Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.
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Artículo de método
Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
Sistemas de cultivo celular (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitulan en vivo respuestas celulares y funciones que los sistemas de dos dimensiones tradicionales de la cultura (2D). Sin embargo, medición de función de las células en cultura 3D suele ser más difícil. Muchos ensayos biológicos requieren recuperación de material celular que puede ser difícil en las culturas 3D. Una forma de enfrentar este desafío es desarrollar nuevos materiales que permitan la medición de función de la célula dentro del material. Aquí, se presenta un método para la medición de actividad de la metaloproteinasa (MMP) de matriz celular en hidrogeles 3D en un formato de 96 pozos. En este sistema, un hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) es functionalized con sensor escindibles fluorógenos MMP. Actividad MMP celular es proporcional a la intensidad de fluorescencia y puede medirse con un lector de microplacas estándar. Miniaturización de este ensayo a un formato de 96 pocillos reduce el tiempo requerido para la instalación experimental por 50% y el reactivo de uso 80% condición en comparación con la versión anterior de 24 pocillos de ensayo. Este ensayo también es compatible con otras mediciones de la función celular. Por ejemplo, un análisis de la actividad metabólica es demostrado aquí, que puede realizarse simultáneamente con las mediciones de actividad de la MMP dentro el mismo hidrogel. El ensayo se demuestra con las células de melanoma humano encapsuladas en una gama de siembra la densidad para determinar la densidad de encapsulación apropiada para el rango de trabajo del ensayo de la célula. Después de 24 h de encapsulación de la célula, MMP y lecturas de la actividad metabólica fueron proporcionales a la densidad de siembra de la célula. Mientras que el ensayo se demuestra aquí con un substrato degradable fluorógenos, el ensayo y la metodología podrían ser adaptados para una gran variedad de sistemas de hidrogel y otros sensores fluorescentes. Tal un ensayo proporciona una plataforma de cultivo 3D práctica, eficiente y accesible para una amplia variedad de aplicaciones.
Introducción
Sistemas de cultivo (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitular en vivo respuestas celulares que los sistemas de cultivo (2D) dos dimensiones tradicionales, ver varias publicaciones excelente1,2,3 . Sin embargo, los sistemas de cultivo 3D para medir la función de la célula ha sido difícil debido a la dificultad de recuperación celular y más procesamiento de la muestra. Esta dificultad limita la medición de muchas funciones celulares en los sistemas de cultivo 3D. Para superar esta dificultad, nuevas técnicas son necesarias que permita la fácil medición de f....
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Protocolo
1. hidrogel preparación de componentes
- Sintetizan los péptidos proteasa degradable fluorescentes tal como se describe en otra parte8, utilizando fluoresceína como la molécula fluorescente y dabcyl como el extintor. Disolver el péptido en DMSO a una concentración de 10 mM y almacenar en un congelador de-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 μL) para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
Nota: Estos péptidos también se pueden comprar comercialmente. Este protocolo requiere una cisteína C-terminal de la secuencia del péptido para permitir incorporación covalente a la red de polímero de hidrogel. - Preparar 8 brazo....
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Resultados
El ensayo actual fue adaptado de un sistema de cultivo previamente desarrollado y caracterizado 3D hidrogel funcionalizado con un fluorógenos MMP escindibles sensor8. El sensor MMP fluorógenos utilizado aquí consiste en una secuencia del péptido, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ indica el sitio de clivaje) que previamente fue optimizado para la hendidura MMP-14 y MMP-1119. El péptido es marcado con una molécula fluorescente (fluoresceína.......
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Discusión
Cultivo de células in vitro 3D recapitula muchos aspectos importantes del medio ambiente en vivo. Sin embargo, cultura 3D también hace evaluación de función celular y señalización desafiante, como muchos ensayos biológicos requieren recuperación celular y gran número de células. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de simple cultura 3D que permite la medición de la función celular sin muestra más procesamiento aumentaría enormemente la utilidad de los sistemas de cultivo 3D. El sistema 3D aquí descrito puede ser ada.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer Ohio cáncer investigación (OCR), OH, Estados Unidos para la financiación de este trabajo, así como Rey Saud University (KSU), Riyadh, KSA para patrocinar al primer autor. Peso molecular del sensor péptido fluorescente se midió usando matriz asistida, láser de desorción-ionización, espectrometría de masas (MALDI-TOF) tiempo de vuelo con la ayuda de la química instrumento Campus centro de espectrometría de masas y proteómica Instalación en la Universidad Estatal de Ohio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1X Solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Carbón activado | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Placa de 96 pocillos de fondo redondo negro | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Péptido de adhesión celular (CRGDS) | GenScript USA Inc. | ||
| enzima colagenasa tipo I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Lector de microplacas de fluorescencia | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030-081 | |
| Reticulante de péptidos degradables por MMP (KCGPQG↓ IWGQCK) | GenScript USA Inc. | a medida | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicilina / estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| luz UV | UVP | 95-0006-02 |
Referencias
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Ph....
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Reimpresiones y permisos
