
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Resultados
Aquí, se presenta el protocolo para un simple método de inducir agrupamiento estomático que contengan sacarosa solución media en a. thaliana plántulas. Las células de guardia agrupadas en solución media que contienen sacarosa (figura 1B) tienen más cloroplastos que el protector de las células cultivadas en condiciones de control libre de sacarosa (figura 1A). La ampliación de los cloropl.......
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Discusión
Hemos presentado los protocolos para la inducción de estomas agrupados en a. thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Como se muestra aquí, este método es muy simple y no requiere ninguna habilidad especializada pero puede inducir eficientemente estomas agrupados. Más del 45% de las células de guarda son agrupado con 3% que contiene sacarosa solución medianas (valores promedio de más de 20 observaciones independientes)6. Por otra parte.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Prof. Seiichiro Hasezawa su amable apoyo de nuestro trabajo. Este trabajo fue financiado por donaciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHgrant números 19380 K 17 y 18 H 05492, desde la Fundación de Sumitomo para una subvención para proyectos de investigación de ciencia básica otorgar número 160146 y la Fundación de Canon a T.H. Este sistema experimental fue desarrollado bajo un apoyo financiero desde el número de las páginas JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 24 pocillos | Sumitomo Baquelita | MS-0824R | |
| Láser de 488 nm | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| Láser de 488 nm | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| Filtro de paso largo de 510 nm | Olympus BA510IF | ||
| 524 - 546 nm Filtro de paso | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| Paso corto de 530 nm | filtro Olympus | BA530RIF | |
| láser de 561 nm | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm filtro de paso de banda | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Cabezal de escaneo láser confocal | Yokogawa | CSU10 | |
| Cabezal de escaneo láser confocal | Olympus | FV300 | |
| Cámara CCD refrigerada | Fotometría | CoolSNAP HQ2 | |
| Software de adquisición de imágenes | Molecular Devices | MetaMorph versión 7.8.2.0 | |
| Software de adquisición de imágenes | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Aceite de inmersión | Olympus | Aceite de inmersión Tipo-F | ne = 1.518 (23 grados) |
| Microscopio invertido | Olympus | IX-70 | |
| Microscopio invertido | Olympus | IX-71 | |
| Murashige y Skoog Mezcla de sales vegetales | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T y Skoog F (1962) Un medio revisado para crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de tejidos de tabaco. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Lente del objetivo | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Aceite Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Lente objetivo | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sacarosa | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Referencias
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S.
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Reimpresiones y permisos
