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Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

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DOI:

10.3791/59123

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22 de enero de 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.

Resumen

Sistemas de cultivo celular (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitulan en vivo respuestas celulares y funciones que los sistemas de dos dimensiones tradicionales de la cultura (2D). Sin embargo, medición de función de las células en cultura 3D suele ser más difícil. Muchos ensayos biológicos requieren recuperación de material celular que puede ser difícil en las culturas 3D. Una forma de enfrentar este desafío es desarrollar nuevos materiales que permitan la medición de función de la célula dentro del material. Aquí, se presenta un método para la medición de actividad de la metaloproteinasa (MMP) de matriz celular en hidrogeles 3D en un formato de 96 pozos. En este sistema, un hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) es functionalized con sensor escindibles fluorógenos MMP. Actividad MMP celular es proporcional a la intensidad de fluorescencia y puede medirse con un lector de microplacas estándar. Miniaturización de este ensayo a un formato de 96 pocillos reduce el tiempo requerido para la instalación experimental por 50% y el reactivo de uso 80% condición en comparación con la versión anterior de 24 pocillos de ensayo. Este ensayo también es compatible con otras mediciones de la función celular. Por ejemplo, un análisis de la actividad metabólica es demostrado aquí, que puede realizarse simultáneamente con las mediciones de actividad de la MMP dentro el mismo hidrogel. El ensayo se demuestra con las células de melanoma humano encapsuladas en una gama de siembra la densidad para determinar la densidad de encapsulación apropiada para el rango de trabajo del ensayo de la célula. Después de 24 h de encapsulación de la célula, MMP y lecturas de la actividad metabólica fueron proporcionales a la densidad de siembra de la célula. Mientras que el ensayo se demuestra aquí con un substrato degradable fluorógenos, el ensayo y la metodología podrían ser adaptados para una gran variedad de sistemas de hidrogel y otros sensores fluorescentes. Tal un ensayo proporciona una plataforma de cultivo 3D práctica, eficiente y accesible para una amplia variedad de aplicaciones.

Introducción

Sistemas de cultivo (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitular en vivo respuestas celulares que los sistemas de cultivo (2D) dos dimensiones tradicionales, ver varias publicaciones excelente1,2,3 . Sin embargo, los sistemas de cultivo 3D para medir la función de la célula ha sido difícil debido a la dificultad de recuperación celular y más procesamiento de la muestra. Esta dificultad limita la medición de muchas funciones celulares en los sistemas de cultivo 3D. Para superar esta dificultad, nuevas técnicas son necesarias que permita la fácil medición de función de la célula dentro de entornos 3D. Una forma de responder a esta necesidad es el desarrollo de materiales que no sólo apoyan cultivo celular 3D sino también incorporar sensores para medir la función de la célula. Por ejemplo, varios sistemas de hidrogel han incorporado partes escindibles de la proteasa fluorógenos para habilitar la visualización de la actividad de las proteasas dentro de entornos 3D4,5,6,7. Mientras que estos sistemas fueron utilizados originalmente para la proyección de imagen microscópica, estos sistemas también pueden ser adaptados para su uso en un ensayo de actividad global de la matriz metaloproteinasa (MMP) utilizando un lector de placa estándar, que permite la medida fácil de una función de la célula en un 3D medio ambiente8.

MMPs, superfamilia de las proteasas de zinc, juegan un papel crítico en la homeostasis del tejido normal y en muchas enfermedades. MMPs degradan y remodelan la matriz extracelular (MEC), cleave citocinas y receptores de superficie celular y activan otras MMPs9,10. MMPs juegan un papel crítico en procesos fisiológicos tales como la cicatrización de heridas y en enfermedades como artritis, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer y cáncer (ver comentarios en 9,10,11). En el cáncer, altos niveles de expresión de la MMP se correlacionan fuertemente con metástasis de cáncer y mal pronóstico12. Además, MMPs contribuyen a la progresión del tumor mediante la promoción de cáncer células invasión y migración, procesos celulares que son fenómenos intrínsecamente 3D13,14. Por lo tanto, hay mucho interés en la capacidad para medir la actividad MMP en 3D cultura en muchos contextos, incluyendo estudios de Biología fundamentales y ensayos de detección de drogas.

