Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التثبيت أفراد يعيش ايليجانس كاينورهابديتيس باستخدام رقاقة موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان أولتراثين إلكترونية مع "الاحتفاظ بالماء"

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

تم إنشاء سلسلة من أساليب التثبيت للسماح تشعيع المستهدفة ليعيش ايليجانس كاينورهابديتيس الأفراد استخدام موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان رقيقة جداً وضعت مؤخرا رقاقة مع الاحتفاظ بالماء. هذا التثبيت على شريحة الرواية أيضا مناسبة للتصوير الملاحظات. يرد شرح معالجة مفصلة وأمثلة التطبيق للرقاقة.

Abstract

الإشعاع يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية وتربية أيون-شعاع، ومن بين هذه الأساليب، تشعيع ميكروبيم يمثل وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في الكائنات الحية. وتصف هذه الورقة مجموعة من أساليب التثبيت على الرقاقة المتقدمة تشعيع ميكروبيم المستهدفة من الأفراد يعيشون من ايليجانس كاينورهابديتيس. جدير بالذكر أن معاملة رقائق موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) أننا سبق أن وضعت لشل C. ايليجانس الأفراد دون الحاجة للتخدير وهو شرح بالتفصيل. هذه الرقاقة، المشار إليها كورقة دودة، مرونة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع نطاق، والمرونة يسمح الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات. وعلاوة على ذلك، ورقة الدودة يظهر الاحتفاظ بالماء ويسمح للأفراد C. ايليجانس يخضعون للمراقبة المجهرية لفترات طويلة في ظروف العيش. وباﻹضافة إلى ذلك، الورقة هو فقط 300 ميكرون سميكة، مما يسمح لأيونات ثقيلة مثل أيونات الكربون لتمرير من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات، مما يسمح للجزيئات أيون أن يتم الكشف عن والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. لأن اختيار الأفلام غطاء يستخدم لإحاطة الحيوانات مهم جداً لنجاح التثبيت طويلة الأجل، نحن إجراء اختيار الأفلام تغطية مناسبة وأظهر أحد الموصى به بين بعض الأفلام. كمثال على تطبيق الرقاقة، قدمنا التصوير مراقبة أنشطة العضلات للحيوانات التي أرفق بها القناة موائع جزيئية الورقة دودة، فضلا عن تشعيع ميكروبيام. هذه الأمثلة تبين أن الأوراق دودة توسعت إلى حد كبير إمكانيات إجراء تجارب بيولوجية.

Introduction

الإشعاع، بما في ذلك الأشعة السينية وأشعة غاما وأشعة أيونات ثقيلة، يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية كما هو الحال في تشخيص مرض السرطان وعلاجه، وتربية أيون-شعاع. وتركز على آثار الإشعاع1،،من23حاليا العديد من الدراسات والتطورات التقنية. تشعيع ميكروبيام وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في معيشة الكائنات الحية4. تاكاساكي متقدمة الإشعاع بحوث المعهد من "المعاهد الوطنية" الكم و "العلوم الإشعاعية" والتكنولوجيا (QST-تاكاساكي) وقد تم تطوير تكنولوجيا تشعيع الخلايا الفردية تحت الملاحظة المجهرية باستخدام أيونات ثقيلة microbeams5، وأنشأت طرق لتمكين تشعيع ميكروبيام مستهدفة من العديد من الحيوانات النموذجية، مثل ديدان أسطوانية4، ايليجانس كاينورهابديتيس6،7من دود القز و Oryzias latipes (الميداكا اليابانية)8. تشعيع ميكروبيام المستهدفة من السلكية C. ايليجانس يسمح ضربة قاضية فعالة لمناطق محددة، مثل الحلقة العصبية في منطقة الرأس، مما يساعد على تحديد دور كل من هذه الأنظمة في عمليات مثل الحركة.

وقد وضعت طريقة للتثبيت على شريحة من الأفراد C. ايليجانس دون الحاجة للتخدير للسماح ل تشعيع ميكروبيام4. وبالإضافة إلى ذلك، تحسين موائع جزيئية الرقائق المستخدمة في الدراسة السابقة4، مؤخرا وضعنا رقائق موائع جزيئية قابل للبلل، وأيون-حدودية، بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، المشار إليها كدودة أوراق (انظر الجدول للمواد)، شل حركة الأفراد ايليجانس جيم- 9. تشمل هذه الأوراق الناعمة رقيقة جداً (سمك = 300 ميكرون؛ العرض = 15 مم؛ طول = 15 ملم) مع عدة قنوات موائع جزيئية مستقيمة (20 أو 25) (عمق = 70 ميكرومتر؛ العرض = 60 ميكرومتر أو 50 ميكرومتر؛ طول = 8 مم) على السطح (الشكل 1-د). قنوات موائع جزيئية مفتوحة والسماح للحيوانات متعددة إحاطتها لهم في نفس الوقت (الشكل 1ﻫ). الأوراق مرنة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع (بواسطة ~ 10%، الرقم 1و)، وتسمح المرونة الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات.

