Un ensayo de Micro-neutralización de Virus sincitial respiratorio (VSR) mejorado y alto rendimiento

Summary

Este estudio describe un alto rendimiento, basado en la proyección de imagen de neutralización micro ensayo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes específicos para virus sincicial respiratorio (VSR). Este formato de ensayo ha sido probado en tipos diferentes de la muestra.

Abstract

Respiratorios sincicial virus específicos anticuerpos neutralizantes (NAbs de RSV) son un marcador importante de protección contra el VRS. Un número de formatos de ensayo diferentes está en uso en todo el mundo así que hay una necesidad de un método preciso y de alto rendimiento para medir RSV NAbs. Aquí describimos un análisis micro-neutralización basado en proyección de imagen que ha sido probado en el subgrupo de RSV A y también puede ser adaptado para RSV subgrupos B y tipos de muestras diferentes. Este método es altamente reproducible, con variaciones inter-ensayos para el antisuero de referencia siendo menos del 10%. Creemos que este análisis pueden establecerse fácilmente en muchos laboratorios en todo el mundo a un costo relativamente bajo. Desarrollo de un ensayo mejorado, de alto rendimiento que mide RSV NAbs representa un importante paso adelante para la estandarización de este método internacionalmente como críticos para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.

Introduction

Virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferiores en la población pediátrica en todo el mundo¹. A pesar de su alta carga, no existe todavía ninguna vacuna o tratamiento. Desde 2013, la Organización Mundial de la salud (OMS) ha declarado el desarrollo de una vacuna RSV como una prioridad de investigación, con reuniones consulta anual WHO^2,,³. La OMS ha acordado con RSV neutralizando la medición de anticuerpos (NAb) para supervisar la inmunogenicidad de la vacuna, esto se reconoce como el marcador serológico más importante de protec....

Protocol

Nota: Todas las medidas deben realizarse en una campana de BSL2 indique diferentemente. Titulación viral se requiere antes de un ensayo PRN para determinar la concentración óptima de RSV utilizada en el ensayo PRN. Se recomienda a alícuota a las poblaciones de virus en un pequeño volumen que serán descongelados una vez y para cada ensayo de NAb. También se recomienda usar el mismo stock viral para todos los ensayos de NAb realizados para todas las muestras de un estudio. Asegúrese de que los medios de cultivo y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se calienta a 37 ° C antes de agregar placas de células.

1. titulación V....

Results

La valoración de una acción de virus se realizó a partir de 1:10 a 1:10⁸ dilución para determinar la concentración del virus stock antes del ensayo PRN (resultados representativos se muestra en la figura 5). De la figura 5se puede contar PFU confiablemente en diluciones de 1:10⁴ y 1:10⁵. Se calculó el número promedio de PFU de pozos por triplicado en la misma dilución. Desde el número promedio de .......

Discussion

Hemos desarrollado y optimizado un ensayo micro-neutralización de RSV simple y eficiente que puede ser adaptado fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Este ensayo es capaz de medir la capacidad de infección viral así como la inhibición de la infección viral por NAb a nivel celular mediante análisis de imagen automatizado de medición. El uso de una plataforma basada en la proyección de imagen y sistemas basados en anticuerpos específicos ha aumentado la especificidad y la sensibilidad de detección punto comparada c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549	ATCC	CCL-185	proporcionada por el Dr. Keith Chappell, Universidad de Queensland
Cepas virales
RSV A2	ATCC	VR-1540 número de	lote 60430286
Reactivos
Acetona	Merck	1000142511
Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (almacenado a 4 & deg; C)	Life Technologies	A11055
CMC sal de sodio en polvo	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM (sin suero, 3,7 g / L NaHC, P / S) (almacenado a 4 & grados; C)	Servicios Científicos – Cultivo		MCRI en suministro interno
Suero fetal para terneros (almacenado en alícuotas de 50 mL a -20 ° C)	Anticuerpo	Interpath SFBS-F
Goat X RSV	Merck	AB1128
antisuero policlonal humano contra el virus respiratorio sincitial (VRS) (almacenado en 45 µ L alícuotas a -20 ° C)	BEI Resources	NR-4022	Pedido gratuito a través de BEI Resources al registrarse. Este suero pertenece a un panel de antisuero humano e inmunoglobulina contra el VRS (NR-32832)
M199 polvo	Life Technologies	31100035
Solución de bloqueo de diluyente de leche (almacenada a 4 & grados; C)	Australian Biosearch	50-82-01
Penicilina/Estreptomicina (almacenada en alícuotas de 6 ml a -20 & grados; C)	Life Technologies	15140122
s.d.H2O del dispensador Milli-Q	Merck		Dispensación interna
1x PBS estéril para cultivo (almacenado a 4 & grados; C)	Servicios Científicos – Cultivo		MCRI en suministro interno
Tween 20 polisorbato	Sigma-Aldrich	9005-64-5
General Consumibles
Tubos cónicos Falcon (50 mL)	Invitro Technologies	FAL352070
Unidad de filtro 0,22 μ m (500 mL)	Thermo Fisher	NAL5660020
Tubos Eppendorf estériles (1,5 mL)	Australia PL	AM12400
Placas estériles de fondo plano (96 pocillos con tapa)	Interpath	655180
Placas estériles de fondo en U (96 pocillos con tapa)	Interpath	650180
Pipeta serológica de 5 mL	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
Pipeta serológica de 10 mL	Interpath	607180
Pipeta serológica de 25 mL	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
Pipeta de punta 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
Pipeta de punta 5-20 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
Pipeta de punta 100-1.000 µ LClear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
Pipeta de punta 1-10 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Preesterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwaresSistema de
lectura ELISpot	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemania
AID ELISpot software versión 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemania
Microsoft Excel 2007