Artículo de método

Visualización fluorescente de ARN etiquetado con Mango en geles de poliacrilamida a través de un método de postmancha

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 de junio de 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un método de tinción post-gel sensible, rápido y discriminatorio para la imagen de ARN etiquetados con aptámeros de mango de ARN I, II, III o IV, utilizando geles de electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) nativos o desnaturalizantes. Después de ejecutar geles PAGE estándar, el ARN con etiqueta Mango se puede teñir fácilmente con TO1-Biotin y luego analizarse utilizando lectores de fluorescencia comúnmente disponibles.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los geles nativos y desnaturalizantes de poliacrilamida se utilizan habitualmente para caracterizar la movilidad compleja de ribonucleoproteína (RNP) y medir el tamaño del ARN, respectivamente. Como muchas técnicas de imágenes de gel utilizan manchas inespecíficas o sondas de fluoróforo costosas, son altamente deseables metodologías sensibles, discriminatorias y económicas de imágenes de gel. Las secuencias de núcleo de Mango de ARN son pequeños motivos de secuencia (19-22 nt) que, cuando están cerrados por un tallo de ARN arbitrario, pueden ser simplemente y baratos anexados a un ARN de interés. Estas etiquetas de Mango se unen con alta afinidad y especificidad a un ligando de fluoróforo tiazol-naranja llamado TO1-Biotina, que se vuelve miles de veces más fluorescente al encuadernar. Aquí mostramos que Mango I, II, III y IV se puede utilizar para crear imágenes específicas de ARN en geles con alta sensibilidad. Tan solo 62,5 fmol de ARN en geles nativos y 125 fmol de ARN en geles desnaturalizantes se pueden detectar empapando geles en un tampón de imágenes que contiene potasio y 20 nM TO1-Biotina durante 30 min. Demostramos la especificidad del sistema etiquetado con Mango mediante la toma de imágenes de un ARN bacteriano 6S con etiqueta de Mango en el contexto de una mezcla compleja de ARN bacteriano total.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mango es un sistema de etiquetado de ARN que consiste en un conjunto de cuatro pequeños aptámeros fluorescentes de ARN que se unen firmemente (unión nanomolar) a derivados simples del tiazol-naranja (TO1-Biotina, Figura 1A)1,2,3 . Tras la unión, la fluorescencia de este ligando se incrementa de 1.000 a 4.000 veces dependiendo del aptámero específico. El alto brillo del sistema Mango, que para Mango III supera al de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), combinada con la afinidad de unión nanomolar de los aptámeros de mango de ARN, permite su uso tanto en la imagen como en la purificación del ARN complejos2,4.

Las estructuras de rayosX de Mango I 5, II6y III7 se han determinado a alta resolución, y los tres aptámeros utilizan un ARN cuádruplex para unir TO1-Biotina (Figura1B–D). Los núcleos compactos de los tres aptámeros están aislados de la secuencia de ARN externa a través de motivos de adaptador compactos. Mango I y II utilizan un adaptador de bucle flexible similar a GNRA para conectar sus núcleos de mango a un dúplex de ARN arbitrario (Figura1B,C). Por el contrario, Mango III utiliza un motivo rígido triplex para conectar su núcleo a una hélice de ARN arbitraria (Figura1D,residuos púrpuras), mientras que la estructura de Mango IV no se conoce actualmente. Como el núcleo de unión de ligandos de cada uno de estos aptámeros está separado de la secuencia de ARN externa por estos adaptadores helicoidales, parece probable que todos puedan ser simplemente incorporados en una variedad de ARN. El ARN regulador 6S bacteriano (Mango I), componentes del espliceosoma de levadura (Mango I), y el ARN 5S humano, ARN U6, y un escalonado C/D (Mango II y IV) han sido etiquetados con éxito en esta moda2,8, lo que sugiere que muchos LOS ARN biológicos se pueden etiquetar utilizando el sistema aptamer de ARN Mango.