Hidrogeles de PEG son ampliamente utilizados para el cultivo de celular 3D debido a su alto contenido de agua, resistencia a la adsorción de proteínas y la naturaleza armoniosa. Hidrogeles de PEG han sido funcionalizados con un número de fracciones en función directa de la célula, tales como con péptidos miméticos de ECM como RGD, RLD y IKVAV para facilitar la adhesión celular, o directamente tethering de factores de crecimiento tales como transformación de factor de crecimiento-β (TGF-β) 15,16. Más recientemente, hidrogeles PEG han sido funcionalizados con péptidos de sensores que permitan la medición de la función celular como bien5,8. Específicamente, el uso de un sistema de hidrogel PEG funcionalizados con un fluorógenos MMP-degradable medición de péptido activado de actividad celular de MMP en culturas 3D con un lector de placas estándar y no requiere ninguna transformación posterior. Estos sistemas también son compatibles con otras mediciones de la función celular, incluyendo la actividad metabólica. Aquí, se describe un protocolo para la medición de la actividad MMP de células cultivadas en un hidrogel de PEG 3D funcionalizados con un péptido MMP-degradable fluorógenos y resultados presentados demostrando los experimentos de optimización inicial necesarios para el uso de este ensayo. Células de melanoma humano (A375) fueron encapsuladas en los hidrogeles fluorógenos en un rango de densidades para determinar las densidades de siembra apropiadas que están dentro del rango de trabajo del ensayo de siembra. Después de 24 h de encapsulación, MMP y la actividad metabólica se midieron utilizando un lector de microplacas estándar. A continuación, actividad MMP fue normalizada a la actividad metabólica para determinar las densidades de siembra dentro del rango lineal del ensayo. Por último, coeficiente intra-placa de porcentajes de variación (% CV) se calcularon entre triplicados para reflejar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. Este método permite cultivo celular 3D simple y rápido y fácil medición de la actividad de la proteasa con el procesamiento de la muestra mínima.

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Protocolo

1. hidrogel preparación de componentes

  1. Sintetizan los péptidos proteasa degradable fluorescentes tal como se describe en otra parte8, utilizando fluoresceína como la molécula fluorescente y dabcyl como el extintor. Disolver el péptido en DMSO a una concentración de 10 mM y almacenar en un congelador de-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 μL) para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
    Nota: Estos péptidos también se pueden comprar comercialmente. Este protocolo requiere una cisteína C-terminal de la secuencia del péptido para permitir incorporación covalente a la red de polímero de hidrogel.
  2. Preparar 8 brazo 40 kDa poly (glicol de etileno) amina (PEG)-norbornene (NB) como describe en17. Verificar la funcionalización de grupo extremo superior al 90% mediante 1H NMR. PEG-NB se disuelven en solución salina tampón estéril de fosfato (PBS) en 25% w/v y almacenar en el congelador de-80 ° C en alícuotas (~ 300 μL).
    Nota: PEG funcionalizados con norbornene también se pueden adquirir comercialmente.
  3. Sintetizar el foto iniciador litio fenil 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como se describe en otra parte18. Disolver vuelta en agua estéril a una concentración de 68 mM y almacenar en un congelador de-80 ° C en alícuotas (~ 300 μL).
    Nota: como alternativa, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) se puede utilizar como foto iniciador. VUELTA y Irgacure pueden adquirirse comercialmente.
  4. Disolver el crosslinker MMP-degradable del péptido (KCGPQG↓IWGQCK) y los péptidos de adhesión celular (CRGDS) en agua estéril a una concentración de 200 mM y 100 mM respectivamente y almacenar en un congelador de-80 ° C (~ 300 μl y 30 μL) alícuotas, respectivamente.

