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Artículo de método

Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

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DOI:

10.3791/59094

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9 de febrero de 2019

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1Department of Chemical Engineering, Biotechnology and Environmental Technology, University of Southern Denmark, 2Center for Single Particle Science and Engineering (SPSE), Institute for Molecular Medicine, Health Sciences, University of Southern Denmark, 3Department of Mechanical Engineering and Material Science, Duke University, 4School of Pharmacy, University of Nottingham

En este artículo

Resumen

Este artículo describe la encapsulación de falcarindiol en revestimiento lípido 74 nm nanopartículas. La absorción celular de las nanopartículas por las células de vástago humanas en gotitas del lípido es supervisada por la proyección de imagen confocal y fluorescente. Nanopartículas se fabrican por el método de la inyección rápida de cambio de disolvente, y su tamaño se mide con la técnica de dispersión de luz dinámica.

Resumen

Las nanopartículas son el foco de un creciente interés en sistemas de entrega de medicamentos para la terapia del cáncer. Nanopartículas recubiertas de lípidos están inspiradas en la estructura y tamaño de lipoproteínas de baja densidad (LDLs) porque las células cancerosas tienen una mayor necesidad de colesterol proliferar, y esto ha sido explotado como un mecanismo para la entrega de medicamentos contra el cáncer para cáncer células. Por otra parte, dependiendo de la química de la droga, encapsulando la droga puede ser ventajoso para evitar la degradación de la droga durante la circulación en vivo. Por lo tanto, en este estudio, este diseño se utiliza para fabricar nanopartículas recubiertas de lípidos de la droga anticáncer falcarindiol, proporcionando un potencial nuevo sistema de falcarindiol para estabilizar su estructura química contra la degradación y mejorar su absorción por los tumores. Falcarindiol nanopartículas, con una monocapa de fosfolípidos y colesterol encapsulando la base droga purificada de la partícula, fueron diseñadas. El recubrimiento de la monocapa de lípidos consiste en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterol (col) y 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) junto con el fluorescente etiqueta de DiI (relaciones molares de 43:50:5:2). Las nanopartículas son fabricadas mediante el método de la inyección rápida, que es una técnica rápida y sencilla para precipitar las nanopartículas por buen solvente para intercambio anti-solvente. Consiste en una inyección rápida de una solución de etanol que contiene los componentes de nanopartículas en una fase acuosa. El tamaño de las nanopartículas fluorescentes se mide con dispersión ligera dinámica (DLS) en 74,1 ± 6.7 nm. La absorción de las nanopartículas se prueba en humanos las células madre mesenquimales (hMSCs) y reflejada usando fluorescencia y microscopía confocal. La absorción de las nanopartículas se observa en hMSCs, sugiriendo la posibilidad de que un fármaco estable entrega sistema de falcarindiol.

Introducción

Las nanopartículas recubiertas de lípidos están viendo un mayor interés en cuanto a su función como sistemas de entrega de fármacos para el cáncer la terapia1. Tipos de cáncer tienen una reprogramación metabólica de lípidos alterado2 y una necesidad creciente de colesterol proliferar3. Que sobreexpresan LDLs1 y toman en LDLs más que las células normales, en la medida en que cuenta de LDL de un paciente de cáncer incluso puede bajar4. Captación de LDL promueve fenotipos agresivos5 dando por resultado la proliferación e invasión en cáncer de mama6. Una abundancia de receptores de LDL (LDLRs) es un indicador pronóstico de potencial metastásico7. Inspirado por el LDL y su absorción por las células de cáncer, una nueva estrategia ha sido llamada: hacer la droga como alimento del cáncer8. Así, estos nuevas nanopartículas droga entrega diseños8,9,10 se han inspirado en el diseño base y estabilizado de lípido de las LDLs natural11 como un mecanismo para la entrega de medicamentos contra el cáncer a las células cancerosas. Este pasivo a sistema soporta encapsulamiento de, especialmente, fármacos hidrofóbicos, que generalmente se dan en forma de dosificación oral pero proporcionan sólo una pequeña cantidad de la droga a la circulación sanguínea, limitando así su eficacia esperada12. Que con los liposomas stealth13, una capa de polietilenglicol (PEG) ayuda a reducir cualquier respuesta inmunológica y extiende la circulación en el torrente sanguíneo para la absorción óptima del tumor por la supuesta mayor penetración y efecto de retención (EPR) 14 , 15. sin embargo, además de, en algunos casos, la inestabilidad en la circulación y distribución indeseable en el sistema16, algunos obstáculos siguen siendo sin resolver, como cómo y en qué medida dichas nanopartículas se toman en las células y lo que es su destino intracelular. Es aquí que este trabajo aborda la incorporación de nanopartículas de un medicamento contra el cáncer hidrofóbico falcarindiol, usando confocal y epifluorescencia técnicas de imagen.

