Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Ranjan K. Behera; Kevin D. Mlynek; Matthew S. Linz; Shaun R. Brinsmade

doi:10.3791/59055

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Artículo de método

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

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DOI:

10.3791/59055

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19 de febrero de 2019

Ranjan K. Behera¹ , Kevin D. Mlynek¹ , Matthew S. Linz¹ , Shaun R. Brinsmade¹

¹Department of Biology, Georgetown University

En este artículo

Resumen

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Resumen

Genes de virulencia bacteriana a menudo están regulados a nivel transcripcional por múltiples factores que responden a señales ambientales diferentes. Algunos factores que actúan directamente sobre los genes de virulencia; otros controlan patogenesia ajustando la expresión de los reguladores de aguas abajo o la acumulación de señales que afectan la actividad de regulador. Mientras que el Reglamento ha sido estudiado ampliamente durante el crecimiento en vitro , relativamente poco se sabe sobre cómo se ajusta la expresión génica durante la infección. Dicha información es importante cuando el producto de un gen particular es un candidato para la intervención terapéutica. Enfoques transcripcionales como RT-PCR cuantitativa en tiempo real, y RNA-Seq son poderosas formas de examinar la expresión génica a nivel global pero sufren muchos problemas técnicos incluyendo la baja abundancia de RNA bacteriana en comparación con el RNA del anfitrión y muestra degradación por RNasas. Evaluación de regulación utilizando reporteros fluorescentes es relativamente fácil y puede ser multiplexado con proteínas fluorescentes con propiedades espectrales únicas. El método permite el análisis unicelular, espacio-temporal de la expresión génica en los tejidos que presentan complejas tridimensionales gradientes arquitectura y fisicoquímicos que afectan redes de regulación bacterianas. Dicha información se pierde cuando se calcula el promedio de los datos sobre la población a granel. Adjunto, describimos un método para cuantificar la expresión génica en bacterias patógenas in situ. El método se basa en el procesamiento de tejido simple y directa observación de la fluorescencia de proteínas de reportero. Demostramos la utilidad de este sistema mediante el examen de la expresión de la thermonuclease de Staphylococcus aureus (nuc), cuyo producto del gene es necesario para la evasión inmune y la virulencia completo ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp se expresa fuertemente en abscesos renales y revelar expresión génica heterogénea debido en parte a la aparente regulación espacial de la actividad de promotor de nuc en abscesos comprometidos plenamente con la respuesta inmune. El método puede aplicarse a cualquier bacteria con un sistema de genético manipulable y cualquier modelo de la infección, proporcionando información valiosa para los estudios preclínicos y desarrollo de fármacos.

Introducción

Las bacterias responden a cambiar condiciones fisiológicas y las alteraciones en el estado nutricional de su entorno expresando diferencialmente genes necesarios para la adaptación y supervivencia. Por ejemplo, patógenos oportunistas colonizan cuerpo superficies en relativamente bajas densidades y suelen ser inofensivos. Sin embargo, una vez que la bacteria ha penetrado las barreras físicas y químicas, deben lidiar con el anfitrión célula inmune contra defensas y restringida la disponibilidad de nutrientes¹. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente un tercio de la población de forma asintomática pero también es la ca....