القنوات التي لا تؤذي الديدان عندما يجري المحاطة أو عند جمعها. وعلاوة على ذلك، الأوراق مصنوعة من PDMS، الذي أساسا مسعور، ولكن الاحتفاظ بالماء يمكن أن يتحقق بأساليب هيدروفيليسيتي للمواد. الاحتفاظ بالماء، وسمك خصائص مواتية للأوراق دودة. قدرة الاحتفاظ بالماء يمنع جفاف الحيوانات بعد التثبيت طويلة وتمكن الملاحظات الطويلة الأجل الاضطلاع.

وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو موضح سابقا9، الأوراق هي فقط 300 ميكرون سميكة، مما يتيح الأيونات الثقيلة مثل أيونات الكربون (مع مجموعة من حوالي 1 ملم في المياه) بالمرور من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات. هذا يسمح للجزيئات أيون للكشف عنها والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. وعلاوة على ذلك، الأوراق الدودة يمكن إعادة استخدامها، ومن ثم اقتصادية. مع أسلوب الحقن التقليدية، الحيوانات محاطة بالميت في بعض الأحيان وأنها لا يمكن أن تؤخذ من القناة؛ ويمكن أيضا أن تسد بيضها القنوات. وهذا يجعل من شرائح غير قابل للاستخدام. رقائق وبالتالي تكون أساسا القابل للتصرف، والتكاليف والفوائد نسبة الفقراء.

في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل مجموعة من الأساليب للتثبيت على شريحة من العيش C. ايليجانس الأفراد استخدام أوراق دودة. من خلال فحوصات تنقل الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة، يمكننا تقييم الفيلم تغطية مناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أظهرت الأمثلة على التثبيت على شريحة للملاحظات التصوير والإشعاع ميكروبيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-سلالات والصيانة

  1. حدد سلالة مناسبة C. ايليجانس و الإشريكيّة القولونية (المواد الغذائية) استناداً إلى غرض التجربة.
    ملاحظة: في هذه الورقة، يستخدم البرية من نوع N210C. ايليجانس (الشكل 2أ) عموما، و HBR4:goeIs3 [بميو-3::GCamP3.35::unc-54-3 ' utr, unc-119(+)] الخامس11 يستخدم فقط للتصوير المقايسة. كولاي OP50 كغذاء ل C. ايليجانس. بعض طفرات مع شكل الجسم غير طبيعية، مثل المسخ unc-119(e2498) الثالث بشكل ملفوف (الشكل 2ب)، كما يمكن إحاطتها بالقنوات موائع جزيئية على التوالي (الشكل 2-ج).
  2. الحفاظ على C. ايليجانس عند 20 درجة مئوية في 6 سم بيتري الأطباق التي تحتوي على 10 مل من نمو السلكية المتوسطة (NGM) أن انتشار المحتضنة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية) كولاي كما هو موضح سابقا10. إذا كان ذلك ممكناً، قم بمزامنة مرحلة C. ايليجانس بدءاً من مرحلة الجنين.
  3. استخدام جيدا تغذية الحيوانات الكبار، حوالي 3-4 أيام بعد الفقس بعرض حوالي 50-60 ميكرون، ومناسبة على النحو الأمثل لحجم قنوات موائع جزيئية في صحائف دودة.

2-اختيار الحل المخزن المؤقت للتثبيت على شريحة

  1. أوراق دودة قابل للبلل، استخدم أي حل المخزن المؤقت استناداً إلى الغرض من هذه التجارب.
    ملاحظة: الحلول المناسبة العازلة للتثبيت على شريحة على موائع جزيئية PDMS كانت رقائق تعرف سابقا9 وعرضت الحلول المخزن المؤقت التالية ليس لها أي أثر في حركية الحيوانات بعد التثبيت: S القاعدية المخزن المؤقت الحل (5.85 غرام من كلوريد الصوديوم، 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الإيثانول)، 50 مل م 1 pH 6.0 البوتاسيوم الفوسفات، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيمها قبل التعقيم)10 التي تحتوي على كمية كبيرة من كلوريد الصوديوم، M9 الفوسفات المخزن المؤقت الحل (5 غ من كلوريد الصوديوم ، غ 3 خ2ص4، ز 6 غ2هبو4، 1 مل 1 م MgSO4، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيم بالتعقيم)10، والمياه والصرف الصحي المخزن المؤقت الحل (5 مل فوسفات البوتاسيوم pH 6.0 م 1، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل 1 م MgSO4، ز 0.5 pf الجيلاتين، ح2س إلى 1 لتر؛ تعقيمها قبل التعقيم)12 التي تحتوي على الجيلاتين ، والماء عالي النقاوة9. في هذه الورقة، عادة ما يتم استخدام الحل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، و S القاعدية المخزن المؤقت الحل يعمل فقط لتقييم التثبيت على شريحة باستخدام الأفلام غلاف مختلفة في القسم 3.
  2. لرقائق موائع جزيئية التقليدية دون ويتابيليتي، استخدام حل المخزن مؤقت للمياه والصرف الصحي، الذي يوفر الوسائل الأكثر فعالية للحفاظ على رطوبة في قنوات الرقاقة موائع جزيئية وهكذا يمنع تجفيف C. ايليجانس الأفراد ( بغض النظر عن ويتابيليتي رقائق موائع جزيئية).