2. preparación de medios de ensayo

  1. Preparar el inactivado con calor, carbón despojado de suero bovino fetal (SBF) para el ensayo de RPP:
    Nota: Las proteasas en FBS pueden producir una señal de euforia con el ensayo MMP; por lo tanto, se recomienda que inactive por calor y carbón de leña de la FBS para los medios de prueba de la tira.
    1. 100 mL de SBF de inactivar por calentamiento durante 30 min a 55 ° C.
      Nota: 100 mL de SBF se utilizó aquí para alicuotar y almacenamiento a-20 ° C para su uso futuro. Volúmenes más pequeños se pueden utilizar según sea necesario.
    2. Añadir 0,25% p/v de carbón de leña activado y 0.025% peso/volumen de dextrano a una pequeña cantidad de FBS (aproximadamente 5 mL) y remover hasta que se forma una mezcla. A continuación, añadir el resto de los equipos y agitar durante 30 min a 55 ° C.
    3. Centrifugar a 1.962 x g por 20 min a 4 ° C. Luego transferir el sobrenadante a otro buque.
    4. Repetir el paso de la 2.1.2 pero a 37 ° C seguida por paso 2.1.3. Esterilizar el sobrenadante utilizando un 0.45 μm filtro y luego un 0,2 μm.
  2. Preparar los medios de ensayo medio suplementado con 1% carbón despojado SFB, 2 mM L-glutamina, 10 U/mL de penicilina, estreptomicina 10 de μg/mL.
    Nota: Los medios de comunicación sin rojo de fenol se recomiendan porque tiene menos interferencia de fluorescencia. Otras adiciones a los medios de prueba tales como insulina, factores de crecimiento, etcetera. se puede Agregar tanto como la absorbancia y picos del espectro de fluorescencia no se superponen con el sensor (494 nm/521 nm).
  3. Enzima colagenasa bacteriana diluida tipo I en 10 y 1.000 μg/mL en los medios de ensayo como control positivo.

3. hidrogel preparación y célula encapsulado

  1. Preparar la solución precursora de hidrogel.
    1. Añadir los reactivos en un tubo de 1,5 mL en el siguiente orden, vórtex después de la adición de cada componente: 20 m m 8 brazo 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradable péptido, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP y péptido de 0.25 mM fluorógenos MMP-degradable.
      Nota: La tabla 1 muestra hidrogel precursor solución contenidos, concentraciones de población, las concentraciones de trabajo, fórmulas de cálculo de volumen y los volúmenes requeridos necesitan para hacer 120 μl de la solución precursora de hidrogel, que es suficiente para llevar a cabo un experimento con 10 hidrogeles. Para tener en cuenta la pérdida de la solución de hidrogel por pipeteo, aumentar el volumen total en un 20%. Los péptidos comerciales a menudo se suministran en una solución de cloruro de hidrógeno ácidos; por lo tanto, se agrega NaOH para alcanzar un pH final de 7. pH de la solución final debe confirmarse por el usuario.
    2. Dividir la solución precursora de hidrogel en múltiples tubos de 1.5 mL, un tubo por condición ensayada.
      Nota: Se sugieren varias condiciones de control en el que los hidrogeles se preparan sin la adición de células. Para un control negativo, para tener en cuenta la degradación no específico del sensor fluorógenos, una condición de hidrogel puede incubarse con el control del vehículo o los medios de comunicación experimental sólo si no hay condiciones tratamiento. Para un control positivo y de calibración entre experimentos, hidrogeles pueden ser incubados con una proteasa que hienden el sensor fluorógenos. Por ejemplo, dos concentraciones de colagenasa bacteriana se utilizan aquí.
  2. Encapsular las células en los hidrogeles.
    1. Preparar una suspensión unicelular como apropiado para el tipo de célula se utiliza. Por ejemplo, lavar un plato de 10 cm de las células del melanoma A375 con 10 mL de PBS. Trypsinize células con 0.05% tripsina e incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 3 minutos cuenta las células con un hemocitómetro para determinar el número total de la célula.
    2. Centrifugue la solución celular 314 x g durante 3 min, aspirar el medio de cultivo y resuspender las células en PBS en aproximadamente tres veces la densidad más alta requiere siembra para el experimento. Por ejemplo, una suspensión con una densidad de 21 x 106 células fue utilizada aquí para lograr una densidad encapsulada final de 7 x 106 células/mL.
    3. Contar las células otra vez para asegurar una concentración exacta de la célula.
    4. Añadir las células suspendidas y PBS a cada tubo de la solución precursora de hidrogel según la densidad de siembra requerida (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 x 106 células/mL en este ejemplo). Añadir PBS a condiciones sin las células en lugar de células suspendidas.
      Nota: Todas las condiciones deben tener el mismo volumen de solución de precursor de hidrogel final para asegurar la relación entre los componentes del hidrogel y el PBS es constante. No no los tubos de vórtice que tienen células en ellos, y arriba pipetear enérgicamente sin crear burbujas para mezclar la solución precursora.
    5. Dispensar 10 μl de la solución precursora de hidrogel en una estéril negra redonda placa de 96 pocillos de fondo, asegurando que la punta esté centrada en el medio de cada pozo mientras.
    6. Polimerice solución precursora de hidrogel al exponer la placa a la luz (UV) violeta ultra a 4 mW/cm2 durante 3 minutos.
      Nota: La lámpara UV (lámpara UV portátil de UVL 56, UVP, Upland, CA) produce UV-A luz en una longitud de onda larga de rayos UV (365 nm), que no afecta la viabilidad celular.
    7. Añadir 150 μL del medio de ensayo a excepción de las condiciones de control positivo sin las células encapsuladas. A los controles positivos, añadir 150 μL de solución de enzima colagenasa.
    8. Añadir 150 μL de PBS a los pozos de exteriores de la placa para reducir la evaporación durante la incubación.