Los geles nativos y desnaturalizantes se utilizan comúnmente para estudiar los ARN. Los geles dedesnaturalización se utilizan a menudo para juzgar el tamaño del ARN o el procesamiento de ARN, pero normalmente, en el caso de una mancha del norte, por ejemplo, requieren varios pasos lentos y secuenciales para generar una imagen. Mientras que otros aptámeros fluorogénicos de ARN, como el ARN Spinach y el Brócoli, se han utilizado con éxito para imágenes en gel9,ningún sistema de aptámeros fluorogénicos hasta la fecha posee el alto brillo y la afinidad del sistema Mango, por lo que es de considerable interés para investigar las habilidades de rayos de gel de Mango. En este estudio, nos preguntamos si el sistema de mango de ARN podría simplemente extenderse a las imágenes de gel, ya que las longitudes de onda de excitación y emisión de TO1-Biotina (510 nm y 535 nm, respectivamente) son apropiadas para la toma de imágenes en el canal eGFP común a la mayoría de los fluorescentes instrumentación de escanado en gel.

El protocolo de tinción post-gel presentado aquí proporciona una manera rápida de detectar específicamente moléculas de ARN etiquetadas con Mango en geles de electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) nativos y desnaturalizantes. Este método de tinción consiste en remojar geles en un tampón que contiene potasio y TO1-Biotina. Los aptámeros de mango de ARN son basados en G-quadruplex y se requiere potasio para estabilizar dichas estructuras. Utilizando el ARN transcrito a partir de plantillas mínimas de ADN de codificación de Mango (ver la sección de protocolo), simplemente podemos detectar tan poco como 62.5 fmol de ARN en geles nativos y 125 fmol de ARN en geles desnaturalizantes, utilizando un protocolo de tinción directa. A diferencia de las manchas comunes de ácido nucleico no específico (ver Tabla de Materiales,referida a SG a partir de aquí), podemos identificar claramente el ARN etiquetado con Mango incluso cuando hay altas concentraciones de ARN total sin etiquetar en la muestra.

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Protocolo

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1. Preparación de los reactivos

