Este estudio describe un alto rendimiento, basado en la proyección de imagen de neutralización micro ensayo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes específicos para virus sincicial respiratorio (VSR). Este formato de ensayo ha sido probado en tipos diferentes de la muestra.
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Artículo de método
Un ensayo de Micro-neutralización de Virus sincitial respiratorio (VSR) mejorado y alto rendimiento
En este artículo
Resumen
Resumen
Respiratorios sincicial virus específicos anticuerpos neutralizantes (NAbs de RSV) son un marcador importante de protección contra el VRS. Un número de formatos de ensayo diferentes está en uso en todo el mundo así que hay una necesidad de un método preciso y de alto rendimiento para medir RSV NAbs. Aquí describimos un análisis micro-neutralización basado en proyección de imagen que ha sido probado en el subgrupo de RSV A y también puede ser adaptado para RSV subgrupos B y tipos de muestras diferentes. Este método es altamente reproducible, con variaciones inter-ensayos para el antisuero de referencia siendo menos del 10%. Creemos que este análisis pueden establecerse fácilmente en muchos laboratorios en todo el mundo a un costo relativamente bajo. Desarrollo de un ensayo mejorado, de alto rendimiento que mide RSV NAbs representa un importante paso adelante para la estandarización de este método internacionalmente como críticos para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.
Introducción
Virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferiores en la población pediátrica en todo el mundo1. A pesar de su alta carga, no existe todavía ninguna vacuna o tratamiento. Desde 2013, la Organización Mundial de la salud (OMS) ha declarado el desarrollo de una vacuna RSV como una prioridad de investigación, con reuniones consulta anual WHO2,,3. La OMS ha acordado con RSV neutralizando la medición de anticuerpos (NAb) para supervisar la inmunogenicidad de la vacuna, esto se reconoce como el marcador serológico más importante de protec....
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Protocolo
Nota: Todas las medidas deben realizarse en una campana de BSL2 indique diferentemente. Titulación viral se requiere antes de un ensayo PRN para determinar la concentración óptima de RSV utilizada en el ensayo PRN. Se recomienda a alícuota a las poblaciones de virus en un pequeño volumen que serán descongelados una vez y para cada ensayo de NAb. También se recomienda usar el mismo stock viral para todos los ensayos de NAb realizados para todas las muestras de un estudio. Asegúrese de que los medios de cultivo y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se calienta a 37 ° C antes de agregar placas de células.
1. titulación V....
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Resultados
La valoración de una acción de virus se realizó a partir de 1:10 a 1:108 dilución para determinar la concentración del virus stock antes del ensayo PRN (resultados representativos se muestra en la figura 5). De la figura 5se puede contar PFU confiablemente en diluciones de 1:104 y 1:105. Se calculó el número promedio de PFU de pozos por triplicado en la misma dilución. Desde el número promedio de .......
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Discusión
Hemos desarrollado y optimizado un ensayo micro-neutralización de RSV simple y eficiente que puede ser adaptado fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Este ensayo es capaz de medir la capacidad de infección viral así como la inhibición de la infección viral por NAb a nivel celular mediante análisis de imagen automatizado de medición. El uso de una plataforma basada en la proyección de imagen y sistemas basados en anticuerpos específicos ha aumentado la especificidad y la sensibilidad de detección punto comparada c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a todos los participantes. Reconocemos a programa de apoyo a infraestructura operativa del gobierno de Victorian. PVL es un recipiente de la beca de desarrollo de carrera de NHMRC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A549 | ATCC | CCL-185 | proporcionada por el Dr. Keith Chappell, Universidad de Queensland |
| Cepas virales | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 número de | lote 60430286 |
| Reactivos | |||
| Acetona | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (almacenado a 4 & deg; C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sal de sodio en polvo | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (sin suero, 3,7 g / L NaHC, P / S) (almacenado a 4 & grados; C) | Servicios Científicos – Cultivo | MCRI en suministro interno | |
| Suero fetal para terneros (almacenado en alícuotas de 50 mL a -20 ° C) | Anticuerpo | Interpath SFBS-F | |
| Goat X RSV | Merck | AB1128 | |
| antisuero policlonal humano contra el virus respiratorio sincitial (VRS) (almacenado en 45 µ L alícuotas a -20 ° C) | BEI Resources | NR-4022 | Pedido gratuito a través de BEI Resources al registrarse. Este suero pertenece a un panel de antisuero humano e inmunoglobulina contra el VRS (NR-32832) |
| M199 polvo | Life Technologies | 31100035 | |
| Solución de bloqueo de diluyente de leche (almacenada a 4 & grados; C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicilina/Estreptomicina (almacenada en alícuotas de 6 ml a -20 & grados; C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O del dispensador Milli-Q | Merck | Dispensación interna | |
| 1x PBS estéril para cultivo (almacenado a 4 & grados; C) | Servicios Científicos – Cultivo | MCRI en suministro interno | |
| Tween 20 polisorbato | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumibles | |||
| Tubos cónicos Falcon (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Unidad de filtro 0,22 μ m (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Tubos Eppendorf estériles (1,5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Placas estériles de fondo plano (96 pocillos con tapa) | Interpath | 655180 | |
| Placas estériles de fondo en U (96 pocillos con tapa) | Interpath | 650180 | |
| Pipeta serológica de 5 mL | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| Pipeta serológica de 10 mL | Interpath | 607180 | |
| Pipeta serológica de 25 mL | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Pipeta de punta 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Pipeta de punta 5-20 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Pipeta de punta 100-1.000 µ LClear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Pipeta de punta 1-10 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwaresSistema de | |||
| lectura ELISpot | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemania | ||
| AID ELISpot software versión 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemania | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referencias
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
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Reimpresiones y permisos
