Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Resumen

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Resumen

Los macrófagos alveolares (AMs) guardan el espacio alveolar del pulmón. Fagocitosis por AMs juega un papel fundamental en la defensa contra los invasores patógenos, la eliminación de células muertas o partículas extrañas y en la resolución de las respuestas inflamatorias y la remodelación tisular, procesos que son mediados por receptores distintos de la superficie de las AMs. Aquí, Divulgamos los métodos para el análisis de la función fagocítica de AMs usando estrategias experimentales y ensayos in vitro e in vivo para diferenciar entre el receptor de reconocimiento patrón-, receptor de complemento- y Fc gamma mediada por receptor fagocitosis. Finalmente, se discute un método para establecer y caracterizar un modelo de neumonía de p. aeruginosa en ratones para evaluar in vivo la eliminación bacteriana. Estos ensayos representan los métodos más comunes para evaluar las funciones de AM y también pueden utilizarse para estudiar la función de macrófagos y de remoción bacteriana en otros órganos.

Introducción

AMs son los principales fagocitos residente en los alvéolos en la etapa de descansa y uno de los principales actores de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento y la internalización de patógenos inhalados y partículas^1,2. Se ha reportado que AMs son esencial para la separación rápida de muchos patógenos pulmonares, como p. aeruginosa y Klebsiella pneumoniae^3,4, por lo que una deficiencia en la fagocitosis de AM con frecuencia resulta en respiratorias infecciones, como neumonía aguda, que causan mayores tasas de mortalida....

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescente granos fagocitosis

1. Eutanasia el ratón (C57BL/6J, 6 semanas de edad, mujer) por CO₂ asfixia según protocolos IACUC para la eutanasia ética de los animales.
2. Coloque el ratón pique en una tabla de disección cubierta con toallas de papel. Precisar sus patas con sus extremidades spread-eagle y enganchar una cadena bajo sus dientes delanteros tirando su cabeza hacia atrás para que la tráquea quede recto y nivel.
3. Mojar la garganta, pecho y vientre con etanol al 70% p....

Resultados

Primero realizamos el experimento para analizar fagocitosis por ratón AMs primarias. A lo largo de todos los análisis, se compararon las AMs aislados de ratones^KO de WT y TRIM72. Como se muestra en la figura 1A, microscopía de fluorescencia reveló la fagocitosis de FITC-abalorios por ratón AMs primarias ocurre después de 1 h de incubación. Figura 1 B muestra el análisis de la fagocitos.......

Discusión

Al realizar una función de intercambio de gas, el pulmón persistente se enfrenta a alérgenos, agentes patógenos y partículas extrañas. AMs proporcionan la primera línea de defensa en virtud de su función principal, es decir, fagocitosis. AMs también coordinar con otras células a destruir los patógenos y en la resolución de la inflamación. Aquí, hemos descrito los métodos para evaluar específicamente la fagocitosis por AMs aislada del pulmón del ratón. El protocolo presentado en este manuscrito, explica un estudio detalla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja 18-G	Nipro Medical	CI+1832-2C	Biología Molecular grado
2,7-diaminofluoreno (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Biología Molecular grado
70% Etanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Grado analítico
Placa de 96 pocillos	Corning	3603	Grado de biología celular
Tampón de lisis ACK	Life Technologies	A10492	Grado de biología molecular
Alexa fluor-488 Zymosan-A-biopartícula	Thermofisher Scientific	Z23373	Biología molecular grado
C5 suero deficiente	Sigma-Aldrich	C1163	Reactivo bioquímico
Centrífuga	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Citocentrífuga	Thermofisher Scientific A78300101	Número 11
DMEM Medios de cultivo celular	Gibco	11995-065	Grado de biología celular
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grado de biología celular
Flujo Citómetro	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinzas	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adecuado para la disección de animales de laboratorio
Perlas de látex carboxilado FITC	Sigma-Aldrich	L4530	Grado de biología celular
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Adecuado para  ensayos de infección celular
Plato con fondo de vidrio	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C
Jeringa de alta presión de	Penn-Century	FMJ-250	Adecuado para uso en animales de laboratorio
Homogeneizador	Omni International	TH-01
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich	H1009
Microscopio de fluorescencia invertida de	Olympus	IX73
Ketamina Clorhidrato	Hospira	CA-2904	Grado farmacéutico
Shandon Kwik-Diff Tinciones	Thermofisher Scientific	9990700	Grado de Biología Celular
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Grado de Biología Molecular
LB	Caldo Fisher Scientific	BP1427	Grado de Biología Molecular
MicroSprayer Aerosolizador Penn-Century	IA-1C		Adecuado para uso en animales
de laboratorio Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Grado reactivo
PBS	Gibco	20012-027	Grado de biología celular
conejo anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Adecuado para inmunoensayos
de conejo anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Adecuado para inmunoensayos
Tijeras	Miltex	5-2	Adecuado para la disección de animales de laboratorio
Laringoscopio para animales	Penn-Century	LS-2	Adecuado para uso en animales de laboratorio
Dodecil Sulfato de sodio (SDS)	BioRad	1610301	Grado analítico
Tijeras de resorte (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Adecuado para la disección de animales
de laboratorio Tijeras de resorte (pequeñas)	Fine Science Tools	91500-09	Adecuado para la disección de animales de laboratorio
ovejas (SRBC)	MP Biomedicals	55876	SRBCs lavados y conservados
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Biología Molecular grado
Xilacina	Akorn Animal Health	59399-110-20	Grado farmacéutico

grado de biología celular grado analítico pequeños , glóbulos rojos de