Method Article

Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio de las relaciones del sustrato de la quinasa es esencial tener una comprensión completa de las funciones de estas enzimas y sus objetivos downstream en Estados fisiológicos y patológicos. CK2 es una cinasa serina/treonina evolutivamente conservados con una creciente lista de centenares de sustratos implicados en múltiples procesos celulares. Debido a sus propiedades pleiotrópicos, identificar y caracterizar un conjunto amplio de sustratos de CK2 ha sido particularmente difícil y sigue siendo un obstáculo en el estudio de esta enzima importante. Para abordar este desafío, hemos ideado una estrategia experimental versátil que permite el enriquecimiento objetivo e identificación de posibles sustratos de CK2. Este protocolo aprovecha de la especificidad de sustrato Co dual única de CK2 permitiendo thiophosphorylation específico de sus sustratos en una célula o tejido lisado. Estas proteínas de sustrato son posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por líquido cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). Previamente hemos utilizado este enfoque para identificar con éxito CK2 sustratos de Drosophila ovarios y aquí extendemos la aplicación del presente Protocolo a las células de glioblastoma humano, ilustrando la capacidad de adaptación de este método para investigar la funciones biológicas de esta quinasa en diversos organismos modelo y sistemas experimentales.

Introduction

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Proteínas quinasas son componentes clave de cascadas de transducción de la señal. Fosforilación de las proteínas sustrato de estas enzimas produce respuestas biológicas que regulan eventos críticos que controla la división celular, el metabolismo y la diferenciación, entre otros. CK2 es una quinasa de serina/treonina ubicuo expresada, acidófilos que se conserva de la levadura a los seres humanos y que juega un papel importante en muchos procesos celulares que van desde la regulación transcripcional de la progresión del ciclo celular apoptosis1 ,2,3. La enzima es un heterotetrámero compuesto de dos α catalítica (o α') subunidades y dos subunidades β regulador4. Además de ser muy pleiotrópico, CK2 exhibe dos otras características inusuales que complican su análisis, es decir, actividad constitutiva5 y de la especificidad de sustrato Co doble6. Esta última propiedad dota la habilidad de usar GTP y ATP para la fosforilación de las proteínas sustrato de CK2.

Supresión genética de las subunidades catalíticas o reglamentarias de CK2 en ratones produce mortalidad embrionaria que indica que desempeña papeles cruciales durante el desarrollo y organogénesis7,8. CK2 también se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y representa una prometedora diana terapéutica9,10,11. De hecho, inhibidores específicos quinasa CK2 de destino están actualmente bajo investigación para este propósito12,13,14. Mientras que la inhibición de la CK2 es una opción viable, dada su carácter pleiotrópico, alternativa y quizás más racional sería objetivo crítico sustratos CK2 que subyacen a la progresión de ciertos tipos de cáncer. Por lo tanto, la completa identificación y caracterización de proteínas de sustrato de CK2 sería un beneficio significativo para dilucidar las funciones específicas de esta quinasa en un tipo particular de tejido o tumor.

Aquí, describimos un método versátil bioquímico para la identificación de sustratos de CK2 de una muestra biológica compleja como una célula o un tejido lisado. Este protocolo toma ventaja de la especificidad de sustrato Co dual de CK2 utilizando el análogo del GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) de guanosina que otras quinasas endógenas no pueden utilizar. Esto permite con eficacia la quinasa a sus substratos dentro de esta muestra para posterior aislamiento e identificación de la "etiqueta".

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Protocol

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Nota: Asegúrese de que los materiales están disponibles y preparados adecuadamente (véase Tabla de materiales).

1. preparación

  1. Mecánicamente lyse muestra de tejido (1-2 mg de tejido en 100 μl de tampón de lisis, tabla 1) o cultivadas las células (placa de 10 cm que es 80-90% confluente en 350 μl de tampón de lisis,) con el objetivo de recolectar un total de 900 μl de la muestra para el experimento. Tenga en cuenta que este volumen es en ligero exceso de lo que se requiere para el experimento que se describe a continuación.
  2. Desactivación de las muestras por centrifugación a 17.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C. Al finalizar, traslado 270 μl del sobrenadante a cada uno de tres tubos de microcentrífuga de 1,7 mL nuevo. Habrá aproximadamente 90 μl restantes. Eliminar 40 μL para ser utilizado como un "control de entrada" y el lugar en un tubo nuevo. Coloque las muestras en hielo.

