Artículo de método

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

DOI:

10.3791/59128

⸱

12 de febrero de 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Resumen

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Citometría de flujo (FC) es el método de elección para la medición semicuantitativa de marcadores de antígeno de superficie celular. Recientemente, esta técnica se ha utilizado para los análisis fenotípicos de vesículas extracelulares (EV) incluyendo exosomas (Exo) en la sangre periférica y otros fluidos corporales. El pequeño tamaño de EV exige el uso de instrumentos dedicados tienen un umbral de detección alrededor de 50-100 nm. Por otra parte, EV se puede enlazar a microesferas de látex que pueden ser detectado por FC. Microesferas, conjugado con anticuerpos que reconocen EV asociado marcadores/Cluster de diferenciación CD63, CD9 y CD81 se pueden utilizar para la captura de EV. Exo de CM puede ser analizada con o sin enriquecimiento previo por ultracentrifugación. Este enfoque es adecuado para análisis EV usando instrumentos convencionales de FC. Nuestros resultados demuestran una correlación lineal entre los valores de la intensidad media de fluorescencia (IMF) y concentración de EV. Interrumpir EV mediante sonicación dramáticamente había disminuido MFI, indicando que el método no detecta restos de membrana. Divulgamos un método exacto y confiable para el análisis de antígenos de superficie de EV, que pueden aplicarse fácilmente en cualquier laboratorio.

Introducción

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Las células secretan vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños incluyendo microvesículas (MV) y exosomas (Exo). Este último puede distinguirse de MV por tamaño y el compartimento subcelular de origen. MV (200-1.000 nm de tamaño) se liberan de las células madre por desprendimiento de la membrana plasmática. Por el contrario, Exo (30 – 150 nm) originan endosomal membranas y se liberan en el espacio extracelular, cuando los cuerpos multivesicular (MVB) se fusionan con la membrana de la célula1,2.

EV son cada vez más utilizados como biomarcadores diagnóstico así como, potencialmente, herramientas terapéuticas en muchos campos como la oncología, Neurología, cardiología y enfermedades musculoesqueléticas3,4,5. Una gran mayoría de los estudios en curso con EV como agentes terapéuticos explotan el aislamiento de las vesículas de acondicionado celular medio (CM) de las células cultivadas in vitro. Las células madre mesenquimales (MSCs) ejercen efectos beneficiosos en varios contextos, y EV derivados de MSC han demostrado beneficios en modelos de isquemia/reperfusión miocardio lesión6 y cerebro lesión7. Derivados de MSC EV también exhiben actividades moduladores inmunes que pueden ser explotadas para el tratamiento de rechazo inmune, como se demostró en un modelo de terapia-refractario injerto - versus - host disease8. Células madre del líquido amniótico (hAFS) enriquecer activamente CM con MVs y Exo, heterogénea en tamaño (50-1.000 nm), que median varios efectos biológicos, tales como proliferación de células diferenciadas, angiogénesis, inhibición de la fibrosis, y cardioprotección4. Hemos demostrado recientemente que EV y particularmente de Exo, secretada por las células del progenitor de origen cardiaco humano (Exo-CPC) reducen el tamaño del infarto de miocardio en ratas5,9.

Exo de compartir un conjunto común de proteínas en su superficie, incluyendo tetraspaninas (CD63, CD81, CD9) y complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I). Además de este conjunto común de proteínas, Exo contienen también proteínas específicas para el subconjunto de EV del tipo de la célula productora. Marcadores de Exo están ganando importancia primordial porque juegan un papel crucial en la comunicación entre celular, de tal modo regulación de muchos procesos biológicos5,10. Debido a su pequeño tamaño, encontrar una manera fácil de analizar EV usando clásico flujo cytometry (FC) sigue siendo una tarea difícil.

Aquí, presentamos un protocolo simplificado para el análisis de la EV con FC, que se puede aplicar a muestras previamente enriquecidas obtenidas mediante ultracentrifugación o directamente a CM (figura 1). El método utiliza bolas recubiertas con un anticuerpo específico que se une canónica asociada a Exo superficie epitopos (CD63, CD9, CD81) sin lavados adicionales. Análisis de la FC pueden realizarse usando un citómetro convencional sin necesidad de ajustes antes de las mediciones. Métodos para la caracterización de antígenos en las partículas pequeñas individuales con citómetros de flujo han sido descritos por otros grupos con respecto a varias aplicaciones11,12,13. Aquí, utilizamos granos magnéticos funcionalizados para la captura de partículas pequeñas y Exo, seguido por fenotipado de partículas captadas por el FC. Aunque este método puede utilizarse para caracterizar la composición antigénica de pequeñas vesículas por cualquier tipo de célula en vitro, aquí proporcionamos condiciones de cultivo de células específicas que se aplican para el cultivo de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) y la más ambiente adecuado para la producción de EV por estas células.

