Ingeniería genética de Dictyostelium discoideum las células basada en selección y crecimiento de las bacterias

Resumen

Dictyostelium discoideum es un organismo popular modelo para estudiar los complejos procesos celulares tales como la migración celular, la endocitosis y el desarrollo. La utilidad del organismo depende de la viabilidad de la manipulación genética. Aquí, presentamos métodos para transfectar células de Dictyostelium discoideum que superaran las limitaciones existentes de cultivo de células en medios líquidos.

Resumen

Discoideum de Dictyostelium es un intrigante organismo modelo para el estudio de procesos de diferenciación celular durante el desarrollo, señalización de la célula y otras preguntas de biología celular importante. Las tecnologías disponibles para manipular genéticamente células de Dictyostelium están bien desarrolladas. Transfecciones pueden realizarse utilizando diferentes marcadores seleccionables y reciclaje, incluyendo recombinación homóloga y mutagénesis de insertional del marcador. Esto es apoyada por un genoma bien anotado. Sin embargo, estos enfoques están optimizados para líneas celulares axénicos de crecimiento en cultivos líquidos y son difíciles de aplicar a las células de tipo salvaje no axénicos, que sólo se alimentan de bacterias. Las mutaciones que están presentes en cepas axénicos molestar Ras señalización, causando excesiva macropinocitosis, necesaria para la alimentación y afectan la migración celular, que confunde la interpretación de los experimentos de quimiotaxis en esas tensiones y transduction de la señal. Intentos anteriores para manipular genéticamente células no axénicos han carecido de eficiencia y requiere procedimientos experimentales complejos. Hemos desarrollado un protocolo de la transfección simple que, por primera vez, supera estas limitaciones. Ésos serie de grandes mejoras en genética molecular de Dictyostelium permite a las células de tipo salvaje ser manipulado tan fácilmente como las cepas estándar de laboratorio. Además de las ventajas para el estudio de procesos de señalización y motilidad incorruptos, mutantes que interrumpen el crecimiento basado en la macropinocitosis ahora pueden ser fácilmente aislados. Además, el flujo de trabajo de transfección todo se aceleró considerablemente, con células recombinantes que pueden generarse en días en lugar de semanas. Otra ventaja es que genética molecular más puede realizarse con muestras de Dictyostelium tipo salvaje recién aisladas del ambiente. Esto puede ayudar a extender el alcance de los enfoques utilizados en estas áreas de investigación.

Introducción

El género Dictyostelium son ameba social suelo-que viven que se alimenta principalmente de bacterias. Ser colocado en el phylum Amoebozoa, han aislado un gran número de especies que se pueden agrupar en cuatro clados diferentes¹. La especie discoideum de Dictyostelium (D. discoideum) se ha convertido en un organismo popular modelo para estudiar los complejos procesos celulares tales como la migración celular y la fagocitosis. Controlar y estandarizar las condiciones experimentales, axénico celular han desarrollado líneas que son capaces de crecer en medio líquido complejo o definido en la ausencia de bacterias². De particular importancia son el Ax2, Ax3, y cepas de Ax4, que fueron todos generadas en la década de 1970 y en última instancia deriva de un salvaje solo aislar NC4³. Se desarrollaron herramientas para la ingeniería genética en estas cepas axénicos, resultando en la primera eliminatoria Publicada en 1987^4,5. Protocolos más fueron desarrollados y optimizados para el uso bajo condiciones axénicos^6,7.

Adaptación de estos protocolos a tipo salvaje D. discoideum cepas que no son capaces de crecer en caldo líquido se han intentado por varios laboratorios. Sin embargo, no esto es totalmente acertado ya que los protocolos de la transfección son complejos y carecen de eficacia, en parte debido a la capacidad de las bacterias al actuar como un sumidero para los reactivos selectivos^8,9. Como resultado, esencialmente todo moleculares datos sobre D. discoideum provienen de descendientes de una sola cepa de tipo salvaje. Hemos querido superar esta limitación y desarrollar un método para modificar genéticamente células de D. discoideum independientes de su capacidad para crecer en medio líquido. La necesidad de un método puede explicarse por la observación que fue asumido en el pasado que las mutaciones permitiendo el crecimiento axénico eran principalmente neutrales y no afectar a fisiología de la célula. Esta suposición sólo es parcialmente correcta. En general, hay dos diferencias notables; en primer lugar, entre los diferentes aislaron axénicos cepas y en segundo lugar, cuando estas cepas axénicos se compararon con aislamientos salvajes no axénicos^8,9.

Tal vez el factor más crítico es el clave gen axénico, hachaB, que fue identificado recientemente como RasGAP NF1. La principal función de NF1 como un RasGAP es refrenar Ras actividad³. La supresión de la enzima en todas las cepas axénicos conduce a excesiva actividad de Ras que se manifiesta como la formación de grandes manchas de Ras activadas. Estos parches de Ras ampliados conducen a la acumulación de PIP3 en la membrana plasmática. Los parches que aparecen coincidentes de PIP3 y Ras activa son una plantilla para la formación de una colmena circular que eventualmente se cierra y conduce a la formación de macropinosomes¹⁰. La consecuencia es un aumento excesivo de actividad macropinocytic. Macropinocitosis es un proceso impulsado por la actina. Un concurso para citoesqueleto componentes para la formación de pseudópodos o macropinosomes es el resultado. Su impacto en el comportamiento celular se refleja en la casi completa prevención de Quimiotaxis de células vegetativas a folato¹¹. Los parches de PIP3 masivamente agrandados son muy persistentes. Incluso en células hambrientos, los parches de PIP3 quedan y pueden ser malinterpretados como pseudópodos, que pueden causar problemas de interpretación de estudios sobre quimiotaxis al campo.

