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Artículo de método

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

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DOI:

10.3791/59043

16 de abril de 2019

En este artículo

Resumen

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Resumen

Acumulación de tejido de células inmunitarias altamente activadas representa un sello de varias enfermedades inflamatorias crónicas y surgió como una diana terapéutica atractiva en el manejo clínico de los pacientes afectados. Para optimizar aún más estrategias con el objetivo de la regulación terapéutica de infiltración de tejido patológicamente desequilibrada de células inmunológicas inflamatorias, será de particular importancia para el logro de mejores perspectivas en enfermedades órgano-específicas y propiedades homing de linfocitos periféricos. El protocolo experimental descrito aquí permite para vigilar acumulación pulmonar de fluorescencia etiquetadas y eventualmente transferidos los linfocitos humanos en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por la papaína. En contraste con estudios in vitro estándar utilizadas para el análisis de la migración de células inmunes y quimiotaxis, la configuración en vivo ahora introducida tiene en cuenta los aspectos pulmonar específico de organización tejido y la influencia del complejo inflamatorio escenario tiene lugar en el organismo murino vivo. Por otra parte, la proyección de imagen microscópica tridimensional transversal hoja de luz fluorescencia no sólo proporciona datos cuantitativos sobre las células inmunes de la infiltración, pero también representa el patrón de localización de células inmunitarias en el pulmón inflamado. En general, somos capaces de introducir una técnica innovadora de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que pueden aplicarse fácilmente siguiendo el protocolo paso a paso siempre.

Introducción

Trastornos inflamatorios clásicos del pulmón, como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), son bien conocidos para ser conducido por un mayor reclutamiento de linfocitos activados en el tejido pulmonar1,2. Publicado por linfocitos citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ y TNF-α) promover aún más la Quimiotaxis de las células inmunes innatas y adaptativas, inducen remodelación fibrótica de la vía aérea o directamente dañar el parénquima de pulmón2. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes responsables de la acumulación patológica de linfocitos en el tejido p....

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Protocolo

Experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por las autoridades locales competentes en Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania). Ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas. La colección de la sangre humana fue aprobada por el Comité de ética local y la Junta de revisión institucional de la Universidad de Erlangen-Nuremberg. Cada paciente dio consentimiento de informado escrita.

1. inducir inflamación alérgica del pulmón en ratones

Nota: Como se ha descrito en estudios anteriores27, el siguiente procedimi....

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Resultados

El protocolo presentado describe un modelo experimental de ratón, que permite monitoreo y cuantificación de la acumulación de linfocitos T humanos eventualmente transferidos en el pulmón mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. Figura 1 Proporciona un Resumen esquemático de los pasos en vivo del programa experimental . Para garantizar resultados confiables, se etiqueta de sustancial importancia para garantizar una buena calidad de los aislados y fluorescencia.......

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Discusión

El nivel experimental descrito aquí proporciona la oportunidad de controlar la capacidad recalada de pulmón de células inmunes humanas primarias bajo condiciones inflamatorias in vivo y así relevante complementos clásico realiza quimiotaxis y adherencia in vitro ensayos. Para tener en las características de órgano anatómico específico de cuenta del pulmón, aspectos importantes de la célula inmune autoguiado hacia el blanco (incluyendo chemotaxis y célula de distribución dentro del órgano blan.......

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Divulgaciones

M.F. Neurath ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. Los restantes autores no revelar cualquier conflicto.

Agradecimientos

Los autores reconocen con agradecimiento financiación por la DFG colaboración investigación centros SFB 1181 y 241 TRR. La óptica de imagen centro de Erlangen (OICE) y en particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal y Tina Fraaß (proyecto Z2 de la DFG CRC 1181) son reconocidos por expertos asistencia técnica para la proyección de imagen microscópica hoja de luz de la fluorescencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agarosa NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania2267.4
AlexaFlour594 anticuerpo CD45 humanoBioLegend, San Diego, EE. UU304060
Cloruro de amonioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemaniaCánula K2981
21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU301300
Tinte para la proliferación celular eflour670eBioscience Inc., San Diego, EE. UU.65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanoMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania130-045-101
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania8043.1
Tubo de extracción de sangre de potasio-EDTA, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania21066001
Ethly cinamato (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania112372-100G
Etanol ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania5054.3
FBS (suero fetal bovino) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, AlemaniaP40-47500
Filtro 100 µ m VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Alemania732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zúrich, Suizan.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Alemanian.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Friburgo, Alemania3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Alemanian.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania130-042-303
Cánula Multimosca 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania851638035
aguja de 30 GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemania9161502
cámara de recuentoNeubauer neoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlemaniaC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü Sseldorf, AlemaniaColumna PSK1C
LSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania130-042-401
Medios de separación de linfocitos (densidad 1.077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1.071.440.025
PBS Dulbecco (solución salina tamponada con fosfato)Biochrom GmbH, Berlín, AlemaniaL182-10
PerCP/Cy5.5 antihumano CD4BioLegend, San Diego, EE. UU.317428
PerCP/Cy5.5 ratón IgG2b, κ isotipo CtrlBioLegend, San Diego, EE. UU.400337
PFA (paraformaldehído)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania0335.1
Carbonato de hidrógeno de potasioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemaniaP7481
Pipeta serológica 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania86.1254.001 
Jeringa 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemania9166017V
Jeringa 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU260067
Jeringa 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU
Tubo 1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania72.706.400
Tubo 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania72.695.400 
Tubo 2 mL, marrónSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania72.695.001
Tubo 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania62.554.502 
Tubo 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemania62.547.254 
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania130-090-976
Xilacina (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, AlemaniaKPOBD32
. . . . 260069

Referencias

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma ....

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