El objetivo del estudio es fabricar nanopartículas recubiertas de lípidos de falcarindiol y estudiar su absorción intracelular de hMSCs. De tal modo, potencialmente estabilizar su administración, superar los retos asociados con la entrega y mejora la biodisponibilidad. Así la evaluación de un nuevo sistema de entrega de este medicamento contra el cáncer. Previamente, falcarindiol ha sido administrados oral a través de una alta concentración purificada falcarindiol como un suplemento de alimentos17. Sin embargo, hay necesidad de un enfoque más estructurado ofrecer esta droga prometedora. Por lo tanto, falcarindiol nanopartículas, fosfolípidos y colesterol encapsulando monocapa con la droga purificada que constituye el núcleo de la partícula, fueron diseñadas. El método de inyección rápida del solvente cambiando, recientemente desarrollado por Needham et al. 8, se utiliza en este estudio para encapsular el falcarindiol polyacetylene.

El método se ha utilizado anteriormente para la fabricación de nanopartículas lipídicas para encapsular diagnóstico proyección de imagen agentes18,19, así como probar drogas (orlistat, estearato de Niclosamida) y moléculas (triolein)27 8 ,27,28. Es una técnica relativamente sencilla cuando se lleva a cabo con las moléculas del derecho. Forma partículas de combinar, en el límite de su carga crítica (~ 20 nm de diámetro) de altamente insolubles hidrofóbicos solutos disueltos en un disolvente polar. El intercambio de solvente es logrado por una rápida inyección de la solución orgánica en exceso de antisolvent (generalmente, una fase acuosa en un 1:9 orgánica: cociente del volumen acuoso)20,21.

El diseño compositivo de las nanopartículas dan lugar a múltiples ventajas. Los componentes de DSPC:Chol proporcionan una monocapa muy apretada, casi impermeable, biocompatible y biodegradable. La clavija proporciona una interfaz sterically estabilizador que actúa como un escudo de opsonización por el sistema inmunológico, frenar cualquier absorción por el sistema reticuloendotelial (hígado y bazo) y protección contra el sistema de fagocitos mononucleares, evitando sus retención y degradación por el sistema inmune y por lo tanto, aumenta su circulación en sangre22medio tiempo. Esto permite que las partículas que circulan hasta que extravasate en sitios enfermos, tales como tumores, donde el sistema vascular está agujereado, permitiendo el efecto EPR dar lugar a acumulación pasiva de las partículas. Además, la capa de lípidos permite un mejor control sobre el tamaño de las nanopartículas cinéticamente atrapando el núcleo en su núcleo fundamental dimensión27,28. Los lípidos inducen varias propiedades de superficie (incluyendo el péptido a, que aún no estaba disponible para este proyecto), un núcleo de fármaco puro y una baja polidispersidad22,27,28. El método utilizado para el análisis granulométrico es DLS, una técnica que permite a los investigadores medir el tamaño de un gran número de partículas al mismo tiempo. Sin embargo, este método puede sesgar las mediciones a los tamaños más grandes, si las nanopartículas no son generación23. Este problema es evaluado con la capa de lípidos así. Más detalles de estos diseños fundamentales y la cuantificación de todas las características se dan en otras publicaciones27,28.