2. Análisis de la cinasa: thiophosphorylation y alquilación

  1. Etiquetar los tres tubos que contienen 270 μl cada una como sigue: "cinasa reacción", "GTPγS", y "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) sólo". Preparar las reacciones de la cinasa.
    1. El tubo "cinasa reacción", añadir 2,7 μl (equivalente a 1.350 U) de CK2, luego añada 2,7 μl de 2.5 mM GTPγS.
    2. En el tubo "GTPγS solamente", añadir 2,7 μl de 2.5 mM GTPγS y luego añadir 2,7 μl de tampón de lisis.
    3. Al tubo de "PNBM sólo" añadir 5,4 μL de tampón de lisis. Película de todos los tubos para mezclar y colocar inmediatamente en hielo.
  2. Incubar todos los tubos de tres por 1 min en un baño de agua de 30 ° C. Tras la incubación, añadir 13,5 μl de 12 mg/mL PNBM a todos los tres tubos. Invertir para mezclar las muestras. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Después de iniciar la incubación en el paso 2.2, preparar las columnas desalación tan pronto como sea posibles mientras el proceso toma aproximadamente 45 minutos.

3. preparación de columnas de la desalación

  1. Inicialmente preparar columnas (3 para este experimento ejemplo) invirtiendo cada columna varias veces para volver a suspender el Sephadex G-25 resina en el buffer de almacenamiento. Permita que la resina a resolver por cada columna a un soporte de abrazadera y dejarla sentarse tranquilo durante aproximadamente 5 minutos.
  2. Después de colocar la resina Sephadex G-25, retire las tapas de la parte superior e inferior de la columna para permitir que el tampón de almacenamiento drene por gravedad y tienen un tubo que se coloca debajo de la abertura de la parte inferior para recoger el flujo a través para descartar.
  3. Una vez que se agota la memoria intermedia de almacenamiento, agregar aproximadamente 2,7 mL de tampón de lisis para equilibrar las columnas. Recoge el flujo a través y deseche. Repita 3 veces. Tras el final equilibrado, las columnas están listas para el paso 4.1.

4. eliminación de PNBM

  1. Después de la preparación de la columna (paso 3) y 1 h de incubación (paso 2.2), se aplican las muestras a las columnas. Cada columna de la etiqueta como sigue: "cinasa reacción", "Solo GTPγS" y "Sólo PNBM". La carga de cada muestra en su respectiva columna. Recoger y desechar el flujo a través.
  2. Lavar las muestras añadiendo 420 μl de tampón de lisis para cada columna. Permiten el tampón de lisis filtrar a través de la columna y recoger el flujo a través de descarte. Después de este paso de lavado, coloque los tubos para recogida de muestras.
  3. Eluir las muestras añadiendo 500 μl de tampón de lisis para cada columna. Recoger el paso que ahora contiene sustratos de CK2 alkylated y thiophosphorylated.

5. inmunoprecipitación: Parte I

  1. Preparar muestras para la inmunoprecipitación de primera extracción 80 μl de una muestra "de elución entrada control" de cada uno de los elutions respectivos ("cinasa reacción", "Solo GTPγS" y "Sólo PNBM") recogidos en el paso 4.3. Después del retiro de 80 μl de cada muestra, habrá aproximadamente 420 μl restantes por muestra.
    1. Cada muestra se dividió en 2 tubos que contiene 200 μl. Etiquetar cada tubo respectivo: "cinasa reacción anti-thiophosphate éster", "cinasa reacción IgG", "Ester GTPγS anti-thiophosphate", "GTPγS IgG", "Ester de anti-thiophosphate PNBM" y "PNBM IgG".
  2. Añadir 2,8 μg de anticuerpo de anti-thiophosphate ester a cada uno de los tubos anti-thiophosphate de marcado con éster y 2.8 μg de anticuerpo control de isotipo a cada uno de los tubos marcados con IgG. Coloque los tubos en un rotador a 4 ° C por 2 h.
  3. Comienza preparación de bolas de proteína A/g durante los últimos 15 minutos de la 2 h de incubación en el paso 5.2.

6. proteína A/g agarosa preparación de grano

  1. Brevemente vortex el tubo de almacenamiento para granos se suspende completamente de nuevo. Cortar el extremo de una P200 pipeta usando una cuchilla de afeitar limpia para aumentar calibre tamaño. Pipetee 100 μl de la mezcla de grano por inmunoprecipitación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Para este ejemplo, se necesitan un total de 6 tubos.
  2. Centrifugar los tubos a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y deséchelo. Vuelva a suspender los granos en 200 μL de tampón de lisis y brevemente vortex. Repetir el centrifugado y lavar pasos 3 veces.
  3. Después del último lavado, coloque los granos en hielo hasta que se complete la incubación en el paso 5.2.

