Artículo de método

Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 de febrero de 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Movimiento estomático media intercambio del gas de la planta, que es esencial para la fotosíntesis y la transpiración. Apertura estomática y el cierre se logran por un aumento significativo y disminución en el volumen de la célula de guardia, respectivamente. Porque transporte transporte de iones y de agua se produce entre las células del protector y las células epidérmicas vecinas más grandes durante el movimiento estomático, la distribución espaciada de los estomas de la planta se considera una distribución óptima para el movimiento estomático. Sistemas experimentales para perturbar el patrón espaciado de estomas son útiles para examinar la importancia del patrón de espaciamiento. Se han identificado varios genes principales asociados con la distribución estomática espaciada y estomas agrupados pueden ser inducidas experimentalmente mediante la alteración de estos genes. Por otra parte, estomas agrupados pueden ser también inducidas por tratamientos exógenos sin modificación genética. En este artículo, describimos un sistema de inducción simple para estomas agrupados en Arabidopsis thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Nuestro método es fácil y directamente aplicables en líneas transgénicas o mutantes. Cloroplastos más grandes se presentan como un sello biológico celular de células de guardia agrupados inducida por sacarosa. Además, una imagen microscopio confocal representativa de los microtúbulos corticales se muestra como un ejemplo de observación intracelular de células agrupadas de guardia. Se mantiene la orientación radial de los microtúbulos corticales en agrupado células de guardia como en las células de guardia espaciadas en condiciones de control.

Introducción

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El estoma de la planta es un órgano esencial para el intercambio de gases para la fotosíntesis y la transpiración, y movimiento estomático se logra por cambios significativos en las células del protector a través de la absorción de iones y la liberación de agua. Bajo el microscopio, se observa un patrón de distribución espaciada de estomas en la superficie de hojas y tallos. Esta distribución espaciada de estomas se considera a movimiento estomático, que está regulado por el intercambio de iones y agua entre las células de guardia y los vecinos de las células epidérmicas1,2. Inducción experimental para estomas de clusters son útiles para investigar la importancia de la distribución espaciada de estomas.

Se ha reportado que el agrupamiento espacial de los estomas puede ser inducida por modificación genética de los genes clave para protector de celular diferenciación3,4 o tratamiento con un compuesto químico5. También nos informan que el tratamiento de inmersión con una solución de medios complementadas con azúcares como sacarosa, glucosa, y fructosa causada agrupamiento estomático en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana 6. Reducción callosa en las paredes celulares de nuevo separar meristemoides y las células epidérmicas se observó en la epidermis de cotiledón tratado con sacarosa, lo que sugiere que el tratamiento de inmersión en solución de sacarosa afecta negativamente la pared celular, que impide la fuga y acción ectópico de productos gen clave para la diferenciación de protector de la célula (e.g. factores de transcripción) hacia el lado epidérmico células6. Un mecanismo similar fue sugerido de estudios gsl8/chor mutantes7,8. Nuestro sistema experimental para la inducción reproducible de estomas agrupados utilizando solución de medio que contiene la sacarosa es bastante fácil y barato. También puede ser utilizado para investigar las estructuras intracelulares como orgánulos y el citoesqueleto en las células de guardia agrupados cuando se aplica a líneas transgénicas expresando marcadores fluorescentes que etiqueta las estructuras intracelulares9, 10.

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Protocolo

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1. preparación de medio solución de 3% que contengan sacarosa 1/2 Murashige-Skoog

  1. Añadir 1,1 g de sales medio Murashige-Skoog y 15 g de sacarosa en un vaso.
  2. Añadir 490 mL de agua destilada y mezclar bien con una barra de agitación.
  3. Ajustar el pH a 5,8 con KOH.
  4. Diluir a 500 mL con agua destilada y transferir la solución en una botella mediana.
  5. Esterilizar la solución por autoclave (121 ° C, 20 min). Si no se utiliza inmediatamente, esta solución puede conservarse a 4 ° C después de la esterilización.