  1. To1-Solución de postmancha de biotina (solución de tinción de gel)
    1. Hacer 1 L de tampón de fosfato de 1 M a pH 7,2 a 25 oC añadiendo 342 ml de 1 M de Na2HPO4 y 158 ml de 1 M NaH2PO4. Ajuste el pH a 7,2 a 50 mM añadiendo la solución de fosfato adecuada. Filtro estéril con un filtro de 0,2 m y almacene la solución en plásticos a temperatura ambiente.
    2. Prepare la solución de tinción de gel 5x (sin TO1-Biotina) de la siguiente manera. Componer una solución de 1 L mezclando 247,5 ml de ddH2O, 700 ml de 1 M KCl, 50 ml de tampón de fosfato de 1 M (pH 7,2) y 2,5 ml de Tween 20. Filtro estéril con un filtro de 0,2 m y almacene la solución en plástico. Se puede almacenar a temperatura ambiente.
      NOTA: MgCl2 se puede añadir a esta solución si es necesario, ya que potencialmente puede estabilizar los complejos de ARN. Esto tendrá un impacto modesto en la señal fluorescente2.
    3. Componer una solución de tinción de gel 1x utilizando la solución de tinción de gel 5x del paso 1.1.2 y, inmediatamente antes de su uso, complementarla con fluoróforo TO1-Biotina (ver Tabla de Materiales)a una concentración final de 20 nM. Por ejemplo, añadir 20 ml de solución de tinción de gel 5x a 80 ml de agua desionizada para hacer 100 ml de solución de tinción de gel 1x, y añadir 2 ml de un stock de 1 mM TO1-Biotina (preparado en dimetilformamida).
      NOTA: El coeficiente de extinción para el tinte TO1-Biotina a 500 nm es de 63.000 M-1cm-1, medido en la solución de tinción1.
  2. PAGINA Desnaturalante (2x solución de carga de gel desnaturalizante y soluciones A, B, C, persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina)
    1. Preparar 50 ml de solución de carga de gel desnaturalizante 2veces mezclando 40 ml de formamida, 0,5 ml de ácido etilendiaminetetraacético de 0,5 M (EDTA, pH 8.0) y 9,5 ml de ddH2O. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente. Los colorantes de carga no se agregan a esta solución, ya que puede oscurecer las imágenes fluorescentes.
    2. Prepare el tinte de carga de gel desnaturalizador 2x de la siguiente manera. Al purificar los arnlos y los oligonucleótidos de ADN, añada 0,5 ml de 2,5% (p/v) azul bromofenol (BB) y 0,5 ml de 2,5% (p/v) de xileno cianol (XC) a la solución descrita en el paso 1.2.1, y agregue 8,5 ml de ddH2O en lugar de 9,5 ml. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente.
    3. Preparar 100 ml de solución A pesando 200,2 g de urea (peso de fórmula: 60,06 g/mol) y añadiéndola a 312,5 ml de 40% 19:1 acrilamida:N,N'-metilenhemenacrilamida. Revuelva con una barra de agitación magnética a máxima velocidad hasta que se disuelva (aproximadamente 3 h) y coma la solución a 500 ml utilizando ddH2O. Tenga en cuenta que las concentraciones finales son 6.667 M de urea y 25% 19:1 acrilamida:N,N'-metilenbisacrilamida. Conservar a 4oC en plásticos limpios.
    4. Preparar 1 L de la solución B pesando 400,4 g de urea y conforman la solución a 1 L con ddH2O; revuelva hasta que la urea se haya disuelto. La solución B se puede mantener a temperatura ambiente.
    5. Prepare la solución C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) de la siguiente manera. Preparar 4 L de 10x TBE pesando 432 g de base Tris y 220 g de ácido bórico, añadiendo 160 ml de 0,5 M EDTA con un pH de 8 (filtrado), y conformando la solución a 4 L con ddH2O. Un gran stock de este búfer se hace, ya que también se utiliza como tampón de ejecución de gel.
    6. Preparar el 10% de persulfato de amonio (APS) disolviendo 1 g de APS en un volumen total de 10 ml de ddH2O. Almacenar a 4 oC.
    7. Mantenga a mano la tetrametiletilemediamina (TEMED). Almacenar lo a 4 oC junto con la solución APS.
  3. PAGE nativo (2x solución de carga de gel nativo)
    1. Preparar 50 ml de solución de carga de gel nativa 2x mezclando 25 ml de 100% glicerol, 10 ml de solución de tinción de gel 5x y 15 ml de ddH2O para componer la solución a 50 ml.
      NOTA: Al igual que en la sección de gel dedesnaturalización, se pueden añadir colorantes de carga a este stock, pero su adición puede oscurecer potencialmente la señal fluorescente en el gel y, por lo tanto, debe evitarse.

2. Preparación y carga de geles desnaturalizantes

  1. Preparar un gel desnaturalizante con un porcentaje adecuado siguiendo la Tabla 1. Considere el sistema específico de fundición de gel; Los geles de 30 ml se utilizan comúnmente. El porcentaje de gel adecuado se puede estimar utilizando la Tabla2: seleccione el porcentaje de poliacrilamida donde los colorantes BB y XC tengan motilidades más rápidas y lentas, respectivamente, que el ARN de interés, para garantizar la separación de bandas altas en el tamaño pertinente Gama.
  2. Mezcle las soluciones A, B y C según la Tabla 1 y agregue APS y TEMED inmediatamente antes de verter el gel. Mezcle bien las soluciones en plásticos limpios.
  3. Vierta la solución de gel en un aparato de fundición de gel adecuado, después de asegurarse de que todos los componentes estén escrupulosamente limpios. Levante un lado del aparato para que el gel se incline ligeramente al verter, para evitar que las burbujas de aire queden atrapadas dentro del gel en sí.
  4. Inserte el peine deseado y déjelo polimerizar (aproximadamente 30 min). Observe la polimerización mirando de cerca un cambio en el índice de refracción alrededor de los pozos de gel. Componer el tanque de gel utilizando 1 x solución C (1x TBE) y retirar cuidadosamente el peine. Con una jeringa, aspirar los pozos inmediatamente antes de la carga de la muestra.
  5. Prepare las muestras de desnaturalización de la siguiente manera. Añadir 2x solución de carga de gel desnaturalizador a las muestras de ARN de interés para hacer que la solución de carga de gel desnaturalizador 1x y la desnaturalización del calor a 95 oC durante 5 min mediante el uso de un termociclador o baño de agua.
  6. Antes de cargar las muestras, enfríe las muestras durante varios minutos hasta que estén frías al tacto. Cargue las muestras superándolas en capas en la parte inferior de cada pocal, usando puntas de carga de gel.
    NOTA: Las puntas redondas se pueden utilizar para geles de 1 mm de espesor o más; puntas planas para geles más delgados.
  7. Ejecuta los geles desnaturalizantes a temperatura ambiente. Asegúrese de que la potencia es lo suficientemente baja para que las placas de vidrio del sistema de gel no se agrieten.
    NOTA: En nuestro laboratorio, 28 W para placas de 20 cm x 16 cm era suficiente para este propósito.