3-اختيار الفيلم تغطية مناسبة للتثبيت على شريحة

  1. إعداد أفلام غلاف مختلفة على النحو التالي. استناداً إلى سهولة المناولة، قطع ما يلي شفافة، أفلام غطاء متوافق حيويا لحجم مناسب (أي، عرض 10-15 مم وطولها من 30-50 مم): 130-170 الزجاج غطاء سميك ميكرومتر، 125 ميكرومتر سميكة البوليستر (الحيوانات الأليفة) الفيلم، و ~ 130 ميكرومتر سميكة البوليستيرين (PS) الفيلم.
  2. إجراء التثبيت على شريحة ح 3 استخدام الأفلام غلاف مختلفة على النحو التالي. تستند الخطوات 4.1-4.6، أرفق إيه وان زيرو غسلها الكبار الحيوانات (3.5 أيام بعد الفقس) في ورقة الدودة استخدام كل فيلم الغلاف، على التوالي، وترك ح 3.
  3. ولأغراض المقارنة، تسمح ح 3 حرية التنقل على النحو التالي. إيه وان زيرو مكان تغسل الحيوانات الكبار على صفيحة 3.5 سم تحتوي على 3 مل NGM الطازجة، وتغطي بغطاء ويغادر إلى ح 3.
  4. جمع الحيوانات مباشرة بعد 3 ح للتثبيت على الرقاقة وفقا للخطوات 5.1 5.3. إزالة الفيلم الغطاء من الورقة دودة وإضافة قطره من المخزن المؤقت الحل لكل الحيوانات. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية استخدام منتقي البلاتين ونقلها إلى لوحة 3.5 سم تحتوي على 3 مل NGM جديدة دون طعام (لوحة الفحص).
  5. جمع الحيوانات بعد ح 3 من حرية الحركة. إضافة قطره من المخزن المؤقت الحل لكل الحيوانات. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية على لوحة NGM ونقلها إلى لوحة فحص استخدام منتقي البلاتين.
  6. تقييم آثار الفيلم الغطاء على حركية (مقايسة الحركة).
    1. مدة 5 دقائق على الأقل بعد نقل إلى لوحة المقايسة، عد ' الجسم الانحناءات (defined كعدد الانحناءات في منطقة الجسم الأمامي على فترات 20-s) يدوياً تحت مجهر13.
    2. القيام بفحوصات الحركة خمس مرات بشكل مستقل لكل فيلم الغطاء.
      ملاحظة: في التجارب التي تظهر في نتائج تمثيلية، جرى تقييم الحيوانات 10 لكل التجربة التي الحيوانات متعددة تم إحاطتها في نفس الوقت، مقارنة مع خمسة فقط الحيوانات عدها في الدراسة السابقة13.
    3. حساب متوسط عدد الانحناءات الجسم للحيوانات 10 في كل مجموعة لكل تجربة. ثم متوسط القيم من خمس تجارب مستقلة لتقييم effects للتثبيت على شريحة. تحليل البيانات إحصائيا باستخدام اختبار تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA) في برنامج جدول بيانات على المستويات أهمية من 0.01 و 0.05.
      ملاحظة: تستند هذه التجارب، فيلم غطاء PS مع نفاذية الأكسجين المرتفعة كانت تعتبر مناسبة (انظر نتائج تمثيلية). وترد هذه الأفلام PS مع أوراق دودة. فيلم الحيوانات الأليفة، التي لديها نفاذية منخفضة الأكسجين، وكان لا تعتبر مناسبة لأن الحيوانات تميل إلى خنق إذا كانت مغطاة بأنه أثناء التثبيت طويلة الأجل على صحائف دودة. من المهم أيضا أن لا يكسر الفيلم الغطاء أثناء سلسلة من الإجراءات؛ يغطي الزجاج بالتالي أيضا غير مناسب (انظر نتائج تمثيلية).

4-تجميد على رقاقة

ملاحظة: يجب أن تلبس القفازات المعقمة، والمتاح لتجنب تلويث الأوراق دودة.