En algunos casos, la mutación de NF1 es experimentalmente útil. Esto nos lleva a una segunda motivación para el desarrollo de un método de transfección para bacteriano crecido D. discoideum las células, puesto que el aumento en tasa de macropinocitosis hace valiosa para la investigación de los aspectos fundamentales de este proceso^{12 células axénicos} . Sin embargo, la mutación en los genes necesarios para la macropinocitosis, como Ras y PI3 quinasas¹⁰, casi han abolido crecimiento axénico, lo que es necesario manipular estas células a través del crecimiento de las bacterias. Otra razón que hace valioso transfecciones basados en bacterias es el creciente uso de Dictyostelids para explorar cuestiones de la evolución de multi-celularidad^13,14, reconocimiento kin^15,16, y altruista comportamiento celular, que depende principalmente del uso del recientemente aisladas de tipo salvaje¹⁷. Todos mencionados investigación puede facilitarse mediante métodos eficientes para la manipulación genética de aislados silvestres, que son no axénicos y no crecen en caldo líquido.

Nuestros protocolos permiten la superación de las limitaciones descritas. Tomados en conjunto, la posibilidad de realizar manipulaciones genéticas con bacteriano crecido beneficios de D. discoideum las células sostiene para todos los investigadores de Dictyostelium , incluso si es sólo el aumento de la velocidad del proceso de selección debido al más rápido crecimiento de la ameba (tiempo de duplicación de 4 h) de bacterias en comparación con el crecimiento en medios axénicos (10 h tiempo de duplicación).

Protocolo

1. preparación de células y materiales

1. Preparación de buffer SorMC
   1. Preparar 100 mL de 100 x buffer (tampón Sorensen como MgCl₂ y CaCl₂) de SorMC disolviendo 20,36 g de KH₂PO₄ (15 mM) y 5,47 g de Na₂HPO₄·7 H₂O (2 mM) en 100 mL de agua O de Dec₂. Agitar la solución a temperatura ambiente (RT) y llevar el volumen a 100 mL con dH₂O.
      Nota: El buffer resultante tiene un pH de 6 y no necesita ajuste.
   2. Producir 1000 mL de 1 x de solución diluida en ddH₂O. Añadir 50 μl cada de MgCl₂ y CaCl₂ alcanzar concentraciones finales de 50 μm. Filtro de esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm.
      Nota: Siempre añadir MgCl₂ y CaCl₂ en el búfer de 1 x para evitar la precipitación de las sales en el 100 x solución.
   3. Por otra parte, preparar KK₂ buffer (2,2 g de KH₂PO₄ y 0,7 g de K₂HPO₄ para 1 L de tampón) suplementado con 50 μm MgCl₂ y 50 μm CaCl₂ (en adelante KK₂MC). Use este tampón a lo largo en vez de SorMC.
2. Preparación de bacterias como fuente de alimento de D. discoideum
   1. Utilice una sola Colonia de K. aerogenes e inocular 1 L de medio LB (caldo de lisogenia). Utilizar un matraz de 2 L. Deje que las bacterias crecen durante la noche a 37 ° C con agitación a 220 rpm.
      Nota: Si se requieren grandes cantidades de bacterias, utilizar los medios más ricos como 2xTY (medio triptona, extracto de levadura) o SOB (caldo super óptimo) en lugar de libras. En caso de que no se permite el uso de K. aerogenes bacteria debido a restricciones de seguridad, BL21 e. coli se puede utilizar.
   2. Cosechar las células al día siguiente les girando hacia abajo en dos tubos de centrífuga de 500 mL en ~ 6.600 x g durante 20 minutos las bacterias de lavado una vez con 500 mL de buffer SorMC.
   3. Resuspender el precipitado en 20 mL de SorMC. Compruebe el OD₆₀₀ (densidad óptica a 600 nm) usando un fotómetro. Diluir con el mismo buffer a un OD₆₀₀ de alrededor de 100.
      Nota: K. aerogenes bacteria es difícil de pellets, para que una relativamente de alta velocidad para girar hacia abajo de las bacterias es necesaria para evitar la pérdida de las bacterias de los alimentos. La solución bacteriana resultante puede almacenarse hasta por 4 meses en la nevera a 4 ° C y mantener su utilidad como fuente de alimento para la D. discoideum. 1 L de noche K. aerogenes suspensión cultivada en medio LB generalmente rinde 20 mL de un OD₆₀₀ de alrededor de 100.
      PRECAUCIÓN: Para asegurarse de que las bacterias preparadas son un monocultivo de K. aerogenes, realizar todos los pasos debajo de una campana.
3. Preparación de buffer de electroporación H40
   1. Preparar 100 mL de solución tampón, disolver 0,952 g de HEPES en ddH₂O agua y añadir 100 μl de MgCl₂ de una solución de 1 M. Ajustar a pH 7 con KOH para valoración. Esterilizar el búfer utilizando un filtro de 0,22 μm o autoclave. Uso de HEPES libre de ácido y no la sal de sodio.
4. Realizar preparación de plásmido siguiendo el protocolo del fabricante y usando los kits de resumen en la Tabla de materiales. Utilice la plásmidos resumida en la tabla 1.
   Nota: La calidad del ADN utilizado para transfección es crucial. La selección de D. discoideum transfectants en bacterias tiene requisitos específicos para los promotores de conducción de la selección y expresión del cassette (ver discusión).