3. Preparación y carga de geles nativos

  1. Prepare un gel nativo con un porcentaje adecuado refiriéndose a la Tabla 3. Considere el sistema específico de fundición de gel, pero tenga en cuenta que los geles de 30 ml se utilizan comúnmente. Mezclar las soluciones de 1x TBE, 40% 29:1 acrilamida:N,N'-metilenbisacrilacrilamida, y glicerol según la Tabla 3, y añadir APS y TEMED inmediatamente antes de verter el gel. Proceda como se describe en los pasos 2.3 y 2.4.
  2. Preparar muestras nativas añadiendo 2x solución de carga de gel nativo a las muestras de ARN de interés para hacer la solución 1x y permitir que incubaa a temperatura ambiente durante 100 minutos antes de ejecutar el gel para asegurar el plegado completo del ARN.
  3. Ejecuta el gel nativo en una cámara frigorífica a 4oC, asegurándote de que la potencia sea lo suficientemente baja como para no calentar el gel.
    NOTA: En nuestro laboratorio, 14 W para placas de 20 cm x 16 cm era suficiente para este propósito.

4. Preparación del ARN mediante la transcripción T7 de escorrenca

NOTA: Las secuencias de ADN utilizadas para la transcripción de escorrenta10 de las construcciones de ARN Mango fueron ordenadas comercialmente. En este método, los oligonucleótidos de ADN que contienen el complemento inverso (RC) tanto de la secuencia a transcribir como del promotor T7 se hibridan en una secuencia de hebra superior promotora T7 y luego se trancriban in vitro. A continuación, para cada oligonucleótido, el RC de la secuencia del núcleo de Mango se muestra en negrita y el RC de la región promotora del T7 se muestra en cursiva. Los residuos en la fuente regular corresponden a regiones helicoidales complementarias arbitrarias necesarias para permitir que el núcleo de Mango se doble correctamente.

Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G

  1. Purificación de gel preparativo de los oligonucleótidos de ADN
    1. Para una síntesis de ADN a escala de 0,2 omol, resuspenda el oligonucleótido de ADN desprotegido en 100 s de ddH2O y 100 l de tinte de carga desnaturalizador 2x (del paso 1.2.2). En este caso, se prefiere incluir los colorantes de carga de gel en la solución de carga a la misma concentración que en el paso 1.2.2.
    2. Purificar el oligonucleótido de ADN utilizando un gel desnaturalizante de escala preparativa de 50 ml del porcentaje adecuado de poliacrilamida; utilizar la Tabla 2 para elegir el porcentaje de gel. Por ejemplo, utilice un 8% de gel para una secuencia de 50 nt. Idealmente, el azul bromofenol debe funcionar más rápido que el oligonucleótido, y el cianol de xileno debe funcionar más lento.
      NOTA: En nuestro laboratorio, estos geles se fundieron utilizando espaciadores de fundición de 1,5 mm de espesor y un peine de carga de gel con pozos de 2-2,5 cm de ancho.
    3. Cargar 100 l de las soluciones de oligonucleótidos de ADN preparadas en el paso 4.1.2 por gel preparativo, así como se describe en los pasos 2.4–2.7.
    4. Seque cuidadosamente el exterior del gel, retire las placas de vidrio y cubra ambos lados del gel en una envoltura de plástico. Colóquelo en una pantalla de imágenes fluorescentes (las placas de cromatografía de capa delgada con respaldo de aluminio impregnadas con fluoróforo son una solución económica) y utilice una lámpara portátil UV de longitud de onda corta para visualizar las bandas de ADN mediante sombras UV.
    5. Se debe observar una sombra nítida y bien definida si la síntesis de ADN es de alta calidad. Marque las bandas en la envoltura de plástico, usando un marcador permanente.
      NOTA: Proteja la piel y los ojos de la luz UV y mantenga las exposiciones cortas para evitar dañar la muestra de ácido nucleico.
    6. Colocar el gel en una placa de vidrio limpia, cortar cuidadosamente las bandas marcadas y colocar cada fragmento de gel en 400 sL de 300 mM de NaCl. Eluir el ADN durante la noche, usando un rotador a temperatura ambiente.
    7. Recuperar el eluyente en un tubo de centrífuga limpia y añadir 2.5 equivalentes de etanol para precipitar el ADN. Vortex bien y coloque el tubo a -20 oC durante 30 min.
    8. Pelet la muestra en una centrífuga de sobremesa a 156.000 x g durante 30 min a 4oC. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el pellet en ddH2O. Utilice un espectrofotómetro para determinar con precisión la concentración de oligonucleótidos de ADN. Almacene la muestra como un stock de 10 m para mayor comodidad a -20 oC.
  2. Transcripción de escorrente y purificación en gel de muestras de ARN
    1. Preparar 5x stock de trifosfato de nucleósidos (NTP) mezclando reservas líquidas de NTP compuestas por una concentración final de trifosfato de guanosina de 40 mM (GTP, 11.400 M-1cm-1), trifosfato de citidina de 25 mM (CTP, 7.600 M-1cm-1), 25 mMM trifosfato de adenosina (ATP, 5.000 M-1cm-1), y trifosfato de uridina de 10 mM (UTP, 10.000 M-1cm-1); todos los coeficientes de extinción a 260 nm.
      NOTA: Las existencias líquidas o en polvo se pueden obtener comercialmente. Si prepara las existencias primarias del polvo, ajuste cuidadosamente el pH a un pH final de 7,9, utilizando 1 M NaOH. Alícuota el stock en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdelo a -20 oC.
    2. Preparar 100 ml de tampón de transcripción 10x T7 mezclando 25,6 ml de 1 M Tris-HCl, 14,4ml de base Tris de 1 M, 26 ml de 1 M MgCl 2, 10 ml de 10% de tritón X-100 y 0,637 g de espermadina. Componer la acción a un volumen final de 100 ml añadiendo ddH2O.
      NOTA: Se debe confirmar un pH final de 7,9 de la solución 1x utilizando un medidor de pH calibrado. El 10x debe filtrarse estérilmente y almacenarse a -20 oC en alícuotas de tamaño adecuado.
    3. Realice la transcripción de la siguiente manera.
      1. Añadir los siguientes reactivos para componer una concentración final de 1búfer de transcripción T7 utilizando el stock de tampón de transcripción 10x T7 y ddH2O (del paso 4.2.2), 1x NTPs, 10 mM de ditiothreitol (DTT), 1 M T7 secuencia de hilo superior (ver sección 4 Nota para el secuencia de ADN de mango purificado en gel de 1 M (paso 2.1) y enzima polimerasa de ARN T7 (1 U/L).
      2. Vórtice, girar hacia abajo, e incubar la solución a 37 oC durante 2 h o hasta que se vuelve turbia y se forma un precipitado blanco en la parte inferior del tubo. Una transcripción de 50 l debe dar como resultado 50 ml de ARN de 50 m después de la purificación del gel. Añadir un volumen igual de 2x tinte desnaturalizante y almacenarlo a -20 oC hasta que esté listo para la purificación del gel.
    4. Gel-purificar el ARN resultante como se describe en la sección de purificación de gel de oligonucleótidos de ADN siguiendo los pasos 4.1.2-u20124.1.8, sustituyendo la muestra de ARN por el ADN.
      NOTA: El ARN es extremadamente sensible a la degradación de RNase, así que asegúrese de que en todos los pasos, guantes y una capa de laboratorio limpia se usen en todo momento. Asegúrese de que todas las muestras se preparen y almacenen en material plástico de un solo uso para protegerlas contra la contaminación por RNase, y lave las placas de vidrio cuidadosamente con agua y jabón caliente antes de su uso, enjuáguelas bien con ddH2O y seque la cristalería con el la asistencia del etanol aplicado a partir de una botella de compresión.
    5. Utilice 1 l de la muestra final de ARN y, utilizando un espectrofotómetro basado en gotas, determine la absorbancia a 260 nm. Usando un coeficiente de extinción determinado por el método de vecino más cercano, calcule la concentración de ARN y ajuste la concentración de la muestra a 10 m con ddH2O para mayor comodidad. Almacene las muestras de ARN a -20 oC.
  3. Escherichia coli extracción total de ácido nucleico bruto
    NOTA: El siguiente protocolo es un ejemplo. Este protocolo utiliza ARN 6S con etiqueta I de Mango expresado endógenamente a partir de un plásmido en E.coli, y la inducción de este plásmido se describe en otra parte en detalle4.
    1. A los efectos de este estudio, preparar 500 ml de células inducidas para el pEcoli-RNA Mango y los plásmidos de pEcoli-T1 (las células se inducen a una DO600 nm de 1). Peletizar las células y almacenarlas a -80 oC antes de su uso.
    2. Realice la extracción de ARN de la siguiente manera.
      1. Tomar 0,5 ml del pellet de células de pEcoli inducido y añadir 500 ml de fenol equilibrado. A continuación, vórtice la muestra; la solución se volverá blanca lechosa. Centrífuga a máxima velocidad durante 2 minutos para separar las capas.
      2. Extraiga la capa superior, que será ligeramente amarilla, y repita el paso 4.3.2.1 añadiendo un volumen igual de fenol, centrifugación y extrayendo para un total de 5x (o hasta que la capa media, que es blanca opaca, desaparezca y solo queden dos capas claras).
      3. Agregue el volumen acuoso extraído de fenol a un volumen igual de cloroformo, vórtice y, a continuación, centrífuga a la velocidad máxima durante 2 min.
      4. Extrae la capa acuosa y añade NaCl a una concentración final de 300 mM. Precipitar el ácido nucleico resultante mediante la adición de 2,5 equivalentes de etanol, vórtice, espín hacia abajo, y precipitar a -20 oC durante al menos 30 min.
      5. Pellet en una centrífuga de sobremesa a 15,6 x 1.000 x g a 4 oC durante 30 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de ddH2O.
      6. Añadir un paso de digestión DNase Ia este procedimiento, siguiendo el protocolo 11 al que se hace referencia, para obtener el ARN total.
        NOTA: Vórtice vigorosamente hasta que el pellet se disuelva completamente en ddH2O.