La droga encapsulada en las nanopartículas es falcarindiol, un polyacetylene dietético encontrado en las plantas de la familia Apiaceae. Es un metabolito secundario alifático C17poliacetilenos del tipo de que se ha encontrado para mostrar efectos de promoción de la salud, incluyendo actividad antiinflamatoria, efectos antibacterianos y citotoxicidad contra una amplia gama de líneas celulares de cáncer. Su alta reactividad se relaciona con su capacidad para interactuar con diferentes biomoléculas, actuando como un agente alquilante muy reactivo contra mercapto y grupos amino24. Falcarindiol previamente se ha demostrado para reducir el número de lesiones neoplásicas en la colon17,25, aunque los mecanismos biológicos son todavía desconocidos. Sin embargo, es pensamiento que interactúa con biomoléculas como el NF-κB, COX1, COX-2, y citocinas, inhibiendo sus progresión y la célula proliferación procesos tumorales, llevando a la detención del ciclo celular, retículo endoplásmico (ER) estrés y apoptosis 17,26 en células de cáncer. Falcarindiol es utilizado en este estudio como medicamento contra un ejemplo debido a su potencial contra el cáncer y el mecanismo se están estudiando actualmente, y porque muestra efectos prometedores contra el cáncer. La absorción celular de las nanopartículas es probada en hMSCs y reflejada usando epifluorescencia y microscopía confocal. Este tipo de célula fue elegido debido a su gran tamaño, lo que es ideal para microscopía.

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Protocolo

1. síntesis por solvente rápido desplazamiento técnica

  1. Establecer lo siguiente para la preparación de las nanopartículas: un concentrador calentador/muestra de bloque, un desecador, un sistema de distribución digital con una jeringa de vidrio de 1 mL, un frasco de vidrio de 12 mL, un agitador magnético, una pulga magnético (15 mm x 4,5 mm, en una forma cilíndrica con capa de politetrafluoroetileno [PTFE]) dentro del frasco de cristal y un evaporador rotatorio.
  2. Distribuir 2,4 mL de 250 μm falcarindiol caldo disuelto en una mezcla agua 70% EtOH en un vial de centelleo.
  3. Evaporar la fracción líquida, con el concentrador de la muestra durante aproximadamente 4 horas, para obtener falcarindiol seco.
    1. Introducir el frasco centelleo en el calentador del bloque; el concentrador de la muestra entrega gas sobre la muestra utilizando una aguja de acero inoxidable, concentrar la muestra. Se evaporan a temperatura ambiente; No utilice calor.
  4. Una vez seco, agregar los siguientes componentes de la capa de lípidos en el vial de centelleo mencionado: 16,3 μl de 31,64 mM DSPC cloroformo solución 3.4 μL de solución stock de cloroformo 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 μl del stock de cloroformo colesterol 25 mM solución y 6 μl de 4 mM DiI solución cloroformo. Limpie la jeringa con cloroformo después de agregar cada componente para evitar la contaminación cruzada.
    Atención: Inmediatamente cerrar los frascos que contienen los lípidos para que el solvente no se evaporan y, por lo tanto, modificar la concentración. Trabajar en una campana de humos.
    Nota: Las concentraciones de las soluciones madre cloroformo pueden variar, dependiendo del proveedor de productos químicos o las diluciones hechas en el laboratorio.
  5. Envolver el frasco con papel de aluminio para proteger DiI de la luz. Dejar la muestra durante la noche en el desecador para evaporar el cloroformo.
  6. Disolver la muestra desecada en etanol absoluto hasta un volumen final de 1,2 mL, que da concentraciones finales de DSPC DSPE PEG 2000, colesterol y DiI de 0,43 mM, 0.05 mM, 0,5 mM y 0.02 mM, respectivamente. Esta solución representa la fase orgánica.
  7. Tomar el frasco de vidrio de 12 mL, llenar con 9 mL de agua purificada y agregue la pulga magnética en el vial que contiene 9 mL de agua. Mantener el frasco en el agitador magnético, agitación a 500 rpm (figura 1).
  8. Conecte la jeringa de vidrio de 1 mL para el sistema de aplicación y limpieza con cloroformo para evitar cualquier contaminación. Esto, poco a poco tirando el cloroformo en la jeringa de vidrio y distribución manualmente en un recolector por lo menos 10 tiems.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
  9. Preparar la jeringa con etanol. Cebado reemplaza el viejo solvente, así como elimina burbujas de aire.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
  10. Usando la jeringa, aspirar 1 mL de la fase orgánica.
  11. Inserte la jeringa en el frasco de cristal, hasta el centro de la marca de 9 mL de agua y mantener estable en el frasco (como se muestra en la figura 1).
  12. Inyectar la solución a la velocidad seleccionada de la inyección (μL/s 833) pulsando el botón de descarga en el sistema de dispensación (figura 2). Esto genera 10 mL de 50 μm recubiertos de lípidos nanopartículas de falcarindiol en agua que contienen el etanol al 10%.
    Nota: Esta velocidad de inyección se ha encontrado para lograr las partículas más finas, obteniendo una distribución de tamaño de partícula estrecha. Es fundamental para que la jeringa esté en el centro, la constante y la recta al dispensar la solución.
  13. Inmediatamente después de la inyección, sacar la cubeta de agitador y transferir la muestra a un matraz de fondo redondo de 50 mL (FBR).
  14. Coloque el RBF en el rotavapor y evaporar a 1 mL de solvente orgánico, mediante el evaporador rotatorio a temperatura ambiente. Evitar la formación de burbujas.
    Nota: Este paso llevará ~ 5 min.
  15. Transferir la suspensión de nanopartículas de la RBF a otro frasco de vidrio de 12 mL. Asegúrese de que el volumen es de 9 mL. Dividir la muestra en dos frascos de vidrio de 12 mL (puesto 4,5 mL en cada uno).
  16. Agregar 0,5 mL de agua ultrapura y uno de los viales de 0,5 mL de 10 x tampón fosfato salino (PBS) al otro frasco. Tomar 1 ml de cada muestra para la medición de tamaño de partícula.

