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Artículo de método

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

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DOI:

10.3791/59163

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20 de marzo de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Resumen

En el sistema nervioso, la mielina es una estructura compleja de la membrana generada por myelinating glial de las células, que axones ensheathes y facilita la conducción eléctrica rápido. Alteración de la mielina se ha demostrado para ocurrir en varias enfermedades neurológicas, donde se asocia con déficits funcionales. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una ex modelo vivo que consiste en rodajas cerebelosa organotypic de ratón, que se pueden mantener en cultivo por varias semanas y aún más ser etiquetado para visualizar la mielina.

Introducción

Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal1. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en sistema nervioso periférico (PNS). Tanto en el SNC y el SNP, axoglial interacciones conducen a la formación de dominios especializados de axonales: los nodos de Ranvier y sus alrededores de dominios los paranodes y juxtaparanodes2. Los segmentos axonales aislados por mielina o entrenudos, alternas con los nodos de Ranvier, que corresponden a pequeños dominios unmyelinated enriquecidos en canales voltaje-bloqueados del sodio (Nav). La alta concentración y rápida activación de canales de Nav en los nodos de Ranvier permiten la regeneración de los potenciales de acción y junto con las propiedades aislantes de las vainas de mielina, garantizar la eficiente y rápida de saltatoria conducción de la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón3.

Además de su papel en la aceleración de la velocidad de conducción del impulso nervioso, glia myelinating proporciona apoyo metabólico para el axón, preservando su integridad a largo plazo y participar en su supervivencia4,5. Además, ha quedado claro en estos últimos años que esa mielina es modulada dinámicamente a lo largo de la vida, por lo tanto presumiblemente participan en la regulación y plasticidad de diversas funciones del sistema nervioso. Ajustes de la distribución, número, longitud y grosor de las vainas de mielina a lo largo de axones así podrían representar una forma novedosa para ajustar finamente varios redes6,7,8. Por lo tanto, la adquisición evolutiva de la mielina es un proceso clave para las funciones sensoriales, motores y cognitivos y la alteración de la interacción entre los axones y glia es cada vez más considerada como contribuyendo al desarrollo o adquirida neurológica enfermedades9.

Composición de la mielina se ha caracterizado, con la particularidad de una alta proporción de lípidos (70%) en comparación con las proteínas (30%) en contraste con otras10de las membranas celulares. Sin embargo, a diferencia de los lípidos de la mielina, la mayoría de las proteínas de la mielina es específica de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), 2', glicoproteína de nucleótidos 3'-cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP), asociada a la mielina (MAG), glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) y PMP-22, P010. Diversos métodos histológicos para tinción de mielina existen en base a su composición de lípidos, como Luxol fast blue11, Sudán negro B12, de panadero hematina ácida método13, así como14de tinción de plata. Sin embargo, estos enfoques no siempre permiten un adecuado contraste y resolución para visualizar las fibras individuales. Un método alternativo para detectar la mielina es a través de inmunohistoquímica dirigido contra proteínas de mielina. Anticuerpos contra varios antígenos específicos de mielina de destino con una alta especificidad y puede utilizarse rutinariamente para detectar estructuras mielínicas. La interacción antígeno-anticuerpo puede ser revelada aún más usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo dirigida contra el anticuerpo primario y visualizada con microscopía de fluorescencia adecuada. Aquí, describimos un protocolo inmunoquímico para tinción de mielina en ex vivo cerebelosa rebanadas, un modelo que permite una buena conservación de la arquitectura del tejido nervioso. Además, la organización y el tamaño de las células de Purkinje (la única neurona myelinated del cerebelo) hacen un modelo clásico para los estudios electrofisiológicos y son igualmente ideales para realizar estudios de imágenes en vivo o fijados.

Las láminas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10, un tiempo correspondiente al inicio temprano de la mielinización de células de Purkinje, un proceso que se logra sobre todo por una semana ex vivo (6-7 días in vitro DIV)15. Además, este modelo está adaptado para investigar trastornos desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM), como una desmielinización extensa puede ser inducida en rebanadas cerebelosas con el myelinotoxic compuesto lysophosphatidylcholine (o lysolecithin, LPC), que es seguido por una espontánea remyelination16,17. Remielinización endógena ocurre dos días después del retiro de la LPC del medio de cultivo y es casi completa después del tratamiento una semana.

La realización de este protocolo toma aproximadamente 3 semanas, incluyendo el medio día para la preparación de culturas rebanada cerebelosa, a la semana para obtener rebanadas completamente myelinated, seguidos por 2 días en llegar a la cima del demyelination y otra semana para todo su remielinización. Además, la inmunohistoquímica puede completarse en 2 días. El protocolo descrito aquí se adapta a una estándar camada de 6 cachorros de ratones y necesita ser adaptado con respecto al número de animales utilizados para el experimento planeado.

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Protocolo

Todo trabajo con animales el cumplimiento de las políticas institucionales y lineamientos establecidos por el UPMC, INSERM y el francés y Directiva Comunidad Europea 86/609/CEE.

1. preparación de medio de cultivo y cultura inserta (práctica tiempo ≈ 10-15 min)

Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles

  1. Preparar 40 mL de medio de cultivo, que consiste en 50% BME, solución salina equilibrada de Hank 25% (1 x), 25% inactivado con calor caballo suero, suplementado con 2 mM glutamina derivado, 100 UI/mL penicilina-estreptomicina y 4,5 mg/mL de D-glucosa. Ajustar el pH a 7.4.
  2. Filtro-esterilizar el medio con filtro 0,22 μm adaptada a una jeringa de plástico de 50 mL.
    Nota: Medio de cultivo pueden almacenarse a 4 ° C durante por lo menos una semana.
  3. Para una estándar camada de 6 cachorros, utilizar dos placas de 6 pocillos estériles. Para cada plato, retire la tapa y añada 1 mL de medio de cultivo por pozo.
  4. Coloque una cultura en cada pozo individual manteniendo el borde plástico con pinzas estériles. Ponga la tapa sobre la placa.
    Nota: Las rebanadas cerebelosas de un cachorro (6-8) pueden ser despachadas en dos membranas (3-4 rebanadas cerebelosas por inserción de membrana).

2. preparación del medio de la disección (práctica tiempo ≈ 5 min)

Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles

  1. Preparar 100 mL de medio de disección, que consiste en equilibrada solución de Gey de sal suplementado con 4,5 mg/mL x D-glucosa y 1 penicilina – estreptomicina (100 UI/mL cada uno).
  2. Filtro-esterilizar el medio a través de una unidad de filtro de 0,22 μm.
    Nota: El medio de disección puede almacenarse a 4 ° C durante al menos un mes.
  3. Añadir 5 mL de medio de disección fría en platos de cultivo celular 60 mm. Preparar un plato de cultura celular de 60 mm para cada cachorro ser disecado.
  4. No los platos de disección en hielo hasta su uso.

3. preparación del material de disección (Hands-on tiempo ≈ 15 min)

  1. Limpie el Banco con 100% de etanol.
  2. Esterilizar todas las herramientas de disección, una hoja de afeitar y plataforma plástica de chopper tejido con 100% de etanol.
  3. Fijar la hoja de afeitar y la plataforma de plástico en la chopper de tejido y ajustar el espesor de corte de 300 μm.
  4. Asegúrese de que el etanol se evapore antes de comenzar la disección.