5. Tinción post-gel

  1. Preparar 1 solución de tinción de gel según la receta en el paso 1.1.3 y añadirlo a un recipiente de vidrio limpio que sea lo suficientemente ancho como para encajar cómodamente el gel.
    NOTA: Los recipientes de vidrio borosilicato con tapas de ajuste a presión sirven bien para este propósito.
  2. Añadir suficiente solución de tinción de gel 1x al recipiente para que el gel esté completamente cubierto con la solución y el líquido se sloshes sobre la parte superior del gel cuando se coloca en el rotador orbital.
    NOTA: El recipiente debe ser lo suficientemente grande como para caber el gel para que pueda moverse y tener suficiente tampón en el recipiente para cubrir completamente el gel.
  3. Una vez que el gel nativo o desnaturalizante haya terminado de funcionar (sección 2 o 3, respectivamente), retire el gel del aparato y corte sus pozos. Puede ser útil quitar una esquina del gel para la orientación más adelante en el análisis.
  4. Transfiera cuidadosamente el gel a la solución de tinción de gel 1x preparada en el paso 5.2.
    NOTA: Los geles son frágiles y propensos a romperse, así que tenga cuidado al transferir el gel. Mantenga la tapa del recipiente de tinción en todo momento para no contaminar el gel.
  5. Coloque el gel en un rotador orbital a una velocidad de 100 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Asegúrese de que el gel no se doble sobre sí mismo; de lo contrario, el ARN puede difundirse fuera del gel y así etiquetar una parte diferente del gel.