  1. ضع ورقة شفافة رقيقة مثل فيلم غطاء PS أو الزجاج الذي قد لا أوتوفلوريسسينسي، لاستخدامها كفيلم غطاء السفلي، على مكتب التجريبية أو مرحلة مجهرية. ضع ورقة دودة بلطف على الفيلم الغطاء السفلي باستخدام الملقط مسطحة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى أوراق الدودة مع 60 قنوات موائع جزيئية على صعيد ميكرومتر (مناسبة للكبار 3-4 أيام بعد الفقس)، أوراق مع 50 ميكرومتر المنظومة قنوات (مناسبة لصغار البالغين 3 أيام بعد الفقس، وطفرات مع هيئة صغيرة في مرحلة الكبار) يمكن أيضا أن تستخدم. حدد ورقة مناسبة استناداً إلى حجم الحيوانات لاستخدامها.
  2. جمع الحيوانات وتلتقط الكبار فردية C. ايليجانس من لوحة الثقافة تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام منتقي البلاتين. كرر هذه العملية إذا كانت هناك حاجة إلى الحيوانات متعددة.
  3. غسل الحيوانات لإزالة المواد الغذائية (البكتيريا).
    1. ضع قطرات ثلاثة على الأقل (5 ميليلتر قطرات) من المخزن المؤقت الحل على السطح من 6 سم غير المعالجة (طارد المياه) بيتري طبق.
    2. نقل الحيوانات إلى الحبرية استخدام منتقي البلاتين والسماح لهم بإزالة أي طعام من السباحة. غسلها مرتين في قطرات منفصلة اثنين، ومن ثم شطف الحيوانات في آخر قطره.
      ملاحظة: من الضروري ممارسة هذا الإجراء لتكون قادرة على القيام بذلك بسرعة قبل القيام بأي تجارب.
  4. 2-3 ميليلتر من محلول المخزن المؤقت على سطح ورقة الدودة الإفلات. التقاط الحيوانات غسلها من الحبرية على طبق بيتري ونقلها إلى الحبرية على الورقة دودة.
  5. ضع الحيوانات في قنوات موائع جزيئية كما يلي. ضع فيلم غطاء PS على الورقة دودة استخدام الملقط مسطحة، واضغط برفق عبر القنوات من نهاية واحد من الورقة إلى أخرى للحفاظ على رطوبة (كما تم وصفه سابقا4،9).
    ملاحظة: ترفق الحيوانات عشوائياً في القنوات. قطرات تحتوي على الحيوانات تنتشر عبر ورقة الدودة التي تغطي الورقة، أسفر عن قطرات يجري على نطاق واسع تمتد عبر عدة قنوات. يمكن أن تكون محاطة كل الحيوانات في أي واحدة من هذه القنوات. والنقطة الهامة فيما يتعلق باستخدام الورقة دودة للتثبيت على شريحة أن تتوفر قنوات متعددة على امتداد منطقة واسعة.
  6. فورا بعد إحاطة الحيوانات في قنوات موائع جزيئية، تؤكد أنهم على قيد الحياة عن طريق فحص لحركة الرأس تحت مجهر (مثلاً، 1 x أو التكبير x 2).
  7. تسجيل موقف الحيوان، وفي الوقت نفسه كالقيام بالخطوة 4، 6، وملاحظة ما يلي على ورقة مخصصة (1 ملف تكميلي): رقم القناة الذي تم تضمينه الحيوان؛ موقف كل حيوان في القناة (يسار/مركز/يمين)؛ واتجاه الرأس.
  8. رسم سهم وضع علامة على موضع كل حيوان في القناة، مع اتجاه السهم المقابل لرأس الحيوان.
    ملاحظة: الأرقام قناة (مثلاً، 1، 5، 10، 15، 20، 25) محفورة على سطح الورقة دودة قرب الحواف اليمنى واليسرى من القنوات موائع جزيئية (الشكل 1ب). هذه المعلومات على ورقة مخصص يسمح الحيوانات تكون موجودة بسرعة، مما يجعل العملية أكثر كفاءة، وأيضا يساعد على منع تسرب الإشعاع أثناء الخطوات اللاحقة.

5-مجموعة من الحيوانات من ورقة الدودة

  1. مباشرة بعد التثبيت، إزالة الفيلم الغطاء من الورقة دودة استخدام الملقط مسطحة.
  2. إسقاط 10-15 ميليلتر محلول المخزن المؤقت على موائع جزيئية القنوات مرفقا بها الحيوانات ومراقبة الحيوانات بدأت تسبح في القطرات تحت ستيريوميكروسكوبي.
    ملاحظة: الحيوانات تبدأ السباحة في الحبرية الجديدة بهم دون أي ضغوط إضافية أو مساعدة أو دفع. مجرد إسقاط بعض العازلة فوقهم ما يكفي لجعلها تسبح خارج القناة. حيوان قد يكون غير قادر على السباحة في معالجة تجميعية إذا قد تم تلف حيوية تشعيع في خطوة 7.9 أو بواسطة عملية التثبيت في الخطوات 4، 2-4-5، على الرغم من أن هذا أمر نادر الحدوث. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان الحيوان تظل متمسكة بالفيلم الغطاء عند إزالته، إضافة القطرات على غلاف الفيلم بدلاً من القنوات.
  3. التقاط الحيوانات السباحة في الحبرية استخدام منتقي البلاتين ووضعها على صفيحة مقايسة.

6-تطبيق أوراق دودة للتصوير الملاحظات

ملاحظة: يمكن دودة أوراق في الملاحظات المجهرية على نطاق واسع. الرقاقة يمكن الاحتفاظ بالمياه، ولا تؤثر في حركية الأفراد C. ايليجانس بعد 3 ح للتثبيت على شريحة9. وبالإضافة إلى ذلك، قد رقاقة نفسها لا أوتوفلوريسسينسي، يجعلها مناسبة للاستخدام في الأسفار التصوير فحوصات. ويرد أدناه تطبيق نموذج للمقايسة التصوير الأسفار.

