Un protocolo de acero inoxidable para el aislamiento de ARN de alta calidad del Laser capturar las células Microdissected de Purkinje en el cerebelo humano Post-Mortem

Resumen

Este protocolo utiliza un enfoque libre de manchas para visualizar y aislar a las células de Purkinje en tejido fresco congelado del cerebelo humano post-mortem mediante microdisección de captura láser. El propósito de este protocolo es generar cantidades suficientes de ARN de alta calidad para secuenciación del RNA.

Resumen

Microdisección de captura láser (LCM) es una herramienta ventajosa que permite la acumulación de las células citológico o fenotípicamente pertinentes o regiones de tejidos heterogéneos. Producto capturado se puede utilizar en una variedad de métodos moleculares para proteínas, aislamiento de DNA o RNA. Sin embargo, la preservación del ARN del tejido de cerebro humano postmortem es especialmente desafiante. Técnicas de visualización estándar para LCM requieren histologic o procedimientos de tinción inmunohistoquímica que pueden degradarán RNA. Por lo tanto, hemos diseñado un protocolo de acero inoxidable para la visualización de LCM con la finalidad de preservar integridad de RNA en tejido de cerebro humano postmortem. La célula de Purkinje del cerebelo es un buen candidato para la visualización de acero inoxidable, debido a su tamaño y localización característica. La corteza cerebelosa tiene distintas capas que difieren en la densidad celular, lo que un buen arquetipo para identificar bajo el microscopio de alta magnificación. Las células de Purkinje son neuronas grandes, situadas entre la capa de células del gránulo, que es una red densamente celular de neuronas pequeñas, y la capa molecular, que es escasa en cuerpos de la célula. Gracias a esta arquitectura, el uso de acero inoxidable visualización es factible. Otros sistemas de órganos o células que imitan este fenotipo sería convenientes. El protocolo de acero inoxidable está diseñado para fijar tejido congelado con etanol y eliminar lípidos con xileno para mejorar la visualización morfológica bajo microscopia ligera de alta magnificación. Este protocolo no tiene en cuenta otros métodos de fijación y está diseñado específicamente para las muestras de tejido fresco congelado con una radiación ultravioleta (UV)-sistema LCM. Aquí, presentamos un protocolo completo para el seccionamiento y la fijación de tejido cerebeloso humano fresco congelado post mortem y la purificación del ARN de las células de Purkinje aisladas por UV-LCM, preservando calidad de RNA para la posterior secuenciación del RNA. En nuestras manos, este protocolo produce niveles excepcionales de visualización celular sin necesidad de coloración de los reactivos y rendimientos RNA con números altos de integridad de RNA (≥8) según sea necesario para los experimentos de perfilamiento transcripcionales.

Introducción

Microdissection de la captura del laser (LCM) es una herramienta de investigación valiosa que permite la separación de células patológico relevantes para la posterior evaluación molecular conducida. El uso de análisis moleculares en estas muestras de tejido heterogéneo y la correlación con datos clínicos y patológicos es un paso necesario en la evaluación de la significación traslacional de la investigación biológica¹. Al analizar los datos de la expresión del gene del RNA, el uso de secciones congeladas del tejido es muy recomendable ya que permite excelente calidad de RNA como maximiza cantidad². Se ha establecido bien....

Protocolo

Todas las muestras humanas utilizadas en este protocolo se han obtenido con consentimiento informado y han sido aprobadas por la Junta interna de revisión (IRB) en la Universidad de Columbia y la Universidad de Yale.

Nota: La totalidad de este protocolo debe seguir RNA estricto manejo de las directrices, por el que se utiliza siempre una mano enguantada, todas las superficies se limpian con un descontaminador de RNasa y todos los materiales de trabajo son RNA/DNA/nucleasa gratis.

1. prueba de integridad del ARN del tejido antes de LCM a partir

Nota: Prue....