2. análisis granulométrico utilizando la técnica DLS

Nota: Medidas del tamaño se llevaron a cabo utilizando un analizador DLS que determina la distribución de tamaño de partícula. Está equipado con laser 100 mW que opera en una longitud de onda de 662.2 nm y con un detector de fotodiodo de avalancha en un ángulo de 90° para el ángulo de incidencia. El haz es dispersado por las nanopartículas y detectado por el fotodetector.

  1. Encienda el instrumento DLS y fijar la temperatura deseada a 20 ° C, hasta que se estabilice.
  2. Configurar los parámetros del instrumento como sigue: tiempo de la adquisición de datos = 4 s, el número de adquisiciones = 30, función de atenuación automática = y los límites de tiempo auto-atenuación = 0.
  3. Llene la cubeta de plástico con 1 mL de la suspensión de nanopartículas y comenzar la medición.
  4. Informe el tamaño medido según el solvente utilizado (agua o PBS).
    Nota: La medición en PBS se realiza para tener una idea aproximada del tamaño de las células en el medio en el tratamiento de las células. El tratamiento celular se hará con las nanopartículas disueltas en agua.
  5. Repita las mediciones 24 h después de la síntesis, para verificar la agregación de las partículas.

3. tratamiento

  1. Crece hMSCs medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina, en una cámara humified a 37° C con 5% CO2.
    PRECAUCIÓN: El trabajo en la campana de Flujo Laminar estéril para los pasos 3.1, 3.2 y 3.3.
  2. Las células de la semilla aproximadamente 50.000 para obtener una densidad celular de aproximadamente 30% previamente esterilizado como absoluto EtOH #1.5 cubreobjetos colocan en placas de 6 pocillos. Añadir MEM para tener un volumen final de 3 mL en cada pozo. Incubar durante 24 h en las mismas condiciones que en el paso 3.1. Las células 24 h antes del tratamiento de la semilla.
    Nota: Es crítico de que las células se siembran por lo menos 24 h antes del tratamiento de nanopartículas, para asegurarse de que las células están en una confluencia adecuada.
  3. Sin quitar el medio, agregar 3 μl de la solución de nanopartículas, para una concentración final falcarindiol de 5 μm. Incubar durante 24 h en las mismas condiciones que en el paso 3.1.
    Nota: Preparación de las nanopartículas se llevó a cabo en el día del tratamiento celular, para evitar la agregación de las partículas.
  4. Posteriormente, después de 24 h de tratamiento, lave las células 2 x con PBS, fijar en formaldehído al 4% por 10 min a temperatura ambiente y almacenarlas en PBS a 4° C por hasta varios meses hasta que la imagen.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
    1. Como alternativa, después de la fijación, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción nuclear se puede realizar. Para ello, después de fijar las células, permeabilizarlos con 0,1% Tritón X-100 durante 30 minutos, lavar x 2 con PBS y mancha con 250 μl de 300 nM DAPI durante 5 minutos protegido de la luz.

