Artículo de método

Pseudobactina high-throughput Screening de muestras ambientales: los tejidos, a granel suelos y rizosfera de suelos de la planta

DOI:

10.3791/59137

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9 de febrero de 2019

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1Department of Crop and Soil Sciences, Washington State University, 2Department of Plant Pathology, Washington State University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Presentamos un protocolo para la detección rápida de muestras ambientales para pseudobactina potencial contribuyendo a micronutrientes biodisponibilidad y volumen de ventas en sistemas terrestres.

Resumen

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Sideróforos (quelantes de compuestos del metal de bajo peso molecular) son importantes en el fenómeno ecológico diversos que van desde ciclo biogeoquímicos hierro (Fe) en los suelos, a la competencia de patógeno, promoción del crecimiento vegetal y Cruz-Reino de señalización. Además, sideróforos son también de interés comercial en biolixiviación y bioweathering de metal-minerales y los minerales. Un medio rápido, eficaz y robusto de evaluar cuantitativamente la producción de pseudobactina en muestras complejas es clave para la identificación de aspectos importantes de las consecuencias ecológicas de pseudobactina actividad, incluyendo, novela pseudobactina producir microbios. El método presentado aquí fue desarrollado para evaluar actividad de pseudobactina de comunidades del microbioma en el tacto, en muestras ambientales, tales como los tejidos de la planta o el suelo. Las muestras fueron homogeneizadas y diluidas en un medio modificado de M9 (sin Fe), y cultivos de enriquecimiento se incubaron por 3 días. Producción de pseudobactina se evaluó en las muestras a las 24, 48 y 72 horas (h) utilizar una microplaca de 96 pozos novela CAS (cromo azurol sulfonato)-ensayo de agar de Fe, una adaptación del método colorimétrico de evaluar pseudobactina tradicionalmente tedioso y lento actividad, el individuo cultiva cepas microbianas. Aplicamos nuestro método a 4 genotipos líneas de trigo (Triticum aestivum L.), incluyendo Lewjain, PI561725, Madsen y PI561727 comúnmente cultivadas en el Pacífico noroeste interior. Producción de pseudobactina fue afectado claramente por el genotipo de trigo y en los tipos específicos de tejidos vegetales observados. Hemos utilizado con éxito nuestro método para detectar rápidamente la influencia del genotipo de la planta en producción de pseudobactina, una función clave en los ecosistemas terrestres y acuáticos. Produjimos muchas repeticiones técnicas, produciendo diferencias estadísticas muy confiables en suelos y en los tejidos vegetales. Lo importante, los resultados muestran que el método propuesto puede utilizarse para examinar rápidamente la producción de pseudobactina en muestras complejas con un alto grado de fiabilidad, de manera que permite a las comunidades a preservarse para que trabajo posterior identificar taxones y genes funcionales.

Introducción

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Sideróforos son importantes biomoléculas implicadas principalmente en la quelación del hierro de biodisponibilidad, pero con una amplia gama de propósitos adicionales en ecosistemas terrestres y acuáticos, desde la microbiana quórum sensing, señalización a microbianas-anfitriones de la planta, promoción del crecimiento vegetal, la cooperación y competición dentro de las comunidades microbianas complejas1,2. Sideróforos pueden ampliamente clasificarse según sus sitios activos y características estructurales, creando cuatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate y mezclado tipo3,4. Muchos microorganismos son capaces de excretar más de un tipo de pseudobactina5 y en comunidades complejas, una gran mayoría de organismos sintetizar los receptores de membrana para permitir la absorción de una variedad aún más amplia de sideróforos1, 6. Trabajo reciente indica que los sideróforos son particularmente importantes en el nivel de la comunidad e incluso en el Reino entre comunicaciones y transferencias biogeoquímicas7,8,9,10 ,11.

Cromo azurol sulfonato (CAS) se ha utilizado por más de 30 años como un agente quelante para enlazar el hierro (Fe) de tal manera que la adición de ligandos (es decir, sideróforos) puede resultar en la disociación del complejo CAS-Fe, creando un cambio de color fácilmente identificable en el medio 12. cuando el CAS está ligada con la Fe, el tinte aparece como un color azul real, y como se disocia el complejo de CAS-Fe, el medio cambia de color según el tipo de ligando utilizado para compactar la Fe13. El medio inicial, base líquida establecido por Schwyn y Neilands en 1987, se ha modificado de muchas maneras para cambiar microbiana objetivos14, hábitos de crecimiento y limitaciones15, así como una variedad de metales además de Fe, incluyendo aluminio, manganeso, cobalto, níquel cadmio, litio, zinc16, cobre17e incluso arsénico18.