7. inmunoprecipitación: Parte II

  1. Después de la incubación de 2 h de paso 5.2, desactivación de las muestras a 17.500 x g durante 3 min a 4 ° C. Tras centrifugación añadir 200 μL de cada muestra en los tubos con los granos lavados. Colocar los tubos en un rotador a 4 ° C durante 1 h.
  2. Después de la 1 h de incubación, centrifugar los tubos a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. A continuación quitar 40 μl del sobrenadante de cada muestra y guardar como un "control de agotamiento" (total 6 tubos). Quitar el resto del sobrenadante y desechar. Tenga cuidado de no para molestar a los granos.
  3. Lavar las muestras mediante la adición de 200 μL de tampón de lisis y de Vortex brevemente. Luego Centrifugue a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado y centrifugado pasos 3 veces. Tenga cuidado de no para molestar a los granos durante estos pasos.
  4. Después de completar los pasos de lavado, añada 50 μl de tampón x 2 para cada muestra que contiene los granos. Para todas las muestras, añadir 8 μl de 6 x el tampón de muestra: "control de entrada", "controles de elución de entrada" y "controles de agotamiento".
  5. Una vez que el buffer se agrega a los tubos, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar y calentar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos antes de proceder a SDS-PAGE.

8. Análisis y validación de resultados

  1. Validar la alquilación y thiophosphorylation dependiente de la CK2 exitosa.
    1. Para determinar la eficacia de la thiophosphorylation mediada por CK2 en el paso 2.2, realizar SDS-PAGE y Western Blot ejecutando 15-20 μl de los "elución controles de entrada" recogido en el paso 5.1 en un gel de poliacrilamida al 12,5%.
    2. Probe las membranas con los siguientes anticuerpos: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α y anti-GAPDH (u otro control de carga apropiado). Si este paso fue exitoso, una señal de mayor anti-thiophosphate éster debe ser evidente en el carril "cinasa reacción" frente a los otros dos carriles (figura 2).
  2. Visualizar enriquecidos sustratos putativos de CK2 y determinar la identidad de la proteína.
    1. Para evaluar si los pasos de inmunoprecipitación tuvieron éxito, ejecute 25-30 μl de las muestras que se eluyen de los granos en el paso 7.4 en un gel de poliacrilamida al 12,5% separados. Asegúrese de que todo el equipo esté limpio y use guantes en todo momento durante este paso para minimizar la contaminación.
    2. Tinción del gel con Coomassie azul para visualizar proteínas enriquecidas de diversas etapas del protocolo experimental (figura 3). Usando nuevo razorblades, suprimir cuidadosamente bandas únicos presentes en el carril "cinasa reacción anti-thiophosphate ester IP", tomando nota de sus pesos moleculares aproximados.
    3. Presentar estas bandas para la identificación de la proteína líquida cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) (figura 4). Si existen anticuerpos dirigidos contra las proteínas identificadas, confirmar los resultados de la espectrometría de masas por SDS-PAGE y el immunoblotting de entrada, agotado, y fracciones de la propiedad intelectual recolectan en el curso de protocolo (figura 4).

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Results

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Un diagrama esquemático del procedimiento experimental se ofrece en la figura 1. La base subyacente de la técnica es la inusual habilidad de CK2 con GTP para la transferencia de grupo fosforilo. Además de holoenzyme de CK2 exógeno junto con el análogo del GTP, GTPγS, a un lisado celular resulta en thiophosphorylation de sustratos de CK2 endógenos. Posterior tratamiento de lisado con lo alquilantes reactivo p- Nitrobencilo mesilato (PNBM) genera una m...

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Discussion

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Aquí, describimos un método bioquímico relativamente simple para la identificación de sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja. Los pasos críticos de este protocolo se basan en las propiedades enzimáticas inusuales de CK2 e incluyen thiophosphorylation CK2 dependiente de las proteínas sustrato específico utilizando GTPγS y su posterior inmunoprecipitación e identificación. Con estos resultados, hemos demostrado la utilidad y versatilidad de este enfoque como ahora hemos aplicado est...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue financiado en parte por una beca de la Commonwealth mejora Universal de investigación del Departamento de salud de Pennsylvania a T.I.S.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 y micro; L
2,5 mM GTPγ SSigma-AldrichG8634-1MG5.4 y micro; L
Anti-CK2 y alfa; (E-7) anticuerpo monoclonal de ratónSanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 para Western blot
Anticuerpo monoclonal anti-GAPDH (6C5) contra ratonesSanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 para Western blot
Anticuerpo policlonal antinucleolina de conejoAbcamab227581:1000 para Western blot
Anticuerpo monoclonal anti-tiofosfato [51-8] de conejoAbcamab92570Varía (concentración final 2.8 y micro; g para cada muestra)
Centrífuga preajustada a 4º CThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini Inhibidor de la proteasa sin EDTATampón de
Ver recetaa continuación Ver receta a continuación 30mL
Anticuerpo IgG de conejo normal (control de isotipo)Tecnología de señalización celular2729S Varía (concentración final 2.8 y micro; g por cada muestra)
PD MiniTrap ColumnGE Healthcare28-9180-103 columnas
Protein A/G Plus Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µ L
Holoenzima CK2 humana recombinanteNew England BiolabsP6010S2.7 y micro; L
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G células de glioblastoma humanoATCCCRL-1690
Baño de agua preestablecido a 30º CShel LabH20 Serie de baño Modelo# SWB15
lisis 11836170001 Roche

References

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