nombre de plásmido	resistencia y selección de bacterias	resistencia y selección en Dictyostelium	etiqueta
plásmidos de expresión Extracromosómica
pDM1203	Ampicilin	G418	No
pDM1207	Ampicilin	G418	N-terminal GFP
pDM1208	Ampicilin	G418	N-terminal mCherry
pPI159	Ampicilin	G418	N-terminal mNeon
pPI437	Ampicilin	G418	N-terminal mScarlet
pPI54	Ampicilin	G418	N-terminal mTurquoise2
pDM1209	Ampicilin	G418	C-terminal GFP
pDM1210	Ampicilin	G418	C-terminal mCherry
pPI143	Ampicilin	G418	C-terminal mNeon
pPI459	Ampicilin	G418	C-terminal mScarlet
pPI142	Ampicilin	G418	C-terminal mTurquoise2
plásmidos lanzadera
pDM344	Ampicilin	No	No
pDM1019	Ampicilin	No	N-terminal GFP
pDM1018	Ampicilin	No	N-terminal mCherry
pPI152	Ampicilin	No	N-terminal mNeon
pPI418	Ampicilin	No	N-terminal mScarlet
pPI150	Ampicilin	No	N-terminal mTurquoise2
pDM1021	Ampicilin	No	C-terminal GFP
pDM1020	Ampicilin	No	C-terminal mCherry
pPI153	Ampicilin	No	C-terminal mNeon
pPI457	Ampicilin	No	C-terminal mScarlet
pPI151	Ampicilin	No	C-terminal mTurquoise2
plásmidos de expresión inducible Extracromosómica
pDM1038	Ampicilin	Higromicina	No
pDM1047	Ampicilin	Higromicina	N-terminal GFP
pDM1046	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mCherry
pPI450	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mNeon
pPI452	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mScarlet
pPI449	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mTurquoise2
pDM1049	Ampicilin	Higromicina	C-terminal GFP
pDM1048	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mCherry
pPI470	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mNeon
pPI460	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mScarlet
pPI469	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mTurquoise2
Act5 refugio a plásmidos
pDM1501	Ampicilin	Higromicina	No
pDM1513	Ampicilin	Higromicina	N-terminal GFP
pDM1514	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mCherry
pPI231	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mNeon
pPI419	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mScarlet
pPI228	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mTurquoise2
pDM1515	Ampicilin	Higromicina	C-terminal GFP
pDM1516	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mCherry
pPI230	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mNeon
pPI458	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mScarlet
pPI229	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mTurquoise2
Plásmidos de expresión de REMI
pDM1220	Ampicilin	Higromicina	No
pDM1351	Ampicilin	Higromicina	N-terminal GFP
pDM1259	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mCherry
pPI465	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mNeon
pPI468	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mScarlet
pPI466	Ampicilin	Higromicina	N-terminal mTurquoise2
pDM1352	Ampicilin	Higromicina	C-terminal GFP
pDM1305	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mCherry
pPI471	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mNeon
pPI467	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mScarlet
pPI472	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mTurquoise2
objeto de plásmidos de marco
pDM1355	Ampicilin	Higromicina	C-terminal GFP
pPI461	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mCherry
pPI462	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mNeon
pPI464	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mScarlet
pPI463	Ampicilin	Higromicina	C-terminal mTurquoise2
plásmidos de Knock-out
pDM1079	Ampicilin	Blasticidin	No
pDM1080	Ampicilin	Nourseothricin	No
pDM1081	Ampicilin	Higromicina	No
pDM1082	Ampicilin	G418	No
Plásmidos de expresión CRE
pDM1483	Ampicilin	Nourseothricin	No
pDM1489	Ampicilin	Higromicina	No
pDM1488	Ampicilin	G418	No

Tabla 1: Lista de plásmido de transfecciones no axénicos.

5. Creación de células de Dictyostelium para transfección
   1. Crecimiento K. aerogenes a confluencia en SM medio (ricos en nutrientes) durante la noche en las culturas de excelencia puede almacenarse hasta por 2 semanas a 4 ° C.
   2. Añadir 400 μL de esta suspensión bacteriana a una placa de agar SM (peptona 10 g/L; levadura extracto 1 g/L; glucosa 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO₄ anhidro 0,49 g/L; 1.7% de agar) y repartir uniformemente. Tomar un bucle estéril y sembrar con células de Dictyostelium . Propagación de las células en un borde de la placa.
   3. Incubar la placa a 22 ° C durante 2 días para zonas de crecimiento suficientemente grande para la transfección.
      Nota: Para variedades de Dictyostelium que hacer zonas de gran crecimiento (por ejemplo, Ax3, DH1 o JH10), ni para inexpertos experimentadores, utilice claro placas en su lugar. Para ello, siga las instrucciones en pasos 1.5.4 a 1.5.6.
   4. Tomar un bucle estéril y sembrar con células de Dictyostelium (aproximadamente 2-4 x 10⁵ células). Transferir las células a 800 μl de un denso K. aerogenes suspensión en células SM. mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
   5. Transferir 400 μL, 200 μL, 100 μl y 50 μL en placas de agar SM frescas. Añadir a cada placa 400 μL de la suspensión adicional de SM K. aerogenes , repartir uniformemente y seque.
   6. Incubar las placas a 22 ° C durante 3 días hasta que las placas queden translúcidas.
      Nota: Debido a su rápida tasa de crecimiento, las bacterias producen inicialmente un césped confluente y las amebas posteriormente "claro" la placa de la bacteria. El tiempo requerido para este proceso puede variar dependiendo del fondo de la cepa y la capacidad de células mutantes creciendo las bacterias.

2. transfección de células de Dictyostelium basado en selección bacteriana

Figura 1 : Flujo de trabajo para la transfección de células de Dictyostelium crecido bacterias. A continuación se enumeran los pasos para la transfección. Crecer D. discoideum las células en una placa de SM con K. aerogenes bacteria (rojo). Cosecha de células sólo desde el frente de alimentación (verde), evitando las células que ya están desarrollando (verde oscuro). Lavar las células en H40. Resuspender las células a una densidad final de 2-4 x 10⁷ células/mL. Mezclar la suspensión de células con 1-2 μg de DNA. Transferir la mezcla a las células de la cubeta y pulso una electroporación. Transferir las células directamente después de la electroporación a un plato con SorMC y las bacterias. Permitir a las células a recuperar para 5 h antes de añadir el marcador seleccionable. Para plásmidos extracromosómicos, agregue la selección directamente en el plato. Transfectants son generalmente visibles después de 2 días. Para construcciones lineal que buscan una integración en el genoma, establecer tres diluciones como se indica y añadir a la selección. Las bacterias son tomadas de la OD₆₀₀ = 100 solución. Mezclar bien los tubos y transferir las células en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano. Utilice dos placas por dilución. Pipetear 150 μL de la suspensión celular en cada pocillo. Tarda unos 5 días hasta que apretado colonias visibles. Los pozos rojo muestran un ejemplo de la cantidad habitual de las células exitosamente transformadas obtenidas (panel superior modificada de la anterior publicación²²). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Para preparar las placas con suspensión K. aerogenes , añadir 10 mL de tampón de SorMC que contiene bacterias de K. aerogenes a una densidad de OD₆₀₀ = 2 (Añadir 200 μL de los preparados de OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes solución stock para la concentración de bacterias) en 10 cm el cultivo de tejidos tratados plato de petri.
   Nota: Esta placa es necesaria más tarde para cultivar la transfected las células de la D. discoideum . Como alternativa, puede utilizar una placa de 6 pozos de cultivo de tejidos. En el caso de la transfección de plásmidos Extracromosómica, la placa de la pozo 6-cultivo de tejidos es más eficiente de los recursos. Use 2 mL de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) suspensión por pozo.
2. Preparación de células de Dictyostelium
   1. Utilizando un asa de inoculación desechables de 10 μl, raspar las células de las zonas de crecimiento (aproximadamente 3 cm) de la placa de cultivo (borde de la zona despejada) o limpiar la placa. Transferir las células a un tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de tampón H40 helada.
      Nota: El tiempo de cosechar células de limpieza placas es crucial. Cosecha rendimientos demasiado pronto demasiado poco una cantidad de células, mientras se cosecha a finales aumenta el riesgo de ceder parcialmente había desarrollado células.
   2. Lavar las células a spinning por 2 min a 1.000 x g o flash-spinning 2 s a 10.000 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en H40 buffer a una densidad final de 2-4 x 10⁷ células/mL. Mantener las celdas frías durante el procedimiento entero de la transfección. Utilice una mezcla de agua helada para asegurar el contacto directo de los tubos y el hielo.
3. Electroporación
   1. Añada 100 μl de células a un tubo con 1-2 μg de DNA. Mezclar cuidadosamente mediante pipeteo arriba y abajo.
   2. Transferir la mezcla de ADN de la célula en una cubeta de electroporación previamente enfriada (espacio de 2 mm).
   3. Las células con la siguiente configuración de onda cuadrada de pulso: 350 V, 8 ms, 2 pulsos y el intervalo de pulso de 1 s.
      Nota: No agregue más de 2 μg de DNA. Cantidades mayores son tóxicas para las células y disminuyen la eficacia de transfección. Total añadido volumen de ADN no debe exceder 5 μl.
   4. Transferir las células inmediatamente a los anterior preparado 10 cm placa de Petri con SorMC K. aerogenes y permitir a las células a recuperar para 5 h.
      Nota: Revise las celdas de la placa de Petri bajo un microscopio invertido. Las células aparecerán ronda directamente después de la electroporación pero volverá a su forma ameboides después de 30 minutos, cuando han tenido suficiente tiempo para conectar correctamente a la superficie.
4. Selección de transfectants: dependiendo de si la transfección tiene como objetivo generar un knock out, knock-in o act5 knock-in o para expresar una proteína fluorescente reportera de un plásmido extracromosómico, llevar a cabo el proceso de selección a través de uno de a continuación describe métodos.
   Nota: A diferencia de las células axenically cultivadas, bacteriano crecido las células son altamente resistentes a blasticidin. Selección, por lo tanto, se efectúa siempre utilizando G418 o Higromicina (ver discusión).
   1. Knock-out, knock-ins y act5 knock-ins
      1. Separar las células cuidadosamente de la caja Petri repetidamente forzando el líquido de una pipeta sobre la superficie.
      2. Establecer tres diluciones de la suspensión de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) y añadir el agente selectivo según el resistencia utilizado (véase figura 1).
      3. Baja dilución: mezclar 9 mL de la suspensión celular con 20,4 mL de SorMC y 600 μl de la solución madre de K. aerogenes .
      4. Dilución media: mezclar 900 μl de suspensión celular con 28,5 mL de SorMC y 600 μl de la solución madre de K. aerogenes .
      5. Alta dilución: mezclar 90 μl de la suspensión celular con 29,3 mL de SorMC y 600 μl de la solución madre de K. aerogenes .
      6. Añadir 30 μl de marcador seleccionable (100 x solución madre).
      7. Distribuir las diluciones preparadas en placas de 96 pozos fondo plano tejido cultura Pipetear 150 μL de la suspensión celular en cada pocillo.
         Nota: Este procedimiento tiene como objetivo clones solo pantalla en lugar de las poblaciones. La selección toma unos 5-7 días, dependiendo de la construcción usada.
   2. Plásmidos extracromosómicos
      1. Añadir el marcador seleccionable directamente en el plato de 10 mL (ver figura 1).
         Nota: No hay que configurar las diluciones, ya que no hay ningún deseo de poblaciones clónicas. El proceso de selección de plásmidos extracromosómicos es más rápido debido a números de copia alta presentes en las células de la D. discoideum . Transfectants puede esperarse después de 32 horas a 2 días.
         PRECAUCIÓN: Los antibióticos que se utilizado como marcador seleccionable son tóxicos. Guantes.
5. Los clones obtenidos para tranfectants positivo de la pantalla. Intentos de knock-out o knock-in, siga las instrucciones en el paso 2.5.1. Comprobar el éxito de la transfección de plásmidos extracromosómicos siguiendo las instrucciones en el paso 2.5.2.
   1. Knock-out, knock-ins y act5 knock-ins, realizar la pantalla inicial a través de PCR para confirmar la integración de la construcción en el locus genómico correcto.
      Nota: Para maximizar la probabilidad de que las poblaciones clonales, utilice la dilución más alta posible que transfectants después de selección. Objetivo para las placas que son de un máximo de un tercio de pozos ocupados.
      1. Para expandir las poblaciones clonales, transferencia de clones que han crecido después de la selección de la placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos en una placa de 12 pozos de cultivo de tejidos para crecer suficientes células para el aislamiento de la DNA genomic. Suministro de cada pocillo con 1 mL de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) y el marcador seleccionable fresco.
         Nota: 1 día es suficiente para obtener un bien conveniente para el aislamiento de ADN confluentes.
      2. Para realizar el aislamiento de ADN genómico mini, cosechar las células de un pozo confluente y aislar ADN genómico utilizando un mini kit de extracción de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
      3. Utilizar el ADN genómico aislado junto con adecuados primers y Taq-polimerasa (véase Tabla de materiales) a la pantalla de la PCR para integrandos positivo.
         Nota: Después de la confirmación de integración positiva en el locus genómico correcta, se debe realizar un análisis de Southern blot. Esto asegura una mayor confianza que no han ocurrido eventos de inserción adicional en regiones genómicas inespecíficas.
   2. Para las proteínas fluorescentes reportero, visualmente identificar células fluorescentes positivas y con un microscopio de fluorescencia. Por otra parte, realizar un western blot con anticuerpos adecuados para identificación bioquímica.