Muchos patógenos humanos, así como microorganismos de promoción de crecimiento (PGPM) han sido identificados como organismos productores de pseudobactina3,19,20y rizosfera importante y endófitos PGPM a menudo prueba positivo para la producción de pseudobactina4. El método líquido basado en la Fe tradicional se ha adaptado para microtitulación pruebas de aislamientos en cultivo para producción de pseudobactina21. Sin embargo, estas técnicas no reconocer la importancia de la comunidad microbiana en su totalidad (microbioma), en cooperación y regulación potencial de pseudobactina producción en suelos y sistemas de planta22. Por esa razón, hemos desarrollado una evaluación de nivel de la comunidad de alto rendimiento de pseudobactina producción de un entorno dado, basado en el análisis tradicional de CAS, pero con replicación, facilidad de medición, fiabilidad y repetibilidad en una microplaca ensayo.

En este estudio, se presenta un análisis de CAS-Fe rentable, de alto rendimiento para la detección de pseudobactina producción para evaluar el enriquecimiento de la producción de pseudobactina de muestras complejas (es decir, suelo y planta de homogenados de tejido). Suelo de la rizosfera a granel, limite y firmemente enlazado (en términos de cómo la tierra estuvo limitada a la raíz) se obtuvieron junto con grano, disparar y los tejidos de la raíz de cuatro genotipos distintos de trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, y PI561727. Fue presumido que diferencias fundamentales en los genotipos de trigo podrían resultar en diferencias en el reclutamiento y selección de pseudobactina comunidades productoras. De particular interés es la diferencia entre las comunidades microbianas asociadas con la línea isogénicas de PI561725, que es de aluminio tolerante porque posee ALMT1 (aluminio activación malato Transporter 1), en comparación con el aluminio sensible PI561727 isogénicas línea, que posee una forma sensible sin aluminio del gene, almt123,24,25,26. El objetivo principal del estudio fue desarrollar un método sencillo y rápido de evaluar cuantitativamente pseudobactina producción en cultivos de enriquecimiento pseudobactina de tipos de muestras complejas mientras que preserva las culturas para el trabajo futuro.

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Protocolo

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Nota: Ubicación del sitio de campo: Universidad Estatal de Washington, planta patología granja (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 57,4 ' 04" W). Las semillas se sembraron con una sembradora mecánica en 19 de octubre de 2017. Cada genotipo de trigo se sembró en headrows, aproximadamente 1 metro de distancia para evitar la superposición del sistema radicular. Se recolectaron muestras de suelo y planta en 09 de agosto de 2018, cuando las plantas estaban listas para la cosecha. Las muestras fueron recogidas de tres repeticiones de cuatro genotipos de trigo: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. preparación de medio M9 modificado

  1. Uso Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL) y NaCl (0,5 g/200 mL) y NH4Cl (1 g/20 mL) reactivos para preparar la solución de sal de M9.
  2. Utilizar 18 g de MgSO4∙7H2O en 100 mL de agua doble desionizada (ddH2O) para preparar 0,75 M MgSO4∙7H2O.
  3. Hacer de 1 M de CaCl2∙2H2O añadiendo 14,7 g de CaCl2∙2H2O con 100 mL de ddH2O.
  4. Preparar la solución amortiguadora disolviendo 6,048 g de pipas en 156 mL de ddH2O con agitación. Ajustar el pH a 6.8 con NaOH M 5.
  5. Preparar 20% glucosa (dextrosa monohidrato) disolviendo 20 g de glucosa en 100 mL de ddH2O.
  6. Preparar soluciones y autoclave todos individualmente sino la glucosa. Filtro de esterilizar la solución de glucosa para la adición a los medios de comunicación de M9 después de autoclave (0,22 μm).
  7. Preparar el medio M9 modificado mezclando 156 mL de solución tampón PIPES, 40 mL de solución de sales M9, 20 μL de solución de CaCl2·2H2O y 266 μL de MgSO4·7H2O 4 mL de soluciones de glucosa 20% en la seguridad de la biotecnología gabinete, usa técnica estéril.
  8. Para la preservación de la M9 modificado, sellar el recipiente, cubrir con papel de aluminio para proteger de rayos UV y colocar a 4 ° C.