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Protocolo

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1. recogida y tratamiento de medios condicionados

  1. Capa de 55 cm2 placas de Petri con gelatina de piel porcino 0,02% en PBS.
  2. CPC (8.000/cm2) en platos previamente recubiertos de la placa con 7 mL de medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM) suplementado con 20% FBS (suero bovino Fetal) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
    Nota: El término "CPC" se refiere a las células del explante humano derivado que han sido descritos en otra parte14. CM se puede recoger de diferentes tipos de células cultivados en condiciones de cultivo específicas. Utilice guantes y trabajar bajo una campana de biológica.
  3. Una vez que las células llegan a sobre 80% de confluencia, quiten el medio de cultivo células dos veces con de Dulbecco PBS (PBS) Ca y Mg-libre y reemplazarlo con 10 mL de medio sin suero de la Exo-producción (modificado Eagle de Dulbecco mediana [DMEM] glucosa alta, 4,5 g/mL).
    Nota: Proceder a una progresiva disminución de la concentración del suero en el medio de cultivo, poco a poco adaptar la condición libre de suero (SF) de las células. Para las células que son sensibles al medio libre de suero preparar un medio que contiene FBS, pero agotado de EV. Preparar el medio suplementado con todos los nutrientes, además de 10% – 20% (v/v) equipos. Centrifugar el medio de la noche a 100.000 x g, 4 º C. Tenga en cuenta que este procedimiento no garantiza 100% eliminación de EV derivados del FBS.
  4. Después de 7 días, recoger el CM en un tubos de centrífuga de polipropileno.
    Nota: El tiempo de acondicionado medio depende del tipo de célula. Para las células que son sensibles al medio libre de suero, aumentar el volumen inicial del medio y disminuir el tiempo para la colección de CM a 24-48 h.
  5. Claro CM de restos celulares por centrifugar a 3.000 x g durante 20 min a 4 – 10 ° C. Recoger el sobrenadante en un tubo de filtro de centrífuga kDa 100.
  6. Concentrado despejó CM haciendo girar el tubo a 2.000 x g por 20 min a 4 – 10 ° C.
    Nota: Este paso reduce el volumen inicial de CM permitiendo el uso de tubos de pequeño volumen para pasos de centrífuga de alta velocidad y contribuirá a eliminar agregados de proteína.
  7. Recoger el concentrado en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4 – 10 ° C.
  8. Recoger el sobrenadante y proceder a la sección 2 (enriquecimiento de EV). Si no hay una ultracentrífuga proceder directamente a la sección 3 (cuantificación de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)).
    Nota: Pre enriquecimiento de EV fracción mejora la lectura final en la intensidad de fluorescencia (ver resultados representativos y figura 4). Autorizado CM (del punto 1.8) puede almacenarse a 4 ° C no más entonces 1-2 días o alternativamente en el ° C −80 durante varios meses. 5 CM debe ser previamente autorizado para quitar cualquier ruina celular antes de su almacenamiento a-80 ° C para asegurar que tamaño de exosomas escombros no está formado en el proceso de congelación y descongelación.

2. extracelular vesículas enriquecimiento por ultracentrífuga (opcional)

  1. Colocar el sobrenadante del paso 1.8 en un tubo de ultracentrífuga de grosor de la pared de policarbonato. Llenar el tubo con 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) hasta que alcance la capacidad máxima (mL 3,2).
  2. Cargar las muestras en un rotor de ángulo fijo de titanio (8 x 3.2 mL, Factor k 13). Carga el rotor en una ultracentrífuga de sobremesa. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 3 h a 4 – 10 ° C.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 μl de 1 x PBS.

3. nanopartículas seguimiento cuantificación de análisis (NTA)

  1. Diluir 1 μl de muestra (de cualquier paso 2.3 o 1.8) en 999 μl de PBS 1 x. Cargar la muestra en una jeringa de 1 mL, evitando la formación de burbujas. Cargue la jeringa en el orificio de entrada de la sala de examen.
  2. Encender el láser. Abrir la cámara con el botón de captura . Ajuste el enfoque.
  3. Grabar al menos 3 marcos distintos de 60 s cada uno.
  4. Analizar las adquisiciones diferentes 3 con la opción de Proceso por lotes en el software.
    Nota: Si la tecnología NTA no está disponible, realizar una cuantificación de proteínas por el ensayo de Bradford (1 x 108 partículas corresponden a 1-2 μg de proteínas totales después de la ultracentrifugación o a 50 – 60 μg proteína total si la cuantificación se realiza directamente para el CM como incluye contaminantes proteínas diferentes de EV; Ver tabla 1)5.

4. preparación de la muestra

  1. Preparar un grupo de los 3 tipos de granos de la captura (CD9 granos, granos de CD63, CD81 de perlas en un 1: relación 1:1; véase Tabla de materiales) y vortex.
    Nota: La piscina ha sido probada para ser estable durante 1 mes. Puede utilizar un solo tipo de captación de grano, esto permitirá la detección de subpoblaciones de EV no discriminable con piscina de bolas. Mediante el uso de antígeno único captura de cuentas, va a ser posible contemporáneo demuestran la presencia de proteínas tetraspanina, como CD9, CD81, CD63, y el antígeno de interés detectadas por anticuerpos fluorescentes. Gotas de látex alternativos aldehído sulfato también están comercialmente disponibles. Estas cuentas presentan superficie para la adsorción de MV y EV.
  2. En un tubo de fondo redondo, introducir la cantidad de volumen correspondiente a 1 x 108 partículas más 1 μl de la piscina de bolas, correspondientes a 1.2 x 105 cuentas en total (para cada prueba).
  3. Preparar un tubo que contiene 1 μl de granos sin EV que servirá como control negativo, por la presente se refiere como "Granos".
  4. Ajustar el volumen a 100 μl con PBS x 1. Coloque el tubo en un termo-mezclador y agitar a 400 rpm durante la noche a 4 – 10 ° C.
  5. Al día siguiente, hacia las muestras a una placa de 96 pocillos de fondo redondo (o tubos FC).
  6. Añadir el anticuerpo (10 μg/mL de CD9_FITC, 10 μg/mL de CD63_PE y 5 μg/mL de CD81_PE).
  7. Incubar 1 h a 4 – 10 ° C.
  8. Añadir 100 μl de 1 x PBS a cada pocillo.
  9. Proceder a la adquisición.

5. adquisición

  1. Abra el software de adquisición y puesta en marcha del instrumento (citómetro > programa de inicio de sistema). Abra un nuevo experimento.
  2. Crear una plantilla de experimental y seleccione la placa y luego Añadir. Seleccione la posición de las muestras en la placa y luego pulse Establecer como muestra bien.
  3. Escriba el nombre de la muestra (es decir, CPC #1_CD9FITC) en las Reglas de nomenclatura. Abra la pestaña de canales y encienda el FITC y PE canales.
  4. Carga de la placa en el instrumento.
  5. Pulse Punto trama y crear un nuevo diagrama de punto (P1). Set adelante área de dispersión (FSC-A) versus el área de dispersión lateral (SSC-A).
  6. Seleccione iniciar para iniciar el láser y los fluidos. Prensa adquirir para iniciar la adquisición.
  7. Ajustar la escala para mostrar a la población en el medio de la P1. En P1 dibujar la puerta de "Granos" alrededor de toda la población (sin desechos) (figura 2A). Pulse Stop.
  8. Pulse Punto trama y crear un nuevo diagrama de punto (P2). Fijada delantero altura Scatter (FSC-H) versus la FSC-A. Puerta de la nueva trama de punto en "Granos." En P2 dibujar una puerta nueva en la población más grande y el nombre "Camisetas" (figura 2A).
    Nota: Esta estrategia está diseñada para evitar tanto como sea posible la inclusión de agregados de granos de la adquisición y análisis.
  9. Pulse Punto trazar y crear dos parcelas diferentes puntos; un FITC versus SSC-A y un PE versus SSC-A. Puerta de la nueva trama de punto en "Camisetas".
  10. Seleccione el número de eventos a registrar (por ejemplo, 20.000). Seleccionar registro y empezar el experimento.

6. Análisis de datos

  1. Cargar los archivos de adquisición en el software de análisis.
    Nota: Los pasos siguientes deben ser aplicado a cada muestra como sólo los granos y cada muestra desconocida.
  2. Abra un nuevo protocolo y crear parcelas de punto siguiendo la misma estrategia que se describe en el paso 5.
  3. Establecer los ejes de dispersión a escala lineal y todos los ejes de fluorescencia conectarse escala.
  4. Mostrar la media geométrica de la fluorescencia (X-Gmean-IMF) en FITC y PE canales.
  5. Calcular el cociente G Xmedia de las muestras / G Xmedio de los granos manchados con anticuerpo sin exosomas.
  6. Comparar el cambio de doblez MFI de diferentes preparaciones de EV.

7. titulación número vesícula extracelular

Nota: Las secciones 7 a 10 se puede realizar para configurar el número de partículas, la concentración de anticuerpos y la especificidad, pero puede omitirse si el tipo de célula, que se derivan EV, y anticuerpos siguen siendo los mismos.

  1. Diluir las partículas, obtenidas en el paso 2.3, en PBS 1 x para obtener una serie de suspensiones que van desde 5 x 105 a 2.5 x 108 partículas.
  2. Para cada suspensión añada en un tubo de fondo redondo 1 μl de piscina de bolas de captura.
  3. Seguir el protocolo de paso 4.3.

8. anticuerpos valoración

Nota: Titulación de anticuerpos se realiza mediante la adición de un anticuerpo individual para cada tubo.

  1. Mantener el número de EV (partícula total o proteico) constante en todas las muestras.
    Nota: El número apropiado se determina empíricamente como se describe anteriormente en la sección 7.
  2. Seguir el protocolo de pasos de 4.1 a 4.5.
  3. Probar una gama de concentraciones de anticuerpos por encima y por debajo de la cantidad recomendada por el proveedor. Por ejemplo, para un anticuerpo con una concentración sugerida de 10 μg/mL para prueba, prueba 1, 2, 5, 10, 20 y 50 μg/mL. Incluyen una muestra con los "granos", agregar la mayor concentración de anticuerpos.
  4. Incubar durante 1 h a 4 – 10 ° C.
  5. Añada 100 μl de 1 x PBS para cada muestra.
  6. Adquirir las muestras.

9. incubación

  1. Verificar el tiempo de incubación realizar adquisiciones en diferentes puntos temporales (p. ej., 1 h, 2 h y 5 h).
  2. Seguir el protocolo a partir de la sección 4.
  3. Incubar las muestras a 4 – 10 ° C durante 1 hora.
  4. Adquirir las muestras.
  5. Incubar las muestras a 4 – 10 ° C para 3 h.
  6. Adquirir las muestras.

10. Protocolo validación

  1. Enlace de EV
    1. En un tubo de fondo redondo, introducir la cantidad de volumen correspondiente a 1 x 108 partículas o la cantidad correspondiente de la proteína total.
    2. Ajustar el volumen a 100 μl con PBS x 1.
    3. Alterar la membrana EV por sonicación (alternativamente se puede aplicar un paso de choque de calor) según las instrucciones del fabricante. Establecer la frecuencia y la intensidad. El período de sonicación puede establecerse empíricamente establecer un experimento en curso del tiempo (es decir, 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etcetera.).
    4. Añadir 1 μl de la piscina de bolas.
    5. Seguir el protocolo a partir de paso 4.4.
  2. Especificidad del anticuerpo
    1. Preparar un tubo para cada IgG conjugado con fluorocromo y añadir el complejo de granos-EV, como se describe en el paso 4.6.
      Nota: El isotipo conjugado con fluorocromo debe coincidir con la IgG del anticuerpo usado.

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Resultados

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Número total de partículas de tinción simple

Puesto que un solo grano puede atar más de una partícula, probamos diferentes condiciones para establecer la menor cantidad de EV total (anticuerpo individual por tubo) para llegar a la fase exponencial temprana de curva de MFI. Una concentración fija de anticuerpo fue utilizada mientras que el número total de partículas entre 5 x 105 a 2.5 x 108...

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Discusión

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Técnica FC convencional sigue siendo el método analítico más sencillo caracterizar marcadores expresados en la superficie de EV. En este sentido, seleccionar el protocolo más apropiado es crucial para obtener información útil sobre fracciones de partículas individuales de interés evitando limitaciones debido a la sensibilidad del instrumento. Hemos descrito un método utilizando partículas magnéticas juntadas con anticuerpos que reconocen Exo y pequeño EV los antígenos superficiales que son convenientes para el uso de FC ...

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Divulgaciones

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Nada que declarar.

Agradecimientos

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L.B. fue apoyado por becas de investigación de Helmut Horten Stiftung y Velux Stiftung, Zurich (Suiza). G.V. fue apoyado por becas de investigación de la Swiss National Science Foundation, la Fundación Cecilia Augusta, Lugano y el SHK Stiftung für Kreislaufkrankheiten und Herz (Suiza)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex, plataforma de citómetro de flujoBeckman CoulterCytoFlex
DMEM, alto contenido de glucosa, HEPES, rojo sin fenolGibco21063045
Dulbecco's PBS (PBS) libre de Ca y MgLonzaBE17-512F
ExoCap CD63 Kit de capturaJSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 Capture KitJSR Ciencias de la VidaEx-C81-SP
ExoCap CD9 Kit de CapturaJSR Ciencias de la VidaEx-C9-SP
FBS con depleciónexosomas ThermofisherA2720801
Suplemento de medios FBS con depleción de exosomasSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Suero fetal bovinoGibco10270106
FITC anti-anticuerpo CD9 humanoBiolegend312104                    RRID: AB_2075894
Citómetro de flujo software de análisisBeckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
SoftwareNanoSight MalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anti-humano CD63 Anticuerpo Biolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE anti-humano CD81 (TAPA-1) AnticuerpoBiolegend349505                    RRID:AB_10642024
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 rotores
de

Referencias

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