Programa PCR
paso	temperatura	hora
Desnaturalización inicial	94 ° C	30 s
30 ciclos	94 ° C	15-30 s
	42 ° C	15-60 s
	68 ° C	1 min/kb
Extensión final	68 ° C	5 min
Mantenga	4-10 ° C
Composición de la reacción
componente	Reacción de 25 μL	concentración final
Primer avance de 10 μm	0.5 ΜL	0.2 ΜM
Primer revés de 10 μm	0.5 ΜL	0.2 ΜM
Plantilla de ADN	variable (ca. 5 μl)	< 1.000 ng
2 x Master Mix con Buffer estándar incluyendo polimerasa (véase tabla de materiales)	12.5 ΜL	1 x
Agua libre de nucleasas	para 25 μl	< 1.000 ng

Tabla 2: composición de programa y de la muestra PCR para la amplificación de D. discoideum la DNA genomic.

Resultados

Plásmidos extracromosómicos se utilizan para estudios de reportero, que tienen como objetivo identificar la localización de ciertas proteínas dentro de una celda o cambios en la estructura celular de las células mutantes. Para muchos enfoques, tales como control del ciclo celular, es crucial expresar dos periodistas al mismo tiempo. Esto es ahora posible usando nuestro sistema de plásmidos extracromosómicos de reportero dual (tabla 1). El día 1, las células fueron transfectadas antes de añadir el marcador seleccionable G418 después de 5 h (figura 1). En el ejemplo, NC4, DdB, Ax2 y los aislamientos salvajes independientemente derivados V12M2 y WS2162 (complementario tabla 1) fueron transfectadas con el plásmido pPI289, que codifica para GFP-TubulinA, un marcador de microtúbulos y mCherry-PCNA, una proteína que es utilizado para el control del ciclo celular (figura 2A). Después de 32 h, las células fueron observadas bajo el microscopio. La mayoría de células expresa dos proteínas de fusión marcado con fluorescente, consistente con anteriores informes de que la expresión de dos periodistas del mismo plásmido espectáculos similares niveles de expresión, que es casi imposible cuando se utiliza dos diferentes plásmidos ^18,19. Una célula representativa para cada línea celular (NC4, DdB, Ax2, V12M2 y WS2162) expresando el reportero dual deseado se muestra en la figura 2B. Las eficacias de transfección se resumen en la figura2C. Líneas celulares derivadas de NC4 muestran las mejores eficacias de transfección. Sin embargo, las líneas celulares V12M2 y WS2162, se obtuvo un número considerablemente alto de transfectants.

Figura 2 : Expresión de un plásmido extracromosómico. (A) plásmidos extracromosómicos directamente son transfectadas en forma circular. Por ejemplo, se muestra el reportero doble pPI289. Los sitios MIV ONGindican inserción del segundo reportero en el plásmido de expresión Extracromosómica. (B) Z-proyección de una célula representativa expresando GFP-TubulinA (citoplasmática) y mCherry-PCNA (en gran parte nuclear) para cinco líneas de diferentes células de tipo salvaje utilizado (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). Se calculó la eficiencia (C) la transfección de líneas cinco celulares en (B). Es el promedio de dos experimentos. Barras de error indican ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Integración de un vector que apunta en un locus genómico especificado es más difícil y requiere un análisis más cuidadoso de la línea celular generada. En la figura 3, se trató de un act5- mCherry KI en NC4. En primer lugar, el plásmido debe ser linealizado para aumentar la frecuencia de eventos de recombinación tras la transfección. Para esto, se corta el plásmido pDM1514 con ONGMIV. Dos bandas se obtienen después de ejecuta el compendio en un gel de agarosa. La banda de 4127 bp contiene la estructura deseada (figura 3). Para la transfección, la DNA digerida debe extraerse el gel y purificada utilizando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante.

Figura 3 : Preparación de act5 knock y ADN para transfección. Se muestra un ejemplo del uso de un actuar5 golpes en el plásmido pDM1514. A continuación se enumeran los pasos para la preparación. (A) antes de la electroporación, alinear el plásmido usando los sitios indicados de MIV de ONG. (B, C) Ejecutar el plásmido cortado en un gel de agarosa hasta que las dos bandas que se separan correctamente. Cortar la banda de bp 4127 que contiene los brazos de recombinación, mCherry y los cassettes de resistencia, y extracto de gel de la DNA. El ADN está listo para la transfección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ADN purificado se utilizó para la transfección de células NC4. Después de 5-6 días de la selección, se obtuvieron clones. Eficacias de transfección representativos y la cantidad de clones identificados positivos para act5 varios knock-en intentos se resumen en la tabla 3. Dos clones de la transfección de NC4 aleatoriamente elegidos y analizados por PCR (figura 4A), y demostró los patrones predichos banda espera que de un golpe y se validaron más con el análisis de Southern blot para asegurar una integración única evento de la construcción en el genoma²⁰. La mancha muestra una integración clara sola en el lugar deseado act5 (figura 4B). La línea de celular NC4::act5-mCherry generada puede utilizarse ahora en experimentos.