6. RNA con etiqueta de Mango de imágenes en gel

  1. Decantar cuidadosamente el búfer de imágenes. Enjuague el gel rápidamente con agua, asegurando suficientes restos líquidos para mantener el gel ligeramente móvil en el recipiente.
  2. Transfiera cuidadosamente el gel al imager. Transfiera recogiendo cuidadosamente los lados del gel y colocándolo en la bandeja del imager; alternativamente, el gel se puede verter lentamente en la bandeja. Asegúrese de que no haya burbujas debajo del gel y de que no haya exceso de líquido debajo del gel. Una pipeta enrollada sobre el gel puede ser útil para eliminar cualquier exceso de líquido.
    NOTA: Use una toalla de papel para absorber el exceso de líquido.
  3. Tome una imagen de gel, observando la fluorescencia entre la longitud de onda de excitación 510 nm y la longitud de onda de emisión 535 nm (por ejemplo, luz verde a 520 nm ajustes de fluorescencia de longitud de onda en el imager). Asegúrese de que los ajustes estén completamente optimizados en el instrumento y siga cuidadosamente las instrucciones del instrumento utilizado.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ARN cortos etiquetados con Mango se prepararon como se describe en la sección de protocolo. Suponiendo que la fluorescencia en condiciones de desnaturalización sería más difícil de observar debido a la presencia de urea en los geles, primero estudiamos la resistencia de los aptámeros de mango a la urea, que actúa como un desnaturalizante del ácido nucleico. Encontramos que los aptámeros de mango son sustancialmente resistentes a la desnaturalización hasta una concentración de urea de ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una ventaja significativa de la etiqueta fluorescente Mango es que una sola etiqueta se puede utilizar de múltiples maneras. El alto brillo y la afinidad de estos aptámeros los hacen útiles no sólo para la visualización celular 2, sino también para el ARN in vitro o la purificación RNP4. Por lo tanto, la imagen en gel amplía la versatilidad de la etiqueta Mango de una manera sencilla. La sensibilidad por imágenes de gel de mango es ligeramente menor ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Está pendiente una patente sobre el sistema fluorogénico Mango.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Razvan Cojocaru y Amir Abdolahzadeh por su asistencia técnica y a Lena Dolgosheina por la corrección del manuscrito. La financiación fue proporcionada para este proyecto por una subvención operativa del Consejo Canadiense de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) a P.J.U.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Peine de 0,8 mm de grosor 14 pocillos para geles PAGE de 30 mLLabRepCo11956042
101-1000 y micro; L  consejosFisher02-707-511
20-200 µ L baja retención  consejosFisher Scientific02-717-143
Acrilamida:N,N'-metilenebisacrilamida (40% 19:1)BiorreactivosBP1406-1Toxicidad aguda
Acrilamida:N,N'-metilenebisacrilamida (40% 29:1)FisherBP1408-1Toxicidad aguda
AgarAnachemia02116-380
Placa TLC con respaldo de aluminioSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
Persulfato de amonioBiorad161-0700Células
BL21NEBC2527H
Sal de sodio azulSigmaB8026-25G
C3300
DitiothreitolSigma Aldrich AlcoholesD0632-5G
DNasa IThermoFisherEN0525
EDTA Sal disódicaACPE-4320
EtanolCommerial 
Gel plano Consejos de cargaCostarCS004854
Formamida 99%Alfa AesarA11076
Juego de aparatos de gel con espaciadores y peinesLabRepCo41077017
Plato de vidrio con tapaplástico Pyrex1122963debe ser lo suficientemente grande como para que quepa su pieza de gel
GlycerolAnachemia43567-540
Anachemiade HCl464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDH BDH9292
Rotador orbitalLab-Line
PhenolInvitrogen15513-039
Gel Redondo Consejos de cargaCostarCS004853
Fosfato de Sodio DibásicoCaledron8120-1
Caledromonobásico de fosfato de sodio8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 ARN polimerasaABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotina FluoróforoABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
TriptonaFisherBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
UreaFisherU15-3
Xileno CyanolSigmaX4126-10G
Extracto de LevaduraBioshopYEX401.500
1164840001 dañinas Ácido bórico ACP B-2940 Bromofenol Chloloform ACP P016EAAN de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

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