  1. حدد مجهر الأسفار وجبل الكاميرا الرقمية أو كاميرا الفيديو الرقمية في المجهر لالتقاط الصور أو ملفات الفيديو، على التوالي (الشكل 3أ).
    ملاحظة: أن العامل (WD) مجهر مسافة أكثر من 0.2 مم تبعاً لمواصفات العدسة الهدف (انظر الشكل 3ب، ج). ويرد في الجدول للموادمواصفات النظام مجهر الأسفار المستخدمة في هذه الورقة. غير أن المواصفات لا يقتصر على المثال الخاص بنا لأنه يعتمد على غرض المراقبة أو/والمستخدمين.
  2. حدد أي سلالة C. ايليجانس الفلورسنت والحفاظ على النحو الوارد في الفرع 1.
    ملاحظة: إذا كان من الضروري أن نلاحظ انكماش العضلات في جدار الجسم (انظر نتائج الممثل)، استخدام الشباب البالغين HBR411C. ايليجانس، التي يستخدم فيها جينات مراسل للتعبير عن المؤشر الكالسيوم GCaMP3.35 في جميع خلايا العضلات في جدار الجسم. من المهم استخدام الشباب (دي ثري يوم بعد الفقس) التي أرق من عرض القنوات موائع جزيئية (50 أو 60 ميكرومتر) ورقة الدودة. يعني درجة صغيرة لإزالة الألغام أن الحيوانات يمكن أن ينحني قليلاً، مما يجعل من الممكن لمراقبة انكماش العضلات والإرشاد أثناء عملية تتبع الارتباطات، باستخدام مؤشر أيون كالسيوم.
  3. الاضطلاع بالعلبة حيوانات وفقا لإجراءات التثبيت في القسم 4.
  4. مراقبة البقع الفلورسنت من الحيوانات (مثلاً، أخضر نيون البروتين المسمى سلالات) باستخدام مجهر الأسفار، والتقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية التي شنت على المجهر.
    ملاحظة: اتبع الأساليب المتبعة سابقا14،15،16، منذ أساليب المراقبة المجهر (بما في ذلك المراقبة الأسفار) ومواصفات النظام مجهر يعتمد على والغرض من هذه الملاحظة.
  5. صورة أيون الكالسيوم انتشار الموجات باستخدام الحصول على الفيديو لمراقبة الأنشطة الحيوية، مثل تقلص العضلات جدار الجسم وملحق في الديدان HBR4 (1 فيديو).

7-تطبيق أوراق الدودة تشعيع ميكروبيم

ملاحظة: يمكن استخدام نظام تشعيع ميكروبيام كوليماتينج5 الجسيمات الثقيلة أيون عدة تسارع من سيكلوترون الميدانية متفاوتة أزيموثاللي المثبتة في "المسرعات أيون تاكاساكي" لمرفق تطبيق الإشعاع المتقدم (تيارا) من QST-تاكاساكي (الشكل 4أ). وهناك مرحلة تلقائية التشعيع تحت خروج الشعاع (الشكل 4ب). الإجراء الخاص تشعيع ميكروبيم الثقيلة-أيون C. ايليجانس باستخدام هذا النظام على النحو التالي.

  1. تحديد موقع ورقة الدودة أرفق الحيوانات متعددة في إطار ألومنيوم مصنوعة خصيصا لمرفق microbeam-التشعيع ووضعه على المسرح التلقائي التشعيع (الشكل 4ج).
  2. رفع العينة التشعيع (أي، الحيوانات محاطة بورقة دودة على إطار)، إلى مباشرة تحت الخروج (~ 2 مم) الشعاع استناداً إلى صورة الشاشة من مجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية (الشكل 4د).
  3. بعد الموضع العمودي، حدد موقع كل الحيوانات إلى الهدف مع تشعيع ميكروبيم باستخدام البرمجيات مصنوعة خصيصا تشعيع الحيوانات والثقافات الخلية المستهدفة. لتحديد موقع كل الحيوانات المغلقة في القناة موائع جزيئية، الرجوع إلى الورقة مكرسة الموصوفة في الخطوة 4.7-4.8 (انظر 1 ملف تكميلي) وتأكيد رقم القناة قرب الحواف اليمنى واليسرى من القنوات.
  4. التحكم في مرحلة التلقائية في X واتجاهات Y لوضع الحيوانات تحت الشعاع الخروج باستخدام نظام التحكم وماوس ليزر تعمل مع البرمجيات التشعيع.
  5. تقريبا اللحن منطقة التشعيع بمشاهدة العرض من المجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية للعينة، وتحريك المؤشر إلى الموضع تشعيع الحيوانات هدفا.
  6. بعد تحديد المواقع الخام، إنهاء وإغلاق الغرفة التشعيع والانتقال إلى غرفة المراقبة المجاورة لتجنب الإشعاعية المشغلين.
  7. تعيين العدد المطلوب من الجزيئات أيون لواحد التشعيع الداخلي، المقابلة للإشعاع لمنطقة معينة من الحيوان، باستخدام وحدة التحكم المرتبطة بنظام لايون-العداد.
    ملاحظة: هذا يتكون من سسينتيلاتور بلاستيك ومضاعف النانومترية في النظام تشعيع ميكروبيم كوليماتينج.
  8. من غرفة التحكم التشعيع، ضبط موضع الحيوانات استناداً إلى صورة الشاشة من المجهر الموجودة ضمن مرحلة التلقائية، وهي نفس الصورة المسقطة على جهاز العرض في قاعة التشعيع (الشكل 4ه).
  9. استهداف تشعيع ميكروبيم عن طريق النقر على زر تشعيع للبرمجيات التشعيع.
    ملاحظة: في المثال المبين في الشكل 4و، نحن استهداف البلعوم في منطقة الرأس ويتهددها بالعدد المناسب من أيونات الكربون ميكروبيام. حيث أنه يتم حساب عدد الجسيمات أيون مرورا بالعينة باستخدام نظام عداد أيون مرتبطة بوحدة التحكم والبرمجيات التشعيع، توقفت التشعيع بعد التسليم بالعدد المطلوب من الجزيئات أيون.
  10. حدد موقع كل الحيوانات المسجلة على الورقة المخصصة والاضطلاع تشعيع المستهدفة لكل الحيوانات. كرر الخطوات من 7.8 و 7.9 حتى قد تم المشع جميع الحيوانات.
  11. فورا بعد التشعيع، أدخل الغرفة التشعيع وأدنى مرحلة الإشعاع التلقائي. إزالة عينة على الإطار مصنوعة خصيصا تقع على المسرح التلقائي.
  12. جمع الحيوانات كما هو موضح في الخطوات 5.1 5.3.
  13. القيام بالتحليلات السلوكية و/أو الجزيئية كما هو مطلوب لتقييم آثار تشعيع المستهدفة، تبعاً لغرض الدراسة.
    ملاحظة: تحليل الحركة الموضحة في الخطوة 3، 6 وسيلة فعالة لتقييم آثار الإشعاع على حركية4،9.