Figura 4 : Validación de act5- mCherry KIs en NC4. (A) esquema y control PCRs para la validación de integración positiva en act5 locus. Los iniciadores indicados fueron utilizados para analizar dos clones independientes y el padre. Ambos clones muestran las bandas esperadas para la resistencia del cassette y aguas abajo (P1) o primer upstream (P2), que no están presentes en la cepa parental. La combinación de la cartilla (P1/P2) confirma la correcta integración de cassettes mCherry y resistencia en el locus act5 . El tipo salvaje NC4 muestra la esperada banda 2800 de bp, mientras que ambos clones KI carecen de esta banda y en su lugar mostrar un producto PCR sobre 1400 pares más grandes. (B) esquema para el Resumen de restricción utilizado y Southern blot. Ambos clones knock-en Mostrar la menor banda 3400 de bp, que es el resultado de la integración de la construcción en el lugar geométrico del acto5, específicamente el adicional Bclsitio en los cassettes de resistencia Higromicina. La muestra de control de tipo salvaje el kb 5,8 esperado resultantes de los dos situados aguas abajo Bclsitios. La mancha blanca /negra fue recortada y empalmada para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

construcción específica en el locus act5	nombre de plásmido	número de pozos ocupados	número de clones facturados	Clones positivos	Clones correcto (%)	Dictyostelium cepa utilizada	eficiencia de transfección (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 μg ADN)
LifeAct-mCherry	pPI226	7	7	1	14.2	AX2	3.5 x 10 ^ -6
LifeAct-GFP	pPI227	12	12	5	41.6	AX2	6 x 10 ^ -6
GFP	pDM1513	3	3	2	66.6	AX2	1.5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	3	3	1	33.3	AX2	1.5 x 10 ^ -6
GFP	pDM1513	66	9	5	55.5	AX2	3.3 x 10 ^ -5
mCherry	pDM1514	221	12	10	83.3	AX2	1.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherry	pPI420	3	3	1	33.3	AX2	1.5 x 10 ^ -6
H2B-mCherry	pPI420	7	7	6	85.7	AX2	3.5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	10	10	7	70	DdB	5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	240	12	11	91.6	DdB	1.2 x 10 ^ -4
mCherry	pDM1514	320	12	12	100	NC4	1.6 x 10 ^ -4

Tabla 3: eficacia de transfección y la cantidad de obtengan transfectants positivo para la generación de Act5 KIs en fondos de cepa diferente ²² .

El lugar geométrico de actuar5 ofrece expresión relativamente homogénea de la reportera integrado²¹. Las células NC4::act5-mCherry generadas permiten experimentos de mezcla se realizará con otros act5 knock-ins utilizando una proteína fluorescente diferente como GFP. Para enfatizar la gran ventaja de este sistema, se muestran experimentos de mezcla con Ax2::act5-GFP . Debido a la incapacidad para transfectar las células de tipo salvaje no axénicos, este tipo de enfoque no podría realizarse antes. Experimentos de mezcla son una herramienta importante para analizar el comportamiento de la célula, ya que permiten una comparación directa entre diferentes líneas celulares experimentan idénticas condiciones experimentales. NC4 células crecen más rápido en el césped bacteriano que Ax2 las células (figura 5A). Esto puede ser debido a una mayor capacidad para fagocitar bacterias o mayor capacidad para mover y muestran quimiotaxis hacia una fuente de alimento. Mediante un ensayo de Quimiotaxis de folato bajo agar, comparación directa de una población de NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP fue realizada, demostrando que NC4::act5 mCherry son mucho más eficientes en la detección de ácido fólico. Después de 4 h, más células NC4::act5 mCherry pudieron arrastrarse por debajo de la agarosa de las células Ax2::act5-GFP (figura 5B). Analizar métricas estándar de Quimiotaxis de las células que migran en la agarosa reveló que las células NC4::act5-mCherry fueron más rápido y mostraron mayor respuesta quimiotáctica de las células Ax2::act5-GFP (figura 5C-E ).

Figura 5 : Usando KIs actuar5 para los experimentos de mezcla de quimiotaxis basada en imágenes. (A) NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP expresando la proteína fluorescente indicada desde el locus actúan5 se analizaron para que la capacidad de crecer sobre un césped bacteriano. Después de 4 días, se midió el diámetro de la placa de células de Dictyostelium plateadas solitarias. No axénicos act5:: NC4 células hacen placas significativamente mayores que las células de Ax2::act5-GFP axénicos (media ± SD, *** p < 0.0001, n = 3, la escala de la barra 5 mm). (B) para uso de los chemotaxis de folato bajo agarosa ensayo²² comparar directamente las capacidades quimiotácticas del mCherry NC4::act5 y Ax2::act5-GFP en (A), bacterias-crecido amebas de ambas cepas se mezclaron en una proporción de 50: 50. Las células podían arrastrarse por debajo de la agarosa. Después de 4 h, las células que fueron migrando hacia arriba el gradiente de folato fueron fotografiadas utilizando un microscopio confocal. Luego se determinó el número de células NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP . NC4::Act5-mCherry células eran más eficientes en la detección de ácido fólico. Sobre 10 veces más NC4::act5 mCherry se encontraron células en comparación con las células Ax2::act5-GFP (media ± SD, *** p < 0.0001, n = 6, escala de la barra 100 μm). (C, D) Las células fueron filmadas durante 60 min, y se calcularon su velocidad e índice quimiotáctico. Después de la preselección de las células más chemotactically sensibles (sólo los que emigraron bajo el agarosa), Ax2::act5-GFP células mostraron valores más bajos para la velocidad del celular y la quimiotaxis. Se analizaron cincuenta células por línea celular. (media ± SD, * p < 0.01, n = 3). (E) las pistas de NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFPact5 knock-ins se trazan sobre 60 minutos, mostrando el movimiento más dirigido hacia la fuente de chemoattractent de las células NC4::act5-mCherry (media ± SD, ** * p < 0.0001, n = 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las líneas de precipitación en celulares act5 pueden también usarse para citometría de flujo. Como con el crecimiento de bacterias, existen grandes diferencias de desarrollo entre axénicos cepas y wild-tipos no axénicos. Después del desarrollo, la fructificación de NC4 células son aproximadamente dos veces tan grande como los derivados de células Ax2. Si las células se mezclan, se obtiene un cuerpo fructífero tamaño intermedio. Para analizar la contribución de las dos líneas celulares más cuantitativo, se utilizó la citometría de flujo. Estos análisis demostraron claramente que la fructificación de tamaño intermedio son debido a los diferentes niveles de contribución de ambas líneas celulares. Mientras que las células NC4::act5-mCherry compone alrededor del 75% de las esporas medidos, Ax2::act5-GFP contribuyó sólo el 25%, mostrando una ventaja de aptitud potencial para cepas no axénicos (figura 6). Puesto que el análisis no controlar la población de célula de tallo, hay dos posibilidades para explicar el desequilibrio en desarrollo entre Ax2 y NC4. Una posibilidad es que las células Ax2 contribuyen principalmente a la población de célula de tallo, en lugar de entrar en la población de la célula de la espora. Alternativamente, más NC4 células entren en el ciclo de desarrollo, con Ax2 relativamente retrasada, y en consecuencia no pueden contribuir a la Asamblea de un cuerpo fructífero. La posibilidad de transfectar las células de tipo salvaje no axénicos desarrolla además otros enfoques y simplifica enormemente los procedimientos experimentales.

