Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Resumen

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Resumen

La modificación posttranslacional de las proteínas por la pequeña proteína ubiquitina está involucrada en muchos eventos celulares. Después de la digestión tripptica de proteínas ubiquitinadas, se pueden utilizar péptidos con un remanente diglycine conjugado con el grupo de aminoácidos de épsilon ('K-o-diglycine' o simplemente 'diGly') para rastrear el sitio de modificación original. La inmunopurificación eficiente de péptidos diGly combinados con la detección sensible por espectrometría de masas ha dado lugar a un enorme aumento en el número de sitios de ubiquitinación identificados hasta la fecha. Hemos realizado varias mejoras en este flujo de trabajo, incluyendo el fraccionamiento de fase inversa de pH alto fuera de línea de péptidos antes del procedimiento de enriquecimiento, y la inclusión de ajustes de fragmentación de péptidos más avanzados en el multipolo de enrutamiento iónico. Además, una limpieza más eficiente de la muestra utilizando un tapón basado en filtros para retener las perlas de anticuerpos da como resultado una mayor especificidad para los péptidos diglily. Estas mejoras resultan en la detección rutinaria de más de 23.000 péptidos diGly de células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) las células se lisia al inhibir el proteasoma en la célula. Mostramos la eficacia de esta estrategia para el análisis en profundidad de los perfiles ubiquitinome de varios tipos celulares diferentes y de muestras in vivo, como el tejido cerebral. Este estudio presenta una adición original a la caja de herramientas para el análisis de ubiquitinación de proteínas para descubrir el ubiquitinomo celular profundo.

Introducción

La conjugación de ubiquitina a las proteínas las marca para la degradación por el proteosoma y es un proceso crucial en la proteostasis. El grupo carboxilo C-terminal de ubiquitina forma un enlace isopéptido con el grupo de lisina-amino de la proteína objetivo^1,2. Además, la ubiquitina se puede unir a otros módulos de ubiquitina, lo que resulta en la formación de estructuras homogéneas (es decir, K48 o K11) o ramificadas (es decir, heterogéneas o mixtas) de poliubiquitina^1,3. La función más conocida de la ubiquitina es su papel en la degradación protea....

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (EDC) de Erasmus MC.

1. Preparación de la muestra

1. Células cultivadas
   1. Seleccione una línea de interés celular (por ejemplo, células HeLa u osteosarcoma [U2OS]) y haga crecer las células en el medio mínimo de águila (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de calor en suero bovino fetal activado (FBS) y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina.
   2. Para experimentos proteómicos cuantitativos, células de cultivo en DMEM carecen de arginina y lisina. El medio debe complementarse con suero bovino fetal (FBS) 1....

Resultados

Las proteínas ubiquitinadas dejan un remanente de 114.04 Da diglycine en el residuo de lisina diana cuando las proteínas se digieren con trippsina. La diferencia de masa causada por este motivo se utilizó para reconocer inequívocamente el sitio de la ubiquitinación en un experimento de espectrometría de masas. La estrategia que describimos aquí es un método de vanguardia para el enriquecimiento y la posterior identificación de péptidos digly por nanoflujo LC-MS/MS(Fig.......

Discusión

El protocolo descrito aquí se aplicó a muestras de diversas fuentes biológicas, como células cultivadas y tejido in vivo. En todos los casos identificamos miles de péptidos digly, siempre que la cantidad total de entrada de proteína sin al menos 1 mg. El enriquecimiento con anticuerpos específicos es altamente eficiente, dado que sólo a lo sumo se identificaron 100-150 péptidos digly muy bajos y abundantes a partir de lisatos de células enteras si no se aplicaron procedimientos de enriquecimiento para proteínas ubiquitin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,4-Ditioeritritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Discos de octadecilo	Supelco	66883-U	producto descontinuado en Supelco; CDS Analytical es el nuevo fabricante (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Formiato de amonio	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resina, 3.5 μ m, 130 y Aring;	Aguas
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F tapón de filtro	Whatman	1825-021
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	I6125
Lisina, Arginina	Sigma-Aldrich
Lisina-8 (13C6; 15N2), Arginina-10 (13C6; 15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidasa (LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
Horno	NanoLC Diseño MPI, MS Wil GmbH
N-Lauroilsarcosina sal sódica	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Espectrómetro de masas Lumos	ThermoFisher
Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 å, 50 µ m) partículas poliméricas de fase reversa	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartucho	Waters	WAT036790	Retire el material tC18 del cartucho antes de llenar el cartucho con PLRP-S
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsina, tratado con TPCK	ThermoFisher	20233