8-معاملة دودة أوراق للاستخدام المتكرر

ملاحظة: يمكن أن تكون أوراق الدودة تستخدم مرارا وتكرارا من 10 مرات على الأقل9 مع أي آثار سلبية على الحيوانات إذا تنظيفها وتعقيمها بشكل صحيح بعد استخدام كما يلي.

  1. التنظيف
    1. ضع ورقة الدودة المستخدمة على سم 6 طبق بيتري وقطره حوالي 100 ميليلتر من الماء المعقم عالي النقاوة على ورقة كاملة.
    2. مجداف الماء على سطح الورقة باستخدام القفاز أصابع يغسل الاوساخ مثل الغبار والمواد الغذائية البكتيرية وأي البيض وضعت في القنوات.
    3. يمسح الرطوبة خارج الورقة دودة دقة باستخدام المسحات يمكن التخلص منها.
  2. التعقيم
    1. ضخ حوالي 5 مل إيثانول 70% في طبق بتري يحتوي على ورقة الدودة ومجداف سطح الورقة باستخدام أصابع القفاز ليغسل التراب.
  3. تجفيف
    1. إزالة الرقائق من طبق بيتري مليئة الإيثانول 70% والسماح ليجف طبيعيا.
  4. تخزين
    1. بعد التجفيف، ضع ورقة الدودة على طبق بتري معقم وتغطية ذلك. يمكن أيضا تخزين أوراق على طبق بتري معقم مليئة إيثانول 70%.
      ملاحظة: من الأفضل التخلص من الأفلام الغطاء بعد استخدامها، ولكن إذا أريد لها أن تكون إعادة استخدامها، تنظيفها كما فعلت لكشف الفيروس المتنقل. بيد إذا وضع الطيات على الفيلم الغطاء بعد استخدام أنها ستلتزم لم يعد إلى شرائح، أسفر جفاف الحيوانات، والاستعاضة عنها لذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نشاط الأفراد C. ايليجانس يمكن أن تكون معطلة بنجاح باستخدام PDMS رقيقة جداً، وقابل للبلل، رقاقة موائع جزيئية (دودة ورقة). نحن التحقيق في مدى ملاءمة الأفلام تغطية مختلفة لختم الورقة دودة، كما هو موصوف في المادة 3 من البروتوكول. لتقييم آثار الختم من الأفلام الغطاء، عقدنا العزم حركية الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة باستخدام الزجاج غطاء (سمك: ميكرون 130-170)، فيلم الحيوانات الأليفة (سمك: 125 ميكرومتر)، والفيلم PS (سمك: ~ 130 ميكرومتر)، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 5، كان هناك لا اختلاف كبير في حركية (هيئة الانحناءات) بين الحيوانات التحكم يسمح للتحرك بحرية ح 3 والحيوانات محاطة بورقة الدودة مع الفيلم PS. وفي المقابل، حركية انخفضت انخفاضا كبيرا في الحيوانات المغلقة تحت غطاء زجاج. يبدو بعض الحيوانات قد جفت، مما يوحي بأن الزجاج غطاء صدت الحبرية، ومنع ختم وثيقة والسماح للحيوانات الجافة جزئيا بها، أدى إلى انخفاض الحركة. حركية الحيوانات محاطة باستخدام فيلم الحيوانات الأليفة انخفض أيضا بدرجة كبيرة؛ على الرغم من أن لا تجفيف لوحظ، حركية الحيوانات تميل إلى الانخفاض في شكل موحد، مما يوحي بأن معدل انتقال الأكسجين المنخفض (~ 30 مل/[24 h·m²· الآلام والكروب الذهنية])، وهو حوالي 100 مرة أقل من التي تسببها الحيوانات لخنق من PS،. توحي هذه النتائج التي تشمل PS الأفلام ينبغي أن تستخدم لإحاطة الحيوانات في ورقة الدودة.