Figura 6: ley5 KIs permite análisis de experimentos de mezcla usando el flujo cytometry. (A) NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP se desarrollaron por separado o en una mezcla de 50: 50 en placas de agar del no-alimento. NC4::Act5 mCherry células formar grandes cuerpos fructíferos que Ax2::act5-GFP. La mezcla en su lugar muestra un tamaño intermedio (escala de la barra 5 mm). Microscopía confocal de fluorescencia indica una mayor cantidad de esporas NC4::act5 mCherry en las cabezas de espora derivadas de mezclas. (B) para cuantificar esta observación, las cantidades de esporas esporas recolectadas cabezas del experimento mezcla en (A) se analizaron por citometría de flujo. Alrededor del 75% de las esporas originado de las células NC4::act5-mCherry , con sólo el 25% de las células Ax2::act5-GFP . (C) distribución representativa de esporas de ambas líneas celulares que se muestra en una dispersión de citometría de flujo. Aproximadamente 0.05% muestran positivo señales mCherry y GFP, lo que sugiere que se han producido procesos de fusion parasexual o que las esporas están pegando uno al otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Línea celular	Fondo genético	Número de referencia	Publicado antes de	Tipo
Ax2 (Ka)		DBS0235521	Bloomfield et al., 2008	tipo salvaje
NC4 (S)			Bloomfield et al., 2008	tipo salvaje
Act5::mCherry 5 clon	NC4	HM1912	Paschke et al., 2018	Act5 knock-in
Act5::GFP clon 2	AX2	HM1930	Paschke et al., 2018	Act5 knock-in
V12M2			Bloomfield et al., 2008	tipo salvaje
WS2162			Bloomfield et al., 2008	tipo salvaje

Complementario tabla 1: diferentes cepas de Dictyostelium estudiado.

Discusión

El uso de células de Dictyostelium no axénicos, tipo salvaje ha sido hasta ahora muy limitado en la investigación molecular. Métodos disponibles para la ingeniería genética de las cepas han carecía de fiabilidad y eficiencia²³, previniendo su adopción general. Los materiales generados y protocolos aquí presentados pueden utilizarse para cualquier cepa de D. discoideum independiente de su capacidad para crecer en medio líquido. Cabe mencionar que este protocolo está optimizado para las líneas celulares derivadas de NC4. Eficacias de transfección para las cepas recién aisladas de la naturaleza difieren de NC4, como han observado antes y se muestran aquí para V12M2 y WS2162^8,9. Las condiciones de la electroporación en particular parecen tener una influencia considerable en la eficiencia de transfección y requieran más optimización para algunas cepas. En general, una cantidad suficiente de transfectants se han observado en todas las cepas probadas hasta ahora, demostrando que estos métodos son viables. El número de positivos transfectants obtenidos utilizando cepas derivadas de NC4 superior en comparación con otras cepas de tipo salvaje no axénicos, pero en todos los casos, se obtiene un número suficiente de transfectants para permitir experimentos adicionales. Esto, además de la simplicidad de nuestro protocolo, es la importante mejora en comparación con anteriores intentos de^8,9.

Estos nuevos protocolos no axénicos cubren todos los procedimientos genéticos estándar y añadir otras ventajas, transfecciones pueden realizarse rápidamente y eficientemente en paralelo. Clones positivos pueden obtenerse en días en lugar de semanas, desde el crecimiento en las mitades de las bacterias al tiempo de la división. El flamante plásmidos también trabajar bajo condiciones axénicos y puede usarse sistemáticamente en ambas condiciones de crecimiento, que es otro avance de esta metodología²². Introducidas en el protocolo, el plásmido utilizado para la selección de bacterias tienen necesidades especiales que son cruciales para el éxito de la transfección. En particular, los promotores de los cassettes de expresión y resistencia de conducción son importantes para la exitosa transfección. El uso frecuente act6 (actina 6) promotor²⁴ para la conducción de los cassettes de resistencia o expresión carece de eficacia cuando las células se cultivan en las bacterias. En nuestro sistema de plásmido, el promotor altamente activa act15 (actina 15) impulsa los cassettes de expresión, mientras que los cassettes de resistencia están bajo el control de un promotor de la coA (coactosin A), ambos que son activos en condiciones axénicos y en células cultivadas en las bacterias. Requisitos para la expresión del reportero construye así como knock-in y knock-out construcciones hacen necesario utilizar nuestro repertorio de plásmido, pero lamentablemente limita el uso de vectores ya creado uso ineficiente act6 promotor.