2. inducción de estomas agrupados por que contengan sacarosa solución medio tratamiento de inmersión

  1. Esterilizar las semillas.
    1. Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 μl de 5% de cloro activo solución de NaClO y 1 μl de 10% Tritón X-100 a 500 μl de agua estéril.
    2. Colocar aprox. 50 transgénicos semillas de a. thaliana llevando un marcador fluorescente GFP CT11 como GFP-TUB612 en un tubo de 1,5 mL.
    3. Añadir 1 mL de solución de etanol 70% y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 minuto.
    4. Las semillas se hundirán hasta el fondo del tubo. En una mesa de trabajo limpia, suavemente Quite el etanol al 70% usando una micropipeta y añadir 1 mL de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión del tubo cinco veces y dejar durante 5 minutos.
    5. Lave las semillas. Sigue trabajando bajo condiciones asépticas en un banco limpio, suavemente retirar la solución con una micropipeta y añadir 1 mL de agua estéril. Repita este paso cinco veces.
  2. Añadir 1,5 mL de esterilizado que contenga sacarosa 1/2 Murashige-Skoog medio solución de 3% en cada pocillo de una placa de 24 pocillos en una mesa de trabajo limpia.
  3. Añadir dos semillas esterilizadas en cada pozo. Cinta de la tapa sobre la placa de 24 pocillos usando dos capas de parafilm.
  4. Transferencia de la placa de 24 pocillos a un conjunto de cámara de crecimiento a 23,5 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12-h/12-h con 100 μmol m−2 s−1 blanca luz e incubar durante 14 días.

3. microscopio Observación de estomas agrupados

  1. Lugar 30 μl de solución 3% sacarosa que contiene 1/2 Murashige-Skoog medio de un pozo de la placa de 24 pozos en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 x 26 mm, grueso: 1.0-1.2 mm).
  2. Quitar un cotiledón de una plántula de 14 días de edad con unas tijeras de disección. Flotar el cotiledón con la observación hacia arriba en la gota de la solución.
  3. Prepare la muestra de cotiledón según nuestra anterior método13. Esencialmente, coloque 30 μl de la solución en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 m m, grueso: 0.12-0.17 mm). Voltee el vidrio de la cubierta y colóquela suavemente sobre el cotiledón. Limpie el exceso de tampón usando un paño libre de pelusas.
  4. Configure a un espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal y seleccione agrupadas protector de las células para la observación con iluminación de campo claro.
  5. Adquirir imágenes confocales de fluorescencia con estructuras intracelulares según instrucciones del fabricante del microscopio.

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Resultados

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Aquí, se presenta el protocolo para un simple método de inducir agrupamiento estomático que contengan sacarosa solución media en a. thaliana plántulas. Las células de guardia agrupadas en solución media que contienen sacarosa (figura 1B) tienen más cloroplastos que el protector de las células cultivadas en condiciones de control libre de sacarosa (figura 1A). La ampliación de los cloropl...

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Discusión

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Hemos presentado los protocolos para la inducción de estomas agrupados en a. thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Como se muestra aquí, este método es muy simple y no requiere ninguna habilidad especializada pero puede inducir eficientemente estomas agrupados. Más del 45% de las células de guarda son agrupado con 3% que contiene sacarosa solución medianas (valores promedio de más de 20 observaciones independientes)6. Por otra parte...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Prof. Seiichiro Hasezawa su amable apoyo de nuestro trabajo. Este trabajo fue financiado por donaciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHgrant números 19380 K 17 y 18 H 05492, desde la Fundación de Sumitomo para una subvención para proyectos de investigación de ciencia básica otorgar número 160146 y la Fundación de Canon a T.H. Este sistema experimental fue desarrollado bajo un apoyo financiero desde el número de las páginas JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 24 pocillosSumitomo BaquelitaMS-0824R
Láser de 488 nmFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
Láser de 488 nmOlympusSapphire488-20/O
Filtro de paso largo de 510 nmOlympus BA510IF
524 - 546 nm Filtro de pasoSemrockFF01-535/22-25
Paso corto de 530 nm filtro OlympusBA530RIF
láser de 561 nmCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm filtro de paso de bandaSemrockFF01-624/40-25
Cabezal de escaneo láser confocalYokogawaCSU10
Cabezal de escaneo láser confocalOlympusFV300
Cámara CCD refrigeradaFotometríaCoolSNAP HQ2
Software de adquisición de imágenesMolecular DevicesMetaMorph versión 7.8.2.0
Software de adquisición de imágenesOlympusFLUOVIEW v5.0
Aceite de inmersiónOlympusAceite de inmersión Tipo-Fne = 1.518 (23 grados)
Microscopio invertidoOlympusIX-70
Microscopio invertidoOlympusIX-71
Murashige y Skoog Mezcla de sales vegetalesFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T y Skoog F (1962) Un medio revisado para crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de tejidos de tabaco. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Lente del objetivo OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Aceite Iris 1.35NA = 1.35
Lente objetivo OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SacarosaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015
corto

Referencias

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  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

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