Resultados

Este protocolo describe los pasos para preparación de tejido de cerebro humano postmortem fresco congelado para UV-LCM. Anotaciones y especificaciones completa se dan para corte en criostato, ya que puede ser difícil cortar tejido cerebral congelado fresco con un alto grado de precisión. El punto más importante a considerar es que el tejido fresco congelado es extremadamente frío y requiere una cantidad significativa de tiempo para aclimatarse a la temperatura más caliente de un criostato.......

Discusión

El protocolo presentado aquí es modificado específicamente para un enfoque inoxidable en visualizar morfológicamente distintos tejidos para UV-LCM. Este método está diseñado para maximizar la integridad del RNA para la posterior secuencia de RNA directa, manteniendo un mayor nivel de visualización de tejido. La capacidad de distinguir diferentes tipos de células para la captura, para crear la población pura de células posible, es esencial para la comprensión de diferentes perfiles moleculares en los tejidos humanos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Portaobjetos de membrana para tejidos. No recomendamos el uso de portaobjetos de vidrio.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Los tapones opacos se utilizan solo para mejorar la visualización en visores invertidos:
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Otros productos de descontaminación de RNasa también son adecuados. Úselo para limpiar todas las superficies antes de trabajar.
Etanol de 200 pruebas	Decon Laboratories	2701	Si utiliza etanol alternativo, asegúrese de que sea de alta calidad. Esencial para la fijación de tejidos.
Xilenos (Certificado ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	Si utiliza xileno alternativo, garantice una alta calidad. Esencial para la visualización de tejidos.
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977-015	Otra agua libre de ARN / ADN / nucleasa también adecuada. Se utiliza solo en dilución de etanol.
Tarros de deslizamiento Slide-Fix	Evergreen	240-5440-G8K	Cualquier soporte/tarro de portaobjetos también es adecuado. Debe limpiarse antes de usar. Se utiliza para la fijación después del seccionamiento.
Placa estabilizadora, conjunto 70 mm 100 μ m	Leica Biosystems	14041933980	tipo de placa estabilizadora está determinado por el tipo de criostato y la ubicación de la fijación en el escenario. Todos los criostatos tienen diferentes requisitos.
Pirocarbonato de dietilo (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC de cualquier proveedor servirá. Siga las instrucciones para el tratamiento del agua.
Toallitas Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Las toallitas Kimwipes se pueden pedir a cualquier proveedor y usar en cualquier tamaño. Las toallitas Kimwipes se utilizan para limpiar el microscopio y el criostato.
Compuesto Tissue-Plus O.C.T. Fisher	Scientific	23-730-571	Cualquier marca de OCT es aceptable. No se incrustará ningún tejido en la OCT, es difícil unir el tejido al 'mandril'.
Cuchillas de micrótomo de perfil bajo Edge-Rite	Thermo Scientific	4280L	está determinado por el tipo de criostato. Todos los criostatos tienen diferentes requisitos.
Leica Microsystems 3P  MANDRILES DE CRIOSTATO DE 25 + 30 MM	El		tipo de mandril NC0558768 Fisher Scientific está determinado por el tipo de criostato. Todos los criostatos tienen diferentes requisitos. Cualquiera de los dos tamaños es adecuado.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Necesario para la extracción de ARN después de LCM. El tampón de lisis RLT es esencial para recoger las células capturadas de la tapa opaca.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Necesario para la extracción de ARN de las preparaciones de secciones, que se realizan antes de la LCM para probar la integridad del ARN de los tejidos de partida.
El conjunto de DNasa libre de ARNasa	Qiagen	79254	Dnase eliminará cualquier ADN para permitir una población de ARN puro. Asegúrese de que Dnase esté fresco.
2-Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Volumen comprado a discreción del usuario. Necesario para la adición al tampón RLT para la lisis celular. Previene la actividad de la RNasa.
Globo Científico  Tubo de microcentrífuga graduado certificado por lote (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Cualquier tubo de 2 mL que esté libre de ARNasa, DNasa, ADN humano y pirógeno servirá.