Eficiencia del promotor es especialmente crítico para transfecciones que dependen de un evento de integración individual en el locus genómico correcto. Debido a la mejora de promotores conduce la expresión de genes de resistencia, se produce suficiente proteína de resistencia de integraciones de locus único. Una de las principales preocupaciones era favorecer integraciones múltiples en el genoma con Higromicina G418 como se describe. No favoreciendo de integraciones múltiples se ha observado hasta ahora, según lo divulgado previamente para G418 selecciones con mayor promotor de sistemas²⁵. Esto significa que tanto Higromicina y G418 son convenientes marcadores seleccionables para la generación de limpia knock-out y knock-pulg por desgracia, no funciona el marcador seleccionable blasticidin condiciones no axénicos. Esto es una desventaja importante de nuestro método, puesto que los cassettes de resistencia de blasticidin se utiliza habitualmente para generar constructos de knock-out en D. discoideum. Construcciones que ya se generaron con cintas de resistencia de blasticidin deberá ser rederived utilizando uno de los marcadores seleccionables realizables. Otra posibilidad para superar esta limitación es combinar el recientemente establecido axénicos D. discoideum CRISPR tecnología con este protocolo de la transfección del²⁶. La generación de adecuados, solo guía RNAs (sgRNAs) es más simple y más rápido que la reconstrucción de construcciones de knock-out completadas. Para las direcciones futuras, la posibilidad de generar múltiples knock-outs usando CRISPR/Cas9 combinado con este protocolo de la transfección es atractiva y puede allanar el camino para muchos investigadores en la comunidad de Dictyostelium . Sin embargo, la viabilidad del sistema de expresión transitoria establecida por CRISPR/Cas9 en células cultivadas axénicos debe examinarse cuidadosamente.

El act5 knock-in sistema presentado ofrece un sistema de integración fiable y seguro para la generación de líneas celulares estables de D. discoideum, con la ventaja de sitios similares en otros organismos²². También depende de un evento de integración única en el genoma y ofrece muchas posibilidades para las direcciones de investigación. El promotor act5 fuertemente activo y garantiza la expresión casi homogénea²⁷ independiente de las condiciones de cultivo. Las proteínas fluorescentes reportero pueden integrarse fácilmente en este lugar de refugio utilizando la ingeniería dirigida a plásmidos. Esto puede ser útil, por ejemplo, para propósitos de seguimiento de la célula, como se muestra aquí en un experimento de mezcla. Las células muestran variabilidad mínima expresión de célula a célula, que puede ayudar en el seguimiento automatizado de la célula. Lo importante, la inserción de una secuencia deseada en el lugar geométrico de actuar5 aparece fenotípicamente neutro^28,29. Como la expresión no depende de un marcador seleccionable para mantener la expresión de la proteína, como se ve en integrantes al azar o Extracromosómica vector teniendo líneas de celulares, el sistema act5 puede ser útil para experimentos de rescate. Puesto que las líneas celulares son homogéneas, todas las células pueden ser analizadas. Esto no es posible utilizar un plásmido extracromosómico de expresión, en el que hay una gran heterogeneidad en la expresión.

Además de estas mejoras en general para todas las cepas, la capacidad para utilizar las células de tipo salvaje no axénicos de investigación molecular permite una evaluación de los efectos de las mutaciones acumuladas en cepas de laboratorio actuales. Los cambios genéticos múltiples se ha encontrado desde la adopción de la cepa Ax2 en 1970, como muestra de análisis de microarrays previamente publicados²⁶. Se observan fenotipos sintéticos debido a la presencia de estas mutaciones. Por ejemplo, un mutante divulgado phg2 muestra disminución de la adherencia en un fondo de cepa de laboratorio y mayor adherencia en otros³. Estos datos contradictorios pueden resolverse ahora repitiendo el experimento en la cepa de antepasado común (en este caso, DdB). La fuerza de este enfoque se ha demostrado recientemente para el GTPase RasS pequeño^30,31.

La capacidad para realizar experimentos genéticos en cualquier cepa de D. discoideum amplía el potencial de nuevas direcciones de investigación que depende del uso de cepas salvajes, en particular los relacionados con la evolución social, reconocimiento de kin y el²²del ciclo sexual.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
Microcentrífugas Eppendorf 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Centrífugas Eppendorf 5702R con rotor modelo A-4-38	ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers	Sigma Aldrich	EP6331000025
Gene Pulser X Cell, incluyendo CE & Módulos de PC	BioRad	1652660
Armario de seguridad Foruna - SCANLAF	Labogene
BioPhotometer Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medio	Paramedio	LF0501
Seakem GTG Agarosa	Lonza	50071
Bajo EEO Agarosa	BioGene	300-200
Agar Purificado	Oxoid	LP0028
SM caldo	Formedium	SMB0102
2x LB caldo	Formedium	LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoScientific	S33102
1 Kb Plus Escalera de ADN	ThermoScientific	10787018
1 Kb Escalera de ADN	NEB N3232L
HEPES ácido libre	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH2PO4	VWR	P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O	VWR	10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O	Sigma Aldrich	442909
Ácido fólico	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Cultur Platos
96 Pocillo Clúster de cultivo celular, fondo plano con tapa de baja evaporación, tratamiento con cultivo de tejidos	Corning Incorporated	3595
Clúster de cultivo celular de 6 pocillos, fondo plano con tapa, cultivo de tejidos tratado Corning	Incorporated	3516
Plato de cultivo de tejidos estilo 100 x 20 mm, cultivo de tejidos tratado	Corning Incorporated	353003
platos de micropocillos con fondo de vidrio de 50 mm No1.5	MatTek Corporation	P50G-1.5-30-F
Antibióticos
Geneticina G418-sulfato	Gibco de Life Technologies	11811-023
Higromicina B Oro	InvivoGen	ant-hg-1
Consumibles adicionales
2 mm de distancia cubetas de electroporación, electrodo largo	Geneflow Limited	E6-0062
10 µ L Asa de Inoculación, Azul 10 Micro L	ThermoScientific	129399
Spreader, en forma de L, estéril	Greiner Bio-One	730190
Combitips advanced 5 mL	Eppendorf BIOPUR	30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic	Zymoresearch	D4016
Quick DNA Kit de minipreparación	Zymoresearch	D3025
Kit de recuperación de ADN Zymoclean	Zymoresearch	D40002
fuertes
restricción	fuerte NEB
OneTaq 2X Master Mix con tampón estándar	NEB	M0482L
T4 ADN ligasa	NEB	M0202S
ADN polimerasa PrimeSTAR Max	TakaraBio	R045A