4. MMP y medición de la actividad metabólica

  1. Medir fluorescencia inmediatamente posterior encapsulación para establecer una medida de la fluorescencia basal y asegurar la uniformidad en la polimerización de hidrogel. Lea la placa con una microplaca de fluorescencia lector utilizando un protocolo de opaco placa de 96 pozos con un área de exploración ajuste a 494 nm/521 nm (excitación/emisión). Esta será la 0 h leer.
  2. Incube la placa en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2 para 18 h.
  3. Añadir reactivo de actividad metabólica (resazurina) en 1:10 (v/v) para cada bien.
  4. Incube la placa en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 por un adicional de 6 horas.
    Nota: Este tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de la célula.
  5. Medida de fluorescencia en la encapsulación después de 24 h. Lea la placa con una microplaca de fluorescencia lector utilizando un protocolo de opaco placa de 96 pozos con un área de análisis entorno a 494 nm/521 nm (excitación/emisión) para la actividad MMP y 560 nm/590 nm (excitación/emisión) para la actividad metabólica.

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Resultados

El ensayo actual fue adaptado de un sistema de cultivo previamente desarrollado y caracterizado 3D hidrogel funcionalizado con un fluorógenos MMP escindibles sensor8. El sensor MMP fluorógenos utilizado aquí consiste en una secuencia del péptido, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ indica el sitio de clivaje) que previamente fue optimizado para la hendidura MMP-14 y MMP-1119. El péptido es marcado con una molécula fluorescente (fluoresceína...

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Discusión

Cultivo de células in vitro 3D recapitula muchos aspectos importantes del medio ambiente en vivo. Sin embargo, cultura 3D también hace evaluación de función celular y señalización desafiante, como muchos ensayos biológicos requieren recuperación celular y gran número de células. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de simple cultura 3D que permite la medición de la función celular sin muestra más procesamiento aumentaría enormemente la utilidad de los sistemas de cultivo 3D. El sistema 3D aquí descrito puede ser ada...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer Ohio cáncer investigación (OCR), OH, Estados Unidos para la financiación de este trabajo, así como Rey Saud University (KSU), Riyadh, KSA para patrocinar al primer autor. Peso molecular del sensor péptido fluorescente se midió usando matriz asistida, láser de desorción-ionización, espectrometría de masas (MALDI-TOF) tiempo de vuelo con la ayuda de la química instrumento Campus centro de espectrometría de masas y proteómica Instalación en la Universidad Estatal de Ohio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1X Solución salina tamponada con fosfatoFisher Scientific10-010-049
Carbón activado Sigma-AldrichC3345
Placa de 96 pocillos de fondo redondo negroBrand-Tech89093-600
Péptido de adhesión celular (CRGDS)GenScript USA Inc.
enzima colagenasa tipo I  Life Technologies17100-017
DextranSigma-AldrichD4876
DMEM High Glucose MediaInvitrogen11965118
Suero fetal bovino (FBS) Seradigm1500-500
Lector de microplacas de fluorescencia BioTekCytation 3
HemocitómetroHausser Scientific Co.3200
L-glutaminaLife Technologies25030-081
Reticulante de péptidos degradables por MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.a medida
NaOHFisher ScientificS318500
Penicilina / estreptomicinaLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
luz UV  UVP95-0006-02
hecho

Referencias

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