كما طبقنا دودة ورقة تقنية للتصوير الملاحظات والقيام تشعيع ميكروبيم الخاصة بكل منطقة. التثبيت على شريحة باستخدام ورقة دودة مع الاحتفاظ بالماء ولا أوتوفلوريسسينسي كان مناسبة للمراقبة المجهرية تحت ظروف العيش. على سبيل المثال، طبقنا التقنية ل سلالة HBR411 من C. ايليجانس، الذي أعرب عن جين مراسل المؤشر الكالسيوم GCaMP3.35 في جميع خلايا العضلات في جدار الجسم. لاحظنا أنشطة جميع خلايا العضلات في جدار الجسم في الحيوانات البالغين الصغار في أيام دي ثري ما بعد الفقس في أوراق الدودة مع 50 ميكرومتر المنظومة موائع جزيئية القنوات، الذي يسمح للحيوانات الفضاء ينحني قليلاً. كثافة إشارة GCaMP3.35 في سلالة HBR4 يتوافق مع انكماش خلايا العضلات في جدار الجسم. ولوحظ Ca2 + الموجات المقابلة للنشاط العضلي وضوح (1 فيديو). بالإضافة إلى ذلك، أكدنا أن الورقة دودة لا أوتوفلوريسسينسي كما هو موضح في المرحلة الأخيرة (آخر ~ 10 s) الفيديو 1. بهذه الطريقة، يسمح عدم وجود حاجة للتخدير الأنشطة الفسيولوجية لخلايا العضلات التي سيحتفل بها في ظروف العيش.

وعلاوة على ذلك، قمنا بتطبيق ورقة الدودة تشعيع ميكروبيام الخاصة بمنطقة معينة من الأفراد C. ايليجانس . قنوات موائع جزيئية مستقيم متعددة على ورقة الدودة يسمح للحيوانات متعددة تكون معطلة في الوقت ذاته، دون الحاجة للتخدير، مما يسمح التشعيع متسلسلة من الحيوانات إيه تو زيرو (ما يكفي مقايسة مجموعة) في فترة زمنية قصيرة (30 دقيقة مقابل 20 الأفراد).

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطي لورقة الدودة. (أ) نظرة عامة على ورقة الدودة مع عمله المائة 1 أمريكا للمقياس. وكان الورقة دودة 300 ميكرون سميكة، 15 ملم واسعة وطويلة 15 ملم. (ب) على سطح الورقة دودة الواردة 25 موائع جزيئية مستقيم قنوات (عمق = 70 ميكرومتر؛ العرض = 60 ميكرومتر؛ الطول = 8 مم). (ج) التخطيطي للعينات التي تتألف من الفيلم الغطاء السفلي والورقة دودة، والفيلم الغطاء. (د) ورقة دودة ورقة لينة، رقيقة جداً مصنوعة من PDMS، ويمكن أن تكون عازمة معسر مع ملاقط مسطحة. (ﻫ) مثال للحيوانات متعددة المغلقة في قنوات متعددة. (و) التوسع في قناة موائع جزيئية عن طريق دفع باستخدام منتقي البلاتين. تسمح مرونة القناة الحيوانات أن يلفها بلطف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : هيئة شكل C. ايليجانس. (أ) البرية من نوع (N2) C. ايليجانس على صفيحة NGM. (ب) قيادة الأمم المتحدة--119 متحولة بشكل غير طبيعي على صفيحة NGM. (ج) unc-119 طفرات المغلقة في قنوات موائع جزيئية الورقة دودة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الخطط لمراقبة مجهر يعيش الأفراد C. ايليجانس محاطة بورقة الدودة. (أ) التخطيطي للنظام ستيريوميكروسكوبي للتصوير الملاحظات. ورقة التخطيطي (ب) الملاحظة مجهر الدودة حية الإرفاق C. ايليجانس الأفراد. (ج) عرض الأقسام من الدودة ورقة حية الإرفاق C. ايليجانس وضع الأشخاص في مرحلة المجهر. كان يشير إلى المسافة العمل من المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : يعيش التخطيطي من كوليماتينج نظام ميكروبيام في تاكاساكي QST و microbeam المستهدفة التشعيع الداخلي للأفراد C. ايليجانس . (أ) نظرة عامة على كوليماتينج ميكروبيم تشعيع نظام5، التي يمكن أن تستخدم عدة الجسيمات الثقيلة أيون المعجل من سيكلوترون الميدانية متفاوتة أزيموثالي المثبتة في تيارا من فحص سي-تاكاساكي. (ب) نظرة عامة على خروج الشعاع والمسرح التلقائي التشعيع. (ج) نموذج الإعداد على المسرح التلقائي للنظام ميكروبيم كوليماتينج. (د) المواقع الرأسي للعينة تشعيع أجريت في الغرفة التشعيع. (ه) ضبط مجال تشعيع أجريت في غرفة مراقبة الإشعاع. (و) يستهدف تشعيع ميكروبيم يعيش C. ايليجانس. البلعوم بالنقر على كموقف المستهدفة والمشع بالضغط على زر التشعيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : حركية من C. ايليجانس بعد التثبيت على شريحة باستخدام تغطية الزجاج والبوليستر (الحيوانات الأليفة) الفيلم السينمائي البوليستيرين (PS). تبين أشرطة الانحناءات الجسم يعني الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة أو بعد الحركة الحرة ح 3 على صفيحة NGM (تحكم). تم فحص الحيوانات العشرة والانحناءات الهيئة كانت في المتوسط بين كل مجموعة. أخيرا، كان متوسط البيانات من خمس تجارب مستقلة لكل مجموعة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط خمسة تجارب مستقلة. حللت جميع المعطيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه في 0.05 (*) أو 0.01 (*) إلى مستوى الأهمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Video 1
الفيديو 1: أمثلة على الملاحظات تصوير أنشطة العضلات في C. ايليجانس المغلقة في ورقة دودة. أيون الكالسيوم الموجات المقابلة لانكماش خلايا العضلات في جدار الجسم أثناء تتبع الارتباطات في الأفراد HBR4 C. ايليجانس محاطة بورقة دودة. الماضي ~ 10 s لوحظت تحت إضاءة ساطعة الميدانية. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Supplementary Figure 1
التكميلية ملف 1: مثال لورقة مخصصة (الإصدار تشعيع ميكروبيم)- رسم سهم للإشارة إلى موقف كل حيوان في القناة. يتوافق مع اتجاه السهم في رأسه. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمكين التثبيت على شريحة من C. ايليجانس تحت ظروف العيش باستخدام رقاقة موائع جزيئية PDMS قابل للبلل تشعيع ميكروبيم الكفاءة المستهدفة للحيوانات متعددة. سهولة المناولة والميزات لمنع تجفيف جعل هذا النظام مناسب للتطبيقات في تشعيع ميكروبيم، بل أيضا في العديد من الاختبارات السلوكية. هذه الأوراق دودة الفعل تم تسويقها تجارياً ويمكن الحصول عليها بسهولة. رقائق موائع جزيئية التقليدية، مثل رقائق حاسة الشم، وترتبط بالمشاكل بما في ذلك انسداد الحيوانات والبيض في قنوات موائع جزيئية مغلقة مما يجعل من الصعب على جمع الحيوانات، وهكذا اتجهت هذه الرقائق أن المتاح، وبالتالي زيادة التكلفة. وفي المقابل، قنوات موائع جزيئية في الورقة دودة الحالية مفتوحة، مما يجعل من الأسهل لجمع الحيوانات. هذه الأوراق دودة ذلك يمكن استخدامها مرارا وتكرارا، مما يجعلهم أكثر اقتصادا.