2. preparación del medio Agar-Fe-CAS

  1. Ácido lavar toda la cristalería en HCl/100 100 mM m m HNO3 durante al menos 2 h antes de la utilización en el ensayo de CAS.
  2. Preparar una bandeja para hornear de aluminio llenado de arena de grado laboratorio y cubrirla con papel de aluminio. Autoclave a 121 ° C durante 30 minutos y apartar.
  3. Prepare HDTMA (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) añadiendo 0,0365 g 20 mL ddH2O y coloque la solución a 37 ° C para promover la solubilización.
  4. Preparar 10 mM HCl y generar 1 mM FECLAS3·6H2O con 10 mM HCl como el solvente. Añadir 0,0302 g de CAS a 25 mL de ddH2O agitando suavemente con una barra de agitación magnética estéril. Luego añadir 5 mL de FECLAS3·6H2O (en 10 mM HCl) 1 m m a 25 mL de solución de CAS sin dejar de revolver suavemente (la solución se convierte en color negro rojizo oscuro).
  5. Lentamente agregar los 20 mL de solución de HDTMA agitando suavemente, en la solución de Fe-CAS (esto produce una solución azul oscurezca).
  6. Preparar la solución amortiguadora disolviendo 15,12 g de pipas en 375 mL de ddH2O, con agitación suave. Ajustar el pH a 6.8 con NaOH M 5. Añadir agua para llevar el volumen a 450 mL. Añadir 5 g de agarosa a la solución. Autoclave los tubos buffer solución y la solución de CAS-Fe a 121 ° C durante 30 minutos.
  7. Agregue cuidadosamente la totalidad de la solución de CAS-Fe para la totalidad del Buffer PIPES en el gabinete de seguridad biológica después de cada uno de ellos es esterilizado.
  8. Coloque la solución mezclada en un baño de agua a 50 ° C.
    Nota: Recién preparar todos los reactivos en el medio de CAS-Fe-Agar antes de cada ensayo, como almacenamiento a largo plazo en resultados de 50 ° C en la precipitación de los resultados complejos y enfriamiento de CAS-Fe en medio solidificado.
  9. Coloque un bote estéril reactivo en la arena estéril en el gabinete de seguridad de la biotecnología y calentar a 50 ° C. Transferencia del CAS-Fe-Agar para el barco, y luego rápidamente alícuotas de 100 μl a cada pocillo de una microplaca de 96 pozos de clara, fondo plano, estéril.

3. preparación estándar Pyoverdine/EDTA

  1. Preparación del pyoverdine
    1. Preparación estándar de pyoverdine de 800 μM (mezcla de ácido succínico, glutaramide 2-hidroxi y succinaminde formas del pyoverdine-véase Tabla de materiales), en medio de M9 modificado previamente preparado.
    2. Diluir esta solución en 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 μM soluciones.
  2. Preparación estándar de EDTA
    1. Añadir 0,594 g del ácido etilendiaminotetracético disódico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2 h2O), a 500 mL de medio de M9 modificado previamente preparado para preparar estándar de EDTA 3200 μM.
    2. Diluir esta solución en 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 soluciones μM.
  3. Generación de la curva estándar
    1. Añada 100 μL de cada concentración del pyoverdine y EDTA para separar los pocillos de una microplaca de 96 pocillos con 100 μL de medio de Agar CAS-Fe. Hacer duplicados técnicos repeticiones de cada concentración. También, añadir pozos en blanco con solamente M9 (no EDTA o pyoverdine).
    2. Usando un lector de microplacas, medir la absorbancia (a 420 nm y 665 nm) después de 1, 6 y 24 h de incubación a 22 ° C y las medidas de absorbancia de uso para generar curvas estándar.
      Nota: Para mediciones de 420 nm, restar la absorbancia del blanco de la absorbancia del pyoverdine o pozos que contienen EDTA. Para 665 nm, restar la absorbancia del pyoverdine o EDTA con pozos de absorción de espacios en blanco. Entonces, log10(μm pyoverdine o EDTA) se regresa contra las medidas de absorbancia. Para facilitar la interpretación de los resultados de la muestra, usar la absorbancia como el eje x y log10(μm pyoverdine o EDTA) como el eje y.

4. colección de muestras ambientales: tejidos de suelo y planta

  1. Lavar equipos de muestreo (palas y tijeras) con 0.22 μm filtrado ddH2O seguido de etanol al 70% y limpiar con toallas de papel antes de muestreo y entre muestras para mantener una técnica estéril y reducir la contaminación cruzada.
  2. Suprimir los tejidos de la planta (granos y brotes) de las plantas en el campo y colocarlos en una bolsa de plástico etiquetadas, dejando suficiente rastrojo de sesión para facilitar el desarraigo de las muestras de suelo y la raíz deseadas.
  3. Excavar a una profundidad de raíz pequeña bola aproximadamente 15 cm y 23 cm de ancho y colóquelo en una bolsa de plástico aparte, rotulada para preparación de muestras en el entorno de laboratorio. Este paso es similar a los métodos de McPherson et al27.
  4. Colocar todas las muestras (granos, brotes, a granel tierra y cepellones en bolsas separadas) directamente en el hielo y conservar a 4 ° C hasta que se procesan las muestras para el ensayo de producción de pseudobactina.
  5. Separar las muestras de suelo de raíz asociado a granel, suelo de rizosfera de-limite y suelo de la rizosfera limitan firmemente.
    1. Sacar los cepellones de las bolsas. Sacuda suavemente el suelo de la bola de la raíz. Sacudido el suelo, junto con el suelo izquierda en la bolsa comprende el suelo "a granel".
    2. Utilice un mazo de goma para más quitar la suciedad de la pelota de la raíz. Este es el suelo de rizosfera de-limite.
    3. Generar suelo de la rizosfera limitan fuertemente las raíces con la muestra firmemente enlazado y colocarlos en un tubo de centrífuga. Añadir 30 mL de ddH2O y de vortex durante 2-3 minutos. Quite las raíces para obtener la dilución de la mezcla de suelo rizosfera limitan firmemente.

5. preparación de pseudobactina cultivos de enriquecimiento y análisis de producción de pseudobactina CAS-Fe

Nota: Toda la cristalería debe lavado antes de comenzar con los ensayos de ácido.

  1. Preparación de muestras de suelo (para cada uno de los tipos de muestra de suelo de tres)
    1. Homogeneizar cada muestra de suelo dentro de la bolsa de la muestra, mezclando y convirtiendo el suelo tanto como sea posible sin necesidad de abrir la bolsa.
      Nota: Esto ayuda a reducir la variabilidad espacial de suelos naturales y se alinea con procedimientos de muestreo de suelo normal. Otros métodos pueden utilizarse para homogeneizar muestras ambientales, según el caso y dependiendo del diseño experimental.
    2. Después de cada muestra ha sido muy bien mezclada, alícuota y suspender 2,0 g de cada suelo en 20 mL de medio M9 modificado, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
    3. Para las muestras de la rizosfera limitan firmemente, añadir 2 mL de la mezcla de suelo de rizosfera a 20 mL de medio M9 modificado, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
  2. Preparación de muestras (raíz, brote y grano) de tejido
    1. Superficie de esterilizar la muestra con etanol al 70%. Macerar 2,0 g de tejido fresco en 20 mL de medio M9 modificado usando una licuadora en alta durante 30 segundos. Transferir la muestra a un tubo de centrífuga estéril 50 mL, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
  3. Enriquecimiento de pseudobactina producción a través de la limitación de la Fe
    1. Incubar los tubos de centrífuga de 50 mL a temperatura ambiente y agite a 160 rpm.

6. ensayos de agar CAS-Fe para la detección de la producción de pseudobactina en muestras ambientales

  1. A las 24, 48 y 72 h después de iniciar la cultura del enriquecimiento, sacar submuestras de 1 mL de los tubos de enriquecimiento utilizando una técnica estéril y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min en tubos de centrífuga de 2 mL para granular en las células.
  2. Recoger el sobrenadante separado. Utilizando una técnica estéril, añada 100 μL del sobrenadante a 100 μL solución de CAS-Fe-Agar duplicado o triplicado en la microplaca. También añadir 100 μl de medio M9 estéril (como espacios en blanco). Luego incubar la placa a 28 º C.
  3. Suspender el resto del sobrenadante y pellet para cada muestra (no ha añadido a la placa de microtitulación) en su el propios, tubo de centrífuga estériles de 2 mL. Añadir 400 μL de glicerol estéril en cada tubo de muestra sobrenadante y resuspender el precipitado para crear acciones de glicerol. Congele la acción a-80 ° C para posteriores análisis.
    Nota: Este paso puede ser modificado para generar acciones de glicerol según cualquier protocolo interno recomendado:.
  4. Medir la absorbancia a las 6, 24, 48 y 72 h, a longitud de onda de 420 nm.
  5. Use curvas estándar generadas del pyoverdine o EDTA para interpretar las mediciones de absorbancia de la muestra en términos de equivalentes del pyoverdine.
    Nota: Pyoverdine fue determinada para ser un estándar superior en comparación con el EDTA (vide infra), por lo que el EDTA no se utilizó para interpretar los resultados en el estudio actual.

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Resultados

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Un pyoverdine mezcla biosynthesized por Pseudomonas fluorescens fue utilizado como un estándar para interpretar y cuantificar la absorbancia (a 420 nm) de las muestras en términos de equivalentes de pyoverdine en μm. la figura 1 muestra la relación entre la absorbancia (420 nm) y a partir de la concentración del pyoverdine (molaridad de Log10 en μm). EDTA no presentó un nivel adecuado porque muestras expuestas medidas de absorbancia mayor ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El principal resultado de este trabajo es la producción de una nueva metodología que puede utilizarse para enriquecer rápidamente para producir microbios y cuantitativo de medición pseudobactina producción y actividad en la muestra ambiental de pseudobactina. La metodología es rápida, sencilla y rentable, y los resultados muestran cómo puede ser utilizado para detectar actividad de pseudobactina de tipos de muestras complejas y novedosas (por ejemplo., tejido de suelo y planta). El protocolo también da como resu...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Kalyani Muhunthan por asistencia en procedimientos de laboratorio, Lee Opdahl para la cosecha de genotipo de trigo, el Consejo de investigación de Washington estado uva Concord y la Washington State University Center para mantener la agricultura y Concesión de recursos naturales para un BIOAg para apoyar este trabajo. Financiación adicional fue proporcionada por la USDA/NIFA a través del proyecto 1014527 de la portilla.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaApexLF451320014
Molde
Papel de aluminio Cloruro
amonio, granularFiesher Scientific152315A
Autoclave y esterilizadorThermo Scientific
Cloruro de calcio dihidratadoFiesher Scientific171428
CAS (Cromo Azurol S)Chem-Impex Int'l Inc)000331-27168
Dextrosa monohidrato (glucosa), polvo cristalinoFiesher Scientific1521754
EDTA, sal disódica, dihidratado, cristalJ.T.BakerJI2476
glicerol, anhidroBaker analizadoC22634
HDTMA (cetiltrimetilammonio Reactivo de bromuroWorldFZ0941
Ácido clorhidratadoACROS OrgánicoB0756767
Infinito Lector de placas M200 PRO(III) HEXAHIDRATADO TECAN
, 99 %ACROS Campana
ThermoScientific
Incubadora de laboratorioVWR Scientific
Sulfato de magnesioFiesher Scientific27855
Ácido nírico, (69-70)%J.T.Baker72287
Tampón PIPES, 98.5%ACROS Fosfatode potasio A0338723
dibaisc, polvoJ.T.BakerJ48594
PyoverdineSIGMA-ALDRICH078M4094V
Arena
SI-600R ShakerLab Companion
Cloruro de sodio, granularFiesher Scientific136539
Hidróxido de sodio, pelletsJ.T.BakerG48K53
Fosfato de sodio, heptahidratado dibásico, 99%ACROS OrgánicoA0371705
de aluminio para hornear de Cloruro de hierro extractora de laboratorio de A0342179 orgánicoorgánico,

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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