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Artículo de método

Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

8.3K vistas

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DOI:

10.3791/59161

⸱

6 de agosto de 2019

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

En este artículo

Resumen

Aquí, los protocolos para realizar imágenes de tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) de tres animales invertebrados marinos se explican en detalle. Este estudio describe los pasos tales como la fijación de muestras, la tinción, el montaje, el escaneo, la reconstrucción de imágenes y los análisis de datos. También se proporcionan sugerencias sobre cómo se puede ajustar el protocolo para diferentes muestras.

Resumen

Tradicionalmente, los biólogos han tenido que depender de métodos destructivos como la sección para investigar las estructuras internas de los organismos opacos. La tomografía computarizada por rayos X de microfoco no destructivo (microCT) se ha convertido en un protocolo potente y emergente en biología, debido a los avances tecnológicos en los métodos de tinción de muestras e innovaciones en hardware de microCT, computadoras de procesamiento y datos software de análisis. Sin embargo, este protocolo no se utiliza comúnmente, como lo es en los campos médico e industrial. Una de las razones de este uso limitado es la falta de un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios: recolección de muestras, fijación, tinción, montaje, escaneo y análisis de datos. Otra razón es la gran diversidad de metazoos, particularmente invertebrados marinos. Debido a los diversos tamaños, morfologías y fisiologías de los invertebrados marinos, es crucial ajustar las condiciones experimentales y las configuraciones de hardware en cada paso, dependiendo de la muestra. Aquí, los métodos de imágenes microCT se explican en detalle utilizando tres invertebrados marinos filogenéticamente diversos: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). También se proporcionan sugerencias sobre la realización de imágenes microCT en varios animales.

Introducción

Los investigadores biológicos generalmente han tenido que hacer secciones delgadas y realizar observaciones por microscopía ligera o electrónica con el fin de investigar las estructuras internas de los organismos opacos. Sin embargo, estos métodos son destructivos y problemáticos cuando se aplican a especímenes raros o valiosos. Además, varios pasos en el método, como la incrustación y la sección, consumen mucho tiempo, y pueden tardar varios días en observar una muestra, dependiendo del protocolo. Además, al manipular numerosas secciones, siempre existe la posibilidad de dañar o perder algunas secciones. Las técnicas de limpieza de tejidos están disponibles para algunos especímenes1,2,3,4,5, pero todavía no son aplicables para muchas especies animales.

Para superar estos problemas, algunos biólogos han comenzado a utilizar la tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) imágenes6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. En la TC de rayos X, la muestra es irradiada con rayos X desde varios ángulos que se generan a partir de una fuente de rayos X que se mueve alrededor de la muestra, y los rayos X transmitidos son monitoreados por un detector que también se mueve alrededor de la muestra. Los datos de transmisión de rayos X obtenidos se analizan para reconstruir imágenes transversales de la muestra. Este método permite la observación de estructuras internas sin destrucción de la muestra. Debido a su seguridad y facilidad, se utiliza comúnmente en aplicaciones médicas y dentales, y los sistemas de TC se pueden encontrar en hospitales y centros dentales de todo el mundo. Además, la TC de rayos X industrial se utiliza con frecuencia para observar muestras no médicas para inspección y metrología en el campo industrial. A diferencia de la TC médica, en la que la fuente de rayos X y los detectores son móviles, las dos partes se fijan en TC industrial, con la muestra girando durante el escaneo. La TC industrial generalmente produce imágenes de mayor resolución que la TC médica y se conoce como microCT (resolución a nivel de micrométrico) o nanoCT (resolución a nivel de nanómetro). Recientemente, la investigación con microCT ha aumentado rápidamente en diversos campos de la biología14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Los estudios biológicos que utilizan CT inicialmente se dirigió a estructuras internas que consisten principalmente en tejido duro, como el hueso. Los avances en las técnicas de tinción utilizando diversos agentes químicos permitieron la visualización de tejidos blandos en diversos organismos6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. De estos reactivos, los agentes de contraste a base de yodo son relativamente seguros, baratos y se pueden utilizar para la visualización de tejidos blandos en diversos organismos7,14. En cuanto a los invertebrados marinos, la microCT hasido ampliamente utilizada en animales como los moluscos 6,25,32,33, anélidos18,19, 20 , 28, y arthorópodos21,23,29,31. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre otrasphyla animales, como bryozoans 6, xenacoelomorphs26,y cnidarios24,30. En general, se han realizado menos estudios con microCT en invertebrados marinos que en los vertebrados. Una de las principales razones de este uso limitado de los invertebrados marinos es la gran diversidad observada en estos animales. Debido a sus diversos tamaños, morfologías y fisiologías, cada especie reacciona de manera diferente a diferentes procedimientos experimentales. Por lo tanto, es crucial durante la preparación de la muestra elegir el reactivo de fijación y tinción más adecuado, y establecer las condiciones en cada paso, ajustado para cada especie. Del mismo modo, también es necesario establecer las configuraciones de escaneo, como el método de montaje, voltaje, corriente, velocidad de aumento mecánica y la potencia de resolución de espacio, adecuadamente para cada muestra. Para superar este problema, es esencial un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios, explica cómo se puede ajustar cada paso dependiendo de la muestra, y muestra ejemplos detallados de múltiples muestras.

En el presente estudio, describimos el protocolo de imágenes microCT paso a paso, desde la fijación de muestras hasta el análisis de datos, utilizando tres especies de invertebrados marinos. Los especímenes de la anémona de mar Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) fueron recogidos cerca de la Estación Biológica Marina misaki, Universidad de Tokio. Tenían un cuerpo esférico y suave de unos 2 cm de diámetro (Figura1A-C). También se recogieron muestras de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) cerca de la Estación Biológica Marina de Misaki. Eran gusanos delgados de unos 1,5 cm de longitud, con chaetas duras presentes a lo largo de todo el cuerpo (Figura1D). Un espécimen Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fue recolectado cerca del Centro de Investigación Marina Shimoda, Universidad de Tsukuba, durante el 13o Estudio Conjunto de Organismos Costeros de JAMBIO. Era un gusano de cuerpo suave que tenía aproximadamente 0,8 cm de longitud (Figura1E). Los ajustes realizados para las condiciones y configuraciones de cada muestra se explican en detalle. Nuestro estudio proporciona varias sugerencias sobre cómo realizar imágenes microCT en invertebrados marinos, y esperamos que inspire a los biólogos a utilizar este protocolo para su investigación.

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Protocolo

1. Fijación

  1. Para Actinia equina,relajar a los animales en 10% MgCl2 agua de mar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera al 70% de etanol y almacene a temperatura ambiente.
  2. Para Harmothoe sp., anestesiar a los animales colocándolos en agua de mar helada durante unos 15 minutos. Traslado a una solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar y almacenar a temperatura ambiente.
  3. Para Xenoturbella japonica,relaja al animal usando 7% MgCl2 en agua dulce. Fijar en 4% paraformaldehído (PFA) en agua de mar filtrada durante la noche. Colocar en 70% etanol y almacenar a 4oC.
    ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.

2. Tinción

  1. Transfiera las muestras al 50% de etanol y guárdelas a temperatura ambiente durante 15 h. Reemplace el 50% de etanol por etanol al 25% y guárdelas a temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Esto no es necesario para la muestra Harmothoe sp. en solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar.
  2. Sustituya la solución por agua destilada (DW) y guarde las muestras en DW a temperatura ambiente durante 2 h. Repita este paso tres veces.
  3. Prepare un 25% de la solución de Lugol diluyendo la solución en stock (abajo) al 25% con DW. La solución de stock (solución 100% Lugol)contiene 10 g de KI y 5 g de I 2, ajustada a 100 ml con DW.
    NOTA: La solución Lugol es sensible a la luz, por lo que debe almacenar y manipular la solución protegida de la luz. Siga las regulaciones de cada país e institución para la manipulación de yodo y la eliminación de residuos.
  4. Decantar el DW de las muestras y verter en la solución de Lugol 25%. Mancha durante 24 h a temperatura ambiente.

3. Montaje en etapa

  1. Preparar el 0,5% de agarosa disolviendo 500 mg de agarosa en 100 ml de DW en un matraz cónico de 250 ml en microondas (800 W, aproximadamente 1-3 min). Enfriar a unos 30-40 oC manteniendo a temperatura ambiente.
    ADVERTENCIA: No sobrecaliente ni selle completamente el matraz al calentar para evitar que la agarosa hierva.
  2. Monte muestras grandes como A. equina utilizando un tubo de 50 ml.
    NOTA: Utilice tubos de 50 ml para montar muestras grandes que no encajen en una punta azul de micropipeta de 1.000 ml.
    1. Coloque la muestra teñida en un plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.
    2. Vierta suavemente 5 ml de agarosa al 0,5% en un tubo de 50 ml y endurezca la agarosa sobre hielo. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.
    3. Añadir suavemente 20 ml de agarosa al tubo de 50 ml y colocar sobre hielo hasta que la agarosa comience a endurecerse. Coloque el espécimen dentro de la agarosa del 0,5% usando fórceps. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.
    4. Ajuste la posición y la orientación de la muestra con fórceps y endurezcan la agarosa sobre hielo.
    5. Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque el tubo de 50 ml en la arcilla (Figura2A).
  3. Monte muestras pequeñas como Harmothoe sp. y X. japonica usando una punta de micropipeta 'azul' de 1.000 l.
    NOTA: Para muestras más pequeñas, se puede utilizar una punta 'amarilla' de micropipeta de 200 l. En este caso, utilice 30 s de agarosa para el tapón y agregue 200 l de agarosa o agua destilada.
    1. Dibuje 100 sl de agarosa al 0,5% en una punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml y endurezca la agarosa sosteniendo la punta sobre el hielo, haciendo un tapón en la punta (Figura2B-a).
    2. Decantar la muestra manchada en un plato de 60 mm sin usar fórceps.
    3. Transfiera suavemente la muestra utilizando pinzas de anillo en otro plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.
    4. Añadir 1.000 l de agarosa o DW al 0,5% de agarosa o DW en la punta enchufada (paso 3.3.1) con un micropipeta.
      NOTA: Se recomienda el uso de agarosa al 0,5%, pero utilice DW para muestras frágiles o preciosas en las que se debe evitar la agarosa.
    5. Transfiera suavemente la muestra de la placa de 60 mm a la agarosa o DW en la punta enchufada utilizando pinzas de anillo.
    6. Ajuste suavemente la posición y la orientación de la muestra con una aguja peciolada o pinzas de precisión. Tenga cuidado de no hacer burbujas en el medio de montaje. Asegúrese de que la muestra es estable entre las paredes de la punta cuando DW se utiliza como medio de montaje (Figura2D-b). Coloque la punta sobre hielo para endurecer la agarosa si se utiliza como medio de montaje.
    7. Corte la punta de una nueva punta 'azul' de micropipeta de 1.000 l (Figura2B-b,c)e inserte la punta de la punta enchufada en la nueva punta.
    8. Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque las puntas con la muestra en el interior de la arcilla (Figura2C,D).
      NOTA: La solución de tinción comenzará a lavar la muestra una vez que se coloca en DW, así que continúe con el siguiente paso de escaneo con prontitud.

4. Escaneo de MicroCT

  1. Encienda el haz de rayos X a 80 kV, 100 oA.
  2. Mientras observa la imagen de transmisión de rayos X en el centro de la pantalla (Figura3A), mueva el escenario para que se pueda ver toda la muestra haciendo clic en los botones de los ejes X y Z (Figura3A)y manualmente ajustando la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Establezca el contraste de la imagen para que las estructuras internas puedan observarse ajustando las condiciones de contraste (Figura3A: Contraste de imagen).
  3. Ajuste la orientación de la muestra cambiando el ángulo del tubo/punta en la arcilla (Figura 2A). Gire la etapa 90o estableciendo el eje de rotación (Figura3A) en 90 y haciendo clic en el botón de movimiento relativo (Figura3A). Realiza la misma maniobra cuatro veces para completar una rotación completa.
    NOTA: Apague manualmente el haz de rayos X cada vez que se abra la puerta de muestra, a menos que el sistema lo apague automáticamente.
  4. Mueva el escenario para que la muestra esté en el centro de la vista haciendo clic en el botón del eje Z (Figura3A) y ajustando manualmente la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Gire el escenario 90o y haga lo mismo. Gire el escenario 360o y compruebe que la muestra está en el centro de la vista desde todas las direcciones.
  5. Mueva el escenario a lo largo del eje X hacia la fuente del haz de rayos X haciendo clic en el botón Eje X (Figura3A) para ampliar la muestra y ajustarla según sea necesario para que solo encaje en la vista (Figura3C).
  6. Gire el escenario 360o y ajuste según sea necesario para que la muestra se ajuste a la vista desde todas las direcciones.
  7. Ajuste las condiciones de escaneado como se muestra en la Tabla1.
  8. Comience a escanear; toma unos 10 minutos.

5. Reconstrucción de la imagen

  1. Inicie el software de accesorios del sistema microCT (consulte la Tabla de materiales)y abra los datos escaneados.
  2. Ajuste las diferencias en el eje de rotación de la muestra durante el escaneo haciendo clic en el botón de cálculo del valor de desplazamiento automático (Figura4A: cuadro verde).
  3. Ajuste la orientación de la imagen girando las flechas naranjas (Figura4B). Si se ha cambiado la orientación, repita el paso 5.2.
  4. Haga clic en la pestaña de área (Figura4C: caja magenta) y recorte las áreas donde las muestras no están presentes (Figura4C: caja amarilla).
  5. Haga clic en la pestaña de reconfiguración (Figura4D:cuadro magenta) y establezca los filtros de la siguiente manera para eliminar el ruido. Filtro de reducción de artefacto de anillo: Filtro mediano -3; Filtro de eliminación de ruido: Filtro promedio-1.
  6. Realice la reconfiguración haciendo clic en el botón de reconfiguración (Figura4D: cuadro verde).
  7. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen estableciendo los valores en blanco y negro como valor negro 0, valor blanco 250 (Figura4D:cuadro azul).
  8. Guarde el dataset de imagen TIFF reconstruido como un TIFF de 8 bits haciendo clic en el botón Guardar. Cambie el nombre de los archivos TIFF de la siguiente manera: Date_sample_resolution (m)_number.tiff.
    NOTA: Los conjuntos de datos microCT originales de este estudio están disponibles en el repositorio de Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Análisis de datos

  1. Inicie el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales)y habilite la importación de archivos TIFF haciendo clic en el icono Base de datos (Figura5A:cuadro magenta) y desactivando el cuadro que se muestra en la Figura 5B.
  2. Haga clic en el icono de importación (Figura5C:cuadro magenta), seleccione el conjunto de datos guardado en la sección 5 y haga clic en Abrir.
  3. Haga clic en el botón Copiar vínculos (Figura5D) para importar los datos.
  4. Muestre la sección transversal 2D haciendo clic en el icono del visor 2D (Figura5C:cuadro azul).
  5. Calibre el conjunto de datos haciendo clic en la pestaña Visor 3D (Figura5E: cuadro magenta) e introduciendo el valor de resolución en el escaneo (que era 0.018 en este estudio [Figura 5F]).
  6. Haga clic en el icono de brillo/contraste (cuadro verdede la figura 5E). Ajuste el brillo y el contraste moviendo el cursor dentro de la imagen 2D mostrada y cambiando el nivel de la ventana y el ancho de la ventana (Figura5G).
  7. Compruebe otras imágenes transversales moviendo la barra de desplazamiento (figura5G: caja).
  8. Cambie la orientación de la sección transversal haciendo clic en el icono de orientación (Figura5E: cuadro azul) y compruebe las imágenes en todas las orientaciones (Figura5H).
  9. Haga clic en la imagen mostrada y elija la pestaña de exportación para almacenar imágenes de sección transversal.

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Resultados

Realizamos imágenes microCT en A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) después de manchar las muestras con 25% de solución lugol. La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de los tejidos blandos internos (Figura6). Junto con informes anteriores6,7,<...

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Discusión

Se sabe que los fijadores que utilizan formalina, como la solución de formalina del 10% (v/v) en el agua de mar utilizada en este estudio, preservan la morfología de diversos invertebrados marinos y se utilizan a menudo para imágenes microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Sin embargo, las restriccio...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Toshihiko Shiroishi por su ayuda y por proporcionar el entorno de investigación durante este estudio. Agradecemos a Kensuke Yanagi y Takato Izumi por el asesoramiento sobre A. equina,y Masaatsu Tanaka por consejos sobre el espécimen Harmothoe sp. Nos gustaría agradecer al personal del Centro de Investigación Marina de Shimoda, universidad de Tsukuba, y de la Estación Biológica Marina misaki, la Universidad de Tokio, por su ayuda en colecciones de muestras. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés. Este trabajo fue apoyado por la JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) a HN, y JAMBIO, Asociación Japonesa de Biología Marina.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraz Erlenmeyer de 250 mlCorningCLS430183
5 ml Tubo de muestreo ST-500BIO-BIK103010
50 ml Tubo de polipropilenoGreiner Bio One International227261
60 mm Plato sin tratarIWAKI1010-060
AgarosaPromegaV3125
Punta de grado ecológico (azul) 1000 y micro; lBMBioBIO1000RF
EtanolWako Industrias Químicas Puras057-00451
FormalinaWako Industrias Químicas Puras061-00416
YodoWako Industrias Químicas Puras094-05421
Cloruro de magnesio hexahidratadoWako Industrias Químicas Puras135-00165
Visor DICOM OsiriXPixmeo SARLOsiriX MD v10.0
https://www.osirix-viewer.com ParaformaldehídoWako Pure Chemical Industries163-25983
Aguja peciolatoAS ONE2-013-01
Micropipeta Pipetman P200GILSONF123601
Pipetman P1000 MicropipetaGILSONF123602
Yoduro de potasioWako Pure Chemical Industries166-03971
Pinzas de precisión 5DUMONT0302-5-PS
QuickRack MultI punta de ajuste (amarillo) 200 ulSorenson10660
Hojas de afeitarFeatherFA-10
Pinzas de anilloNAPOXA-26
Microscopio estereoscópicoLeicaMZ95
sistema de imagen de micro-TC de rayos XComscantechnoScanXmate-E090S105

Referencias

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