الابتكارات التكنولوجية الحديثة في رقائق موائع جزيئية PDMS أظهرت اتجاها متزايداً في التعقيد الهيكلي والتعدد الوظيفي16،،من1819،،من2021، ،من 2223. ومع ذلك، نعتقد أن من المهم جعل هذا النظام بسيطة وسهلة الاستخدام. وفي الواقع، على النقيض من استخدام موائع جزيئية كبيرة التقليدية رقائق19،،من2021،22،23 تتطلب المرفق لفراغ مضخة، صغر حجم وتصميم بسيط من أوراق دودة تسمح إجراءات تجري بسهولة داخل مساحة محدودة.

أداء الأوراق دودة الاحتفاظ بالمياه تمكن الملاحظات الطويلة الأجل تنفذ. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح سمك الورقة الجزيئات أيون لتمرير من خلال العينات، مما مكن تشعيع المستهدفة ليتم تطبيقها على يعيش الأفراد C. ايليجانس مع عدد محدد من الجزيئات أيون. وتوسعت هذه المزايا من الأوراق دودة كثيرا إمكانيات إجراء تجارب بيولوجية.

ونحن نعتقد أن من المهم لعلماء الأحياء لتطوير معدات جديدة وأساليب من أجل تحسين كفاءة تلك التجارب والتحليلات. دودة أوراق والبرمجيات تشعيع microbeam قد وضعت مع هذا الهدف في الاعتبار، ويمكن أن تسهم في نجاح التجارب المبتكرة المقبلة تتجاوز أهدافها الأصلية.

على حد علمنا، مجموعتنا هو الأول من وضع هذه التكنولوجيا في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، استعمالها موحدة في المستقبل سوف تسهيل تطبيق تشعيع microbeam المستهدفة للحيوانات تحت ظروف العيش، مما يساعد على تحديد أدوار محددة خلايا الأنسجة/في العمليات الداخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور أتسوشي هيجاشيتاني لنوع المشورة فيما يتعلق بمعاملة C. ايليجانس والدكتور يويا هاتوري ويوكوتا يويشيرو كوباياشي ياشوهيكو للمناقشات القيمة. يشكر المؤلفون كاينورهابديتيس الوراثية مركز توفير سلالات ايليجانس جيم و هاء القولونية. ونحن نشكر طاقم سيكلوترون تيارا في تاكاساكي QST على مساعدتهم الطيبة مع تجارب التشعيع. ونحن نشكر الدكتور سوزان فورنس لتحرير مسودة لهذه المخطوطة. هذه الدراسة وأيده في جزء كاكينهي (منحة الأرقام JP15K11921 و JP18K18839) من JSPS لماجستير

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، 145 قضية، C. ايليجانس، تشعيع ميكروبيام، والتثبيت على شريحة، رقاقة موائع جزيئية PDMS، ورقة الدودة، ويتابيليتي
التثبيت أفراد يعيش <em>ايليجانس كاينورهابديتيس</em> باستخدام رقاقة موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان أولتراثين إلكترونية مع "الاحتفاظ بالماء"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter