Artículo de método

La aplicación Advanced In Vitro cultivo tecnología para estudiar la Microbiota del intestino humano

DOI:

10.3791/59054

⸱

15 de febrero de 2019

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1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la microbiota intestinal de la Colón in vitro, utilizando una serie de biorreactores que simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal.

Resumen

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La microbiota del intestino humano juega un papel vital en la salud humana y enfermedad. Estudio de la microbiota intestinal usando un modelo en vivo , es difícil debido a su compleja naturaleza y su diversa asociación con componentes de mamíferos. El objetivo de este protocolo es la microbiota intestinal in vitro, que permite el estudio de la dinámica de la microbiota del intestino, sin tener que considerar la contribución del medio mamífero de la cultura. Usando en vitro tecnología de cultivo, se simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, incluyendo parámetros tales como pH, temperatura, anaerobiosis y tiempo de tránsito. La superficie intestinal del colon se simula agregando portadores recubiertos de mucina, creando una fase mucosa y agregar otra dimensión. La microbiota intestinal se introduce al inocular con el material fecal humano. A la inoculación con esta mezcla compleja de bacterias, microbios específicos se enriquecen en las diferentes longitudinal (ascendentes, dos puntos transversales y descendentes) y transversal (luminal y mucosa) del modelo in vitro. Es crucial para permitir que el sistema alcance un estado estacionario, en el que la comunidad y los metabolitos producidos permanecen estables. Los resultados experimentales en este manuscrito demuestran cómo la comunidad de microbiota intestinal inoculados se desarrolla en una comunidad estable en el tiempo. Una vez que se alcanza el estado estacionario, el sistema puede utilizarse para analizar las interacciones bacterianas y las funciones de la comunidad o para probar los efectos de los aditivos en la microbiota intestinal, tales como alimentos, componentes de alimentos o productos farmacéuticos.

Introducción

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La microbiota intestinal es una comunidad de microorganismos que residen en el tracto gastrointestinal humano (GIT).  Esta comunidad alcanza la máxima concentración en el colon, que se estima para sostener 1013-1014 bacterias, de 500-1.000 especies, que viven en simbiosis con el entorno de colon1,2. La composición y funciones de la microbiota intestinal variar espacialmente a lo largo del GIT, formando comunidades específicas de la región, con la mayoría diversidad distal2,3,4,5. Para cada región anatómica, separado de las comunidades microbianas residen en el lumen y en la guarnición mucosa de6. La comunidad de lumen tiene acceso más directo a los nutrientes como sustratos atravesar el compartimiento luminal7. A pesar de esto, algunas bacterias residen preferentemente en la capa de moco, utilizando la mucina producida por las células del colon como una fuente de energía1,5,8. La diferencia en microambientes entre las fases luminales y de la mucosas resulta en divergencia y el desarrollo de comunidades específicas de fase. En conjunto, estas comunidades proporcionan funciones metabólicas, como el metabolismo de nutrientes y la producción de vitaminas y las funciones inmunológicas, como prevención de la colonización de patógenos humanos1,3, 9. la microbiota intestinal también trabaja funcionalmente en conjugación con el colon humano las células3.

Como parte importante de la GIT humana, no es sorprendente que la microbiota intestinal se conoce para contribuir a ambos host salud y enfermedad estado3,9,10,11,12. Un cambio en la población microbiana del intestino se ha asociado con varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos del GIT como enfermedad intestinal intestinal (EII) y el síndrome intestinal del intestino (IBS), sino también otras enfermedades como la obesidad, enfermedades circulatorias y autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolitos producidos a partir de la microbiota intestinal tienen un efecto global, llegando a lugares lejos de la tripa12,13. Por ejemplo, el eje cerebro intestinal se asocia con trastornos mentales como ansiedad y depresión14. Por lo tanto, estudiar la microbiota intestinal es importante para múltiples campos de investigación y es aplicable a muchas enfermedades, incluso los no asociados con el GIT.

Si bien es ampliamente reconocido que el estudio de la microbiota intestinal es importante, es una tarea complicada. Múltiples modelos animales están disponibles, de pequeños animales como el pez cebra, las ratas y ratones, a los más grandes como monos y cerdos15-19. Sin embargo, la aplicación de estos animales en cuanto a la microbiota del intestino humano no es sencilla, ya que estos animales tienen una única comunidad bacteriana que ha evolucionado basada en dieta y medio ambiente, y son anatómicamente distintas de los seres humanos20 , 21. el uso de sujetos humanos elimina la cuestión de la relevancia, pero presenta otro conjunto de desafíos. Estudios en humanos son costosos, lentos y son éticamente obligado11. Por otra parte, factores de confusión influyen en la microbiota intestinal en estudios en humanos, incluyendo edad o etapa de desarrollo, medio ambiente, dieta, medicamentos y factores genéticos2,4,22.  También hay restricciones en lo que puede ser probado en seres humanos, y que tipo de muestras puede ser cosechado en lo tiempos4.

Una desventaja crítica del uso de un sistema en vivo para el estudio de la microbiota intestinal es la presencia de mamíferos. La microbiota intestinal y las células humanas interactúan uno con el otro, y en una en vivo , es imposible distinguir los dos. Los metabolitos producidos por la microbiota intestinal se toman en por las células del colon, por lo que las mediciones no pueden calcularse con precisión. Por lo tanto, cualquier estudio mecanístico debe limitarse a punto final medidas11. Otra desventaja importante para estudios in vivo es la incapacidad para recoger muestras de las distintas regiones de la GIT longitudinalmente23. Esto no permite la evaluación de los cambios que pueden ocurrir en los microambientes del colon en tiempo12.  Muchos en vivo los estudios, incluyendo estudios en seres humanos, se basan en el análisis de muestras de heces para detectar cambios en la microbiota intestinal del12. Mientras que esto es informativo, no proporciona datos sobre la microbiota intestinal a través del GIT y no distingue entre las comunidades luminal y de la mucosa5,6,7,8.

De la microbiota intestinal, es necesaria la aplicación de un método en vitro para estudiar la dinámica de la comunidad bacteriana, sin la interferencia de los componentes de mamíferos. Utilizando un método en vitro permite el estricto control de condiciones ambientales10pruebas de múltiples parámetros simultáneamente y la capacidad de la muestra longitudinal y, en grandes volúmenes11. Desde un método in vitro utiliza un dispositivo mecánico y no un host, consideraciones no son necesarios para la edad, medio ambiente, dieta y genética. Estos sistemas pueden utilizarse para probar ya sea la comunidad de microbiota intestinal entera, selecciona solamente los organismos, o incluso solos cepas. Lo importante, los resultados in vitro son reproducibles, pero mantener un nivel de diversidad comparable a estudios in vivo11,22.

Dependiendo de la hipótesis en cuestión y los resultados deseados, in vitro estudios pueden realizarse de muchas maneras.  Pueden utilizar sistemas del solo-recipiente y métodos simples, como incubar las muestras con homogeneizado fecal24 o realizar culturas único lote en el transcurso de 24-48 h25. También puede lograr usando sistemas del solo-recipiente y métodos más complejos, como el uso de un sistema de chemostat para producir una comunidad microbiana intestinal estable del11. Sin embargo, el uso de un solo reactor puede simplificar la microbiota12 ya que sólo representa una sección del colon, a pesar de que el colon se compone de las regiones ascendentes, transversales y descendentes.

Para estudiar la comunidad de microbiota intestinal que se desarrolla en las diferentes regiones del colon (ascendentes, transversales y descendentes regiones), se puede emplear un sistema complejo, de múltiples etapas. En estos sistemas, se instalan varios buques para imitar las diferentes regiones del colon, por lo que la microbiota intestinal de las regiones ascendentes, transversales y descendentes se cultivan independientemente. Estos vasos están conectados, usando bombas para mover sustratos en secuencia, desde la ascensión a la transversal a las regiones de colon descendente, imitando el flujo de nutrientes a través del GIT.

El objetivo de este estudio era demostrar cómo un sistema de cultivo in vitro de 5 etapas (véase Tabla de materiales) se puede utilizar para el cultivo de la comunidad de microbiota intestinal y para demostrar la dinámica de la comunidad en términos de estabilidad y composición. En este sistema, un recipiente representa el estómago y uno representan el intestino. El colon se divide en tres regiones (ascendente, transverso, descendente), con un vaso que representa cada región26. En esta configuración experimental, dos sistemas completos se ejecutan en paralelo, con la unidad 1 que contiene portadores de mucina que representa la superficie de la mucosa y la unidad 2 que contiene no portadores de mucina. Las comunidades que se desarrolló en las fases luminales y de la mucosas de cada región se compararon entre sí y del inóculo fecal con el tiempo mediante el SCFA análisis y secuenciación de 16S rRNA gene. Los resultados presentados demuestran el tipo de comunidad, tanto en términos de composición y funcionalidad, que puede ser producido a partir de este tipo de sistema in vitro.

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Protocolo

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1. materiales y preparativos

Nota: El medio definido se adquiere en forma de polvo (véase Tabla de materiales). La composición del medio definida en g/L es el siguiente: Arabinogalactan (1.2), pectina (2.0), xilano (0,5), glucosa (0.4), extracto de levadura (3.0), peptona especial (1.0), mucina (2.0), L-cisteína-HCl (0,2).

  1. Preparar el medio definido
    1. Llene un frasco de 4 L con 2 L de agua destilada, desionizada doble.
    2. Añadir 29,2 g de polvo medio definido para el agua y mezcla completa unidad homogeneizada.
    3. Añadir un agitador magnético y atornillar la tapa.
    4. Autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
    5. Después de enfriar, almacenar el medio definido preparado en un refrigerador a 4 ° C con agitación constante (agitador magnético).
  2. Preparar jugo pancreático
    1. Autoclave 2L de agua destilada, desionizada en un recipiente de 5L con una barra agitadora agregó, a 121 ° C durante 30 minutos.
    2. Después de la esterilización en autoclave, permitir que el agua se enfríe a temperatura ambiente.
    3. Añadir 12.5 g NaHCO3, 6 g bilis y pancreatina 0,9 g. Colocar en el agitador magnético para mezclar.
      Nota: El jugo pancreático debe ser preparado fresco cada 2-3 días y refrigerado con agitación después de lo hecho.
  3. Tampón fosfato
    1. Colocar un frasco de 1 L que contenga una barra agitadora magnética en un agitador magnético. Añadir 0,5 L de agua destilada, desionizada y active la agitación.
    2. A continuación, agregar 6,8 g KH2PO4y 8,8 g de K2HPO40,1 g sodio tioglicolato. Rematar con agua hasta un volumen final de 1 L.
    3. Después de que los componentes se han disuelto completamente, ajustar el pH a 7.0 con NaOH.
    4. Vierta el búfer en un recipiente de 2 L con tapón de rosca tapa y autoclave a 121 ° C durante 30 minutos, asegúrese de que la tapa esté bien libremente y no cerrada.
    5. Después de retirar del autoclave, deje que la solución se enfríe a la temperatura ambiente. Almacenar el buffer a temperatura ambiente hasta por 2 semanas.
  4. Elaborar portadores de agar de mucina
    1. Autoclave mucina plástico (véase Tabla de materiales), pinzas, malla de plástico (forma tubular) y los lazos zip a 131 ° C durante 30 minutos.
    2. Autoclave de 300 mL de doble agua destilada, desionizada agua a 131 ° C durante 30 minutos tienda a temperatura ambiente hasta su uso.
    3. En un gabinete con la cabina de flujo laminar bioseguridad, llenan de placas de Petri estériles los portadores de mucina plástico utilizando pinzas estériles.
      Nota: Los portadores de mucina son círculos de plástico huecos que se llenan con agar de mucina. Una vez llenado, la tapa se puede colocar en la parte superior y estas pueden apartar.
    4. Para preparar agar de mucina, añadir 3 g de agar bacteriana y 15 g de mucina porcina a los 300 mL de agua esterilizada.
    5. En una campana de humos, hervir esta solución, luego retire de la fuente de calor y deje enfriar durante 1 minuto Repita el punto de ebullición y enfriamiento para un total de 3 veces.
    6. Una vez que el recipiente de vidrio que contiene la solución de agar de mucina está suficientemente frío al tacto, trasladan la bioseguridad con flujo laminar.
    7. En la seguridad de la biotecnología con la cabina de flujo laminar, verter el agar de mucina líquida sobre los portadores de mucina plástico que se colocaron en la caja Petri. Asegúrese de que todos los portadores están llenos completamente de agar de mucina.
    8. Coloque la tapa en la caja Petri y deje que se enfríe bajo flujo laminar.
    9. Para montar los portadores de la mucina, tomar la malla de plástico esterilizada e inserte portadores de mucina que contienen el agar solidificado de la mucina de la placa de Petri utilizando pinzas estériles.
    10. Utilizar abrazaderas de plástico para cerrar los extremos de la malla. De esta manera las funciones de red para contener los portadores de la mucina lleno de agar de mucina. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.

2. configurar, inoculación y el funcionamiento del sistema

  1. Puesta en marcha de sistema de cultivo
    Nota:     el simulador Twin del ecosistema microbiano Intestinal humano fue utilizado para este estudio.
    1. Coloque 10 Biorreactores que contienen barras de agitador de agitadores magnéticos y gire en agitación.
      Nota: Cada unidad consistirá en biorreactores de 5, así que 2 unidades requerirán 10 Biorreactores.
    2. Conectar 5 Biorreactores entre sí usando tubos de silicio en secuencia a través de la bomba peristáltica (figura 1). Utilice las bombas transversal el contenido líquido de un biorreactor para la próxima.
    3. Los Biorreactores en la secuencia siguiente de la etiqueta: estómago, intestino delgado, colon ascendente, colon transverso, descendente colon para representar a la orden del tracto gastrointestinal.
      Nota: Los Biorreactores pueden todos ser idénticos, o biorreactores de estómago y el intestino pueden ser más pequeño comparados los Biorreactores de colon ya que tienen menos volumen. Configuración de los Biorreactores de esta manera significa que la región de colon ascendente recibe nutrientes desde el intestino delgado, el colon transverso región recibe nutrientes de la región de colon ascendente y la región de colon descendente recibe nutrientes de la región transversal. De esta manera, el sistema es mímico el movimiento secuencial de nutrientes a través del tracto gastrointestinal.
    4. Coloque el medio definido y jugo pancreático en un refrigerador a 4 ° C con agitación constante con agitadores magnéticos. Usando el tubo de silicona, conectar el medio definido para el biorreactor del estómago mediante una bomba peristáltica y conectar el jugo pancreático al intestino mediante una bomba peristáltica.
    5. Añadir a agente de la solidificación a una bolsa de drenaje de orina. Conecte los dos puntos descendentes a la bolsa de drenaje de orina a través de la bomba peristáltica. Deseche la solidificada como residuos biológicos durante el experimento.
    6. Usando el tubo de silicona, conectar la camisa de agua de cada recipiente en orden y Conecte cada extremo en el baño circulante de agua. Llene la bañera de agua circulante con agua destilada (esta cantidad varía dependiendo del tipo de baño utilizado en circulación) y a 37 ° C.
    7. Usando tubos de silicio, conecte el ácido y la base a la tapa de cada vaso por medio de bombas peristálticas. Las concentraciones recomendadas son de 0.5 M de HCl y 0.5 M NaOH.
    8. Inserte las sondas de pH para cada vaso a través del puerto designado en la tapa. Este puerto está diseñado para sostener la sonda de pH y el tornillo en la tapa (figura 1). Ajuste el pH de cada región como sigue: estómago, pH = 2; Intestino delgado, pH = 6.7-6.9; Colon ascendente, pH = 5.6-5.9; Colon transverso, pH = 6.15-6.4; Colon descendente, pH = 6,6 6,9.
      Nota: Durante la fase inicial, la comunidad se distingue en base a la diferencia en valores de pH de la región. Sin embargo, una vez que comienzan los ciclos de alimentación, las comunidades más maduro basado en las diferencias en el aporte de nutrientes.
    9. Conecte una línea de nitrógeno usando el tubo de silicona para la tapa de cada vaso utilizando el puerto designado. La línea de nitrógeno debe fluir en la siguiente secuencia: estómago, intestino delgado, colon ascendente, colon transverso, descendente colon. Asegúrese de que cada unidad tiene su propio color para evitar la contaminación cruzada.
      Nota: El nitrógeno se usa para quitar oxígeno desde el sistema y mantiene la anaerobiosis durante el experimento.
    10. Inserte un tubo de metal de la muestra a través de la tapa de cada biorreactor utilizando el puerto designado. El tubo metálico se extiende hacia abajo en el biorreactor y se utiliza para recoger las muestras de líquido.
    11. Añadir un pequeño trozo de tubo de silicona en el extremo superior del tubo de muestra y una cerradura de Luer para permitir el uso de una jeringa durante el muestreo.
  2. Inoculación del sistema
    1. Llenar las regiones de Colón con el medio definido con los siguientes volúmenes: 500 mL en el colon ascendente, 800 mL en el colon transverso y 600 mL en el colon descendente.
    2. Añadir portadores de mucina agar a las regiones de Colón, en una cantidad proporcional al volumen del reactor. Para este experimento, se utilizaron 60 portadores por reactor.
    3. Quite cualquier exceso medio definido con una jeringa y el tubo de muestra ya que agregar los portadores eleva el nivel de líquido en el biorreactor.
    4. Encienda las sondas de pH para ajustar el pH en cada reactor, utilizando el ordenador.
    5. Activar la descarga de nitrógeno durante 20 minutos.
      Nota: El homogeneizado fecal utilizado para la inoculación se compra como 10% heces homogeneizadas en solución de glicerol 10% (véase Tabla de materiales). La muestra fecal se selecciona al azar de un grupo de donantes con los siguientes criterios: un americano consume una dieta occidental típica (no vegan o vegetariano), entre 21-45 años de edad, antibióticos gratis durante al menos 1 año, con un índice de masa corporal promedio (18.5-24.9) . Para este protocolo, se utiliza sólo un único donante. Sin embargo, esto puede modificarse debido a diseño experimental.
    6. Antes de la inoculación, descongelar el homogeneizado fecal siguiendo las instrucciones del fabricante.
    7. Inocular cada reactor de colon mediante la adición del fecal homogeneizado en una cantidad igual al 5% del volumen del reactor a través del puerto de la muestra, utilizando una jeringa de 60 mL (25 mL en el colon ascendente, 40 mL para el colon transverso, 30 mL para el colon descendente).
    8. Crecer los cultivos en biorreactores durante la noche con control de pH.
    9. Después del crecimiento durante la noche, recoger muestras del líquido luminal de cada región del colon como se detalla a continuación en la sección 3. Después de finalizado el muestreo, encienda el programa de computadora para comenzar la alimentación.
  3. Ciclos de alimentación diaria
    Nota:     los ciclos de alimentación diarios son equipo automatizado.
    1. Tres veces al día, 140 mL del medio de definida la bomba en el biorreactor del estómago y permite para incubar durante 1 h.
    2. Después de 1 h de incubación, la bomba el contenido del estómago al intestino. Al mismo tiempo, la bomba 60 mL de jugo pancreático al intestino.
    3. En el intestino, gire el ajuste del pH a pH 6.7-6.9 y permitir que la mezcla de incubar por 90 minutos. Durante la incubación, activar la descarga de nitrógeno para cada sistema por un total de 10 minutos cada uno.
    4. Después de la incubación de 90 minutos, encender las bombas desde el intestino al colon ascendente, el colon ascendente, colon transverso, el colon transverso y el colon descendente, el colon descendente a la basura al mismo tiempo.
  4. Línea de tiempo experimental
    Nota:     la sistema in vitro que se utiliza aquí es operado de manera continua por aproximadamente 8 semanas en longitud. A continuación es una línea de tiempo experimental recomendado, sin embargo, esto puede ser modificado según las exigencias y el objetivo del experimento.
    1. Establecer sistema de pasos aparecen en el paso 2.1.
    2. Muestras del crecimiento durante la noche siguiendo el protocolo a continuación de la cosecha. Comienzan los ciclos diarios, alimentación tres veces al día siguiendo el protocolo anterior.
    3. Ejecutar el experimento para un total de 2 semanas para permitir que las bacterias se estabilice.
      Nota: Funcionamiento del sistema significa que el pH se mantiene, los ciclos diarios de alimentación siguen tres veces al día, y los portadores de la mucosa se cambian 2 - 3 veces cada semana.
    4. Después de la estabilización, ejecutar el experimento durante dos semanas el período de control.
    5. Después del período de control, utilice el sistema para probar diferentes componentes o variables, conocidas como el período de tratamiento.
    6. Después del período de tratamiento, dejar de añadir los componentes o variables y volver a las condiciones normales. Esto se considera el periodo de lavado y se utiliza para determinar si o no los cambios en la comunidad son permanentes.