4. microscopía

  1. Microscopía de fluorescencia
    1. Usar un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara CCD multiplicada electrón para adquirir imágenes. Utilice el 150 x objetivo de aceite NA 1.45 y el canal del GFP LP.
  2. Microscopía confocal
    1. Adquisición de imágenes de microscopía confocal, con 63 x NA 1.4 objetivo de aceite, un láser de argón (514 nm) DiI, y un láser de dos fotones (780 nm) para DAPI, para verificar la absorción de las nanopartículas en las células.

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Resultados

Dos diferentes tipos de nanopartículas fueron fabricado, es decir, puro falcarindiol nanopartículas y nanopartículas recubiertas de lípidos falcarindiol. Se probaron diferentes concentraciones de lípidos y colesterol. Como se muestra en la tabla 1, las nanopartículas sin recubrimiento formado en el agua y mide en PBS tenían un diámetro de 71 ± 20.3 nm con un índice de polidispersidad (PDI) de 0.571. Estos parámetros fueron medidos en un analizador de DLS. Las nanopartícul...

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Discusión

Un protocolo detallado para la fabricación de nanopartículas recubiertas de lípidos para el suministro de medicamentos con el simple, método rápido, reproducible y escalable de inyección rápida de cambio solvente seguido27,28 y se presenta en este trabajo, como aplica a falcarindiol. Controlando la velocidad de la inyección de la fase orgánica fase acuosa y mediante el uso de lípidos de la capa en las concentraciones adecuadas para cubrir el núcleo falcarindiol, ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Dr. Moustapha Kassem (Hospital de la Universidad de Odense, Dinamarca) de las células madre mesenquimales humanas. Los autores agradecen el centro médico de Bioimagen danés para el acceso a sus microscopios. Los autores agradecen las Carlsberg y Villum fundaciones para apoyo financiero (E.A.C.). Los autores reconocen el apoyo financiero proporcionado por el Premio Cátedra de Niels Bohr de la Fundación de investigación nacional danés.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vial de rosca de 12 mL (vidrio transparente, rosca 15-425, 66 x 18,5 mm)Microlab Aarhus A/SML 33154LP
Placas de 6 pocillosGreiner Bio One International GmbH657160
Etanol absolutoEMD Millipore (VWR)EM8.18760.1000
CloroformoRathburn Chemicals Ltd.RH1009
ColesterolAvanti Lípidos Polares, Inc.700000P
Microscopio ConfocalZeiss LSM510
Cubreobjetos espesor #1.5Paul Marienfeld GmbH & Co117650
DesecadorDiI
D282
DLSBeckman CoulterDelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Stock de cloroformo)Avanti Polar Lipids, Inc.850365C 
DSPE PEG 2000 (Stock de cloroformo)Avanti Polar Lipids, Inc.880120C
eVol XRSGE ciencia analítica, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.2910200
Suero fetal bovinoGibco10270-106
miccroscopio de fluorescenciaOlymous IX81con TIRF manual e incubadora Andor iXon EMCCD
Panasonic MCO-18AC
Pulgas magnéticas VWRChemicals15 x 4,5 mmForma cilíndrica con recubrimiento de PTFE
Agitador magnéticoIKART-10
Medios esenciales mínimosGibco32561-029
Comprimidos PBS para cultivo celularVWR Chemicals97062-732
Pluma/estreptococoVWR Chemicals97063-708
Tampón de fosfato salino (PBS, pH 7.4)Thermo Fisher10010031
Evaporador rotativoRotavapor, Bü chi Labortechnik AGR-210
Concentrador de muestras Stuart, Compañía de Instrumentos Cole-Parmer, LLCSBHCONC/1
Invitrogen de fabricación propia

Referencias

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