3. recolección de muestras del sistema de

Nota: Durante el experimento, las muestras pueden recolectarse de la fase luminal o mucosa de cualquier región en cualquier momento, siguiendo el debajo de las directrices.

  1. Recolección de muestras de luminales
    1. Las muestras de líquido luminales a través del puerto de muestra que se extiende hasta la mitad del líquido de cultivo de la cosecha. Comenzar por limpiar el Luer-Lock en el puerto de la muestra con etanol al 70% o el cojín del alcohol pequeño y deje que se seque.
    2. Asegurar que se elimine todo el aire de una jeringa de 30 mL y conéctelo al puerto de la muestra. Dibujar hacia arriba y hacia abajo 3 - 5 veces para asegurar una mezcla adecuada de los componentes de la embarcación. Después, dibuja un total de 30 mL de la cultura.
    3. Alícuota de las muestras luminales como necesitan en tubos falcon estériles y tienda en el hielo. Después de muestreo se completa transferencia de éstos a un congelador de-80 ° C.
    4. Para el análisis SCFA, 15 mL de la muestra luminal rota a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante es filtrada mediante un filtro de 0.2 μM de PES de la jeringa. Guarde el sobrenadante filtrado a-80 ° C.
      1. Para el análisis de la DNA, spin 1 mL de fluido luminal a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 min., deseche el sobrenadante y almacenar el pellet a-80 ° C.
      2. Como una copia de seguridad, almacenar 10 mL de fluido luminal a-80 ° C para la mayoría de los experimentos.
  2. Recolección de muestras de mucosa
    Nota:     cambiar portadores mucosa cada 2-3 días.
    1. Retirar y llevar a cabo los portadores de mucina preparado en el refrigerador.
    2. Abra de la descarga de nitrógeno y la tapa del reactor rápidamente. Quitar 50% de los portadores de la mucina y añadir nuevos.
    3. Sellar la tapa rápidamente y mantener el nitrógeno al ras en otro 20 minutos.
    4. Para la extracción de ADN, alícuotas de 0,25-0,5 g de agar en un tubo de 2 mL y se almacenó a-80 ° C hasta que se necesite.

4. análisis, secuencia y extracción de ADN

Nota: Se extrajo ADN utilizando el método de extracción de ADN de CTAB con homogenización físico en una campana de humo29. Después de la extracción, se utiliza un espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de ADN en cada muestra.

  1. Preparación de buffer CTAB
    1. Disolver 4,2 g de K2HPO4 y 4,09 g NaCl en 200 mL de agua desionizada, destilada, entonces el autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
    2. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
    3. Añadir 10 g de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) y el calor a 60 ° C con agitación.
    4. Después de que el CTAB es disuelto, retirar la solución de calefacción y enfriamiento a temperatura ambiente.
  2. Preparar la solución de PEG-6000
    1. Disolver 300 g de polietilenglicol 6.000 y 93,5 g NaCl en 1 L de agua desionizada, agua destilada.
    2. Después de todas las partículas se disuelven, autoclave la solución a 121 ° C durante 30 minutos.
    3. Después de la esterilización en autoclave, enfriar la solución a temperatura ambiente antes de usar.
  3. Realizar la extracción de ADN
    1. Añadir 500 μL de buffer CTAB y 500 μL de fenol-cloroformo-Isoamyl alcohol al tubo de muestra de 2 mL y vortex para homogeneizar.
    2. Transferir el contenido completo del tubo de muestra en un 0,1 mm físico de homogeneización del tubo (véase Tabla de materiales).
    3. Homogeneizar los tubos durante 20 s en la posición más alta, dos veces, con una pausa de s 20 entre, utilizando un homogeneizador de la físico (véase Tabla de materiales).
    4. Centrifugar los tubos homogeneizados a 3.000 x g durante 5 minutos.
    5. Transferir 300 μL del sobrenadante a un tubo limpio, de 1,7 mL y agregar 500 μL de CTAB tampón al tubo original.
    6. Homogeneizar este tubo nuevo métodos en pasos 4.3.2-4.3.3 y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos.
    7. Después de la centrifugación, traslado otro 300 μL del sobrenadante a tubo nuevo que ahora contiene 600 μL.
    8. Agregar un total de alcohol de cloroformo-isoamílico de 600 μL en el tubo que contiene 600 μL del sobrenadante.
    9. Invierta los tubos para mezclar y luego centrifugar brevemente. Transferir 500 μL de la fase superior a un tubo limpio de 1,7 mL. Sólo asegúrese de tomar la fase superior.
    10. A continuación, añadir 1000 μL de solución de Peg-6000, invertir los tubos para mezclar y luego incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
    11. Después de la incubación, centrifugar los tubos a 18.200 x g, 4 º C, durante 10 minutos.
    12. Deseche el sobrenadante y limpiar el pellet con etanol al 70% frío hielo.
    13. Centrifugar los tubos otra vez a 18.200 x g, 4 º C, 10 minutos eliminar el sobrenadante y permitir que el sedimento se seque en el gabinete de bioseguridad con flujo laminar.
    14. Después de la pelotilla es seca, añadir 75 μL de Rnasa libre, libre de ADNasa, agua estéril a cada tubo.
    15. Cuantificar el ADN resuspendido por un espectrofotómetro y luego enviarlo hacia fuera para la secuenciación del 16S rRNA gene.

5. corta la cadena del ácido graso (SCFA) detección y análisis

  1. Descongelar las muestras congeladas a 40° C por 30 min y extracto de ácidos grasos de cadena corta con éter dietílico en una relación 2:1 (v: v).
  2. Transferencia de la fase orgánica a un GC/MS (véase Tabla de materiales) equipada con una columna, de 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 μm, (véase Tabla de materiales) donde se inyecta 10 μl.
  3. Fijar la temperatura del puerto de inyección y la temperatura de la columna inicial a 260 ° C y 125 ° C respectivamente. Mantener la temperatura inicial de 1 minuto y luego aumentar a 250 ° C, más 11,5 min con una velocidad de flujo de columna de 1 mL/min.
    Nota: La temperatura MS de la fuente de iones es 220° C y 250° C para la interfaz.
  4. Cuantificar la cantidad de cada organizó usando curvas estándar y el ácido 2-methylhexanoic como estándar interno.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo de arriba describe configuración, inoculación y funcionamiento de un sistema in vitro de 5 etapas para el estudio de la microbiota intestinal del colon. Para generar los datos presentados a continuación, después de la extracción de DNA, secuenciación de ADN 16S rRNA marcador gene de la región de V1V2 se realizó mediante el alto rendimiento de secuenciación (por ejemplo,, MiSeq Illumina plataforma) por el centro del microbioma en el Hospital de niños de Philadelphia

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemas de cultivo in vitro se han desarrollado para estudiar la microbiota de la tripa del intestino grueso. Utilizan aparatos diseñados para simular las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, promoviendo el crecimiento de una comunidad microbiana intestinal madura para cada región del colon33. Aunque el concepto es lógico y comprensible, el funcionamiento real de sistemas de cultivo in vitro para el estudio de la microbiota intestinal requiere una precisión y una comprensión de ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores tienen intereses financieros que compiten. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Sra. Audrey Thomas-Gahring es reconocida por sus GC/MS trabajo. También nos gustaría agradecer a Massimo Marzorati por editar el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
TWINSHIMEProdigestNA
Medio definido (Medio de crecimiento M-SHIME adulto con almidón)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Bolsa de drenaje de orinaBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Muestra fecalOpenbiomeNA
JeringasBecton DicksonNA
Medio definidoProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinaSigma-AldrichNA
CristaleríaAce GlassNA
Mucina porcinaSigma-AldrichNA
Agar bacteriológicoSigma-AldrichNA
Bolsas de esterilizaciónVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconio de 0,1 mm Tubo batidor de perlasBenchmark ScientificNA
ARNasa, libre de ADNasa, agua estérilRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuColumna NA
Stabilwax-DA, 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 y micro; mRestekNA
portadores de mucina de plásticoProdigestNA
Libre de

Referencias

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