4. CerebellumDissection y preparación de las secciones (Hands-on tiempo ≈ 15-20 minutos por animal)

  1. Coloque uno de los platos de cultivo celular 60 mm que contiene el medio de disección helada bajo el microscopio binocular y retire la placa superior.
  2. Limpiar la piel de la cabeza con etanol al 70% (evitando tocar los ojos de los animales) y decapitar al animal utilizando unas tijeras afiladas grandes, según el procedimiento aprobado.
    Nota: Las láminas cerebelosas se generan de P9-P10 ratones sin tensión diagonal o sexo específico.
  3. Utilice tijeras pequeñas para cortar la piel a lo largo de la línea media de la cabeza a partir del cuello y subiendo hasta la boca del ratón.
  4. Para sostener la cabeza y exponer el cráneo, pliegue la piel ventral debajo de la cabeza y los dos pliegues de piel entre los dedos una pizca.
  5. Inserte suavemente las pequeñas tijeras en el foramen magnum y cortar el cráneo haciendo uno lateral incisión hacia el lado y cortar alrededor de la cabeza del cráneo. Mantenga la punta de las tijeras como paralelo y cerca de la calavera como sea posible durante el corte, para evitar dañar el tejido cerebral.
  6. Recuperar la parte dorsal del cráneo utilizando pinza fina recta. Mientras levanta con cuidado la parte dorsal del cráneo, cortar las meninges adherentes (translúcida membrana irrigada que rodea el tejido cerebral) si es necesario con pequeñas tijeras para no dañar el tejido cerebral.
  7. Introducir cuidadosamente la pinza fina recta (o alternativamente use una espátula) entre el cerebro y el cráneo ventral, flipan el cerebro y cortar los nervios de trigeminal y óptica con pequeñas tijeras.
  8. Ayuda al cerebro a dejar caer por gravedad en la placa de cultivo de células de 60 mm que contiene medio de disección fría girando la cabeza hacia abajo sobre el plato y liberar las adherencias pasadas con pequeñas tijeras si es necesario.
  9. Con unas pinzas finas, orientar el cerebro con el lado dorsal hacia el investigador y el lado ventral en la parte inferior del plato.
  10. Bajo el microscopio binocular, utilizar el fórceps recto fino para inmovilizar el cerebro en el lado del cerebro anterior y evite tocar el cerebelo, ya que podría dañarse. Separan el cerebelo del resto del cerebro (fore - y el midbrain, ver esquema en figura 1Aa), utilizando pinza fina recta. Para separar el resto del cerebelo el cerebelo, utilice las pinzas finas para cortar los pedúnculos cerebelosos, por debajo del cerebelo (ver esquema en figura 1Aa').
  11. Una vez aislado el cerebelo, rasgar cuidadosamente a las meninges con pinza fina recta (ver esquema en figura 1Aa').
  12. Sostenga el cerebelo suavemente con las pinzas curvas finas y colocarlo con el lado dorsal en la plataforma de plástico perpendicular a la cuchilla del picador (ver esquema en figura 1Bb).
  13. Aspirar el exceso de medio de disección en el cerebelo usando una punta de pipeta estéril de extremo fino adaptada en un 1 mL pipeta (ver esquema en figura 1Bb).
  14. Asegúrese de que el cerebelo pone plano, pero no estirado, una vez colocado en la plataforma para obtener rebanadas sagitales óptima durante el seccionamiento (véase esquema en figura 1Bb).
  15. Cortar 300 μm de espesor secciones sagitales del cerebelo con el picador de tejido (ver esquema en figura 1Bb'). La fuerza y la velocidad de la hoja deben ser optimizada en el sitio.
  16. Suavemente agregue una gota del medio de la disección en el cerebelo en rodajas. Lentamente utilizando una pipeta de ancha colocada en una pipeta de 1 mL, aspirar el cerebelo en rodajas y transferirlo a la placa de cultivo de células de 60 mm que contiene medio de disección helada (ver esquema en figura 1Bb'').
  17. Limpiar la plataforma plástica de chopper tejido con etanol al 100% entre cada corte de cerebelo. Que el etanol se evapore antes de colocar el cerebelo próxima a la plataforma.
  18. Utilizar dos pinzas recto fino (o alternativamente agujas de titanio) para separar sectores individuales y seleccionar 6-8 rebanadas de los vermis (ver esquema en figura 1Cc y 1Cc').
  19. Tomar una placa de 6 pozos con los partes movibles de la cultura y transferir hasta 4 rebanadas seleccionados en insertar una cultura junto con algún medio de disección, utilizando una pipeta ancha adaptada en una pipeta de 1 mL (ver esquema en figura 1Cc').
  20. Coloque las rodajas en medio de la inserción de la cultura utilizando el medio de disección o las pinzas para empuje y tire de ellas suavemente en la posición correcta, evitando para estar en contacto entre sí (ver esquema en figura 1Cc').
  21. Quitar cualquier exceso de medio de disección alrededor de las rebanadas utilizando una pipeta de punta fina. Asegurar que las rebanadas se ponen plana sobre la membrana (ver esquema en figura 1Cc').
  22. Coloque la placa de 6 pozos en la incubadora inmediatamente después de haber añadido las rebanadas en la membrana.

5. rodajas de cultura y desmielinización (práctica tiempo ≈ 15-20 min)

Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles

  1. Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL por pozo de medio de cultivo fresco precalentado y tampón cada 3 días después de la preparación de la rebanada.
  2. Para el demyelination, quitar todo medio de cultivo más abajo la cultura inserta después de 6 días in vitro (DIV) y sustituirla por 1 mL por pocillo del medio de cultivo fresco precalentado con 0.5 mg/mL LPC. Incubar durante 15-17 h a 37 ° C, 5% CO2.
  3. Después de la incubación, lavar los rellenos colocándolos en una placa Petri 25 mm que contiene 1 mL de medio de cultivo precalentada.
    Nota: Los insertos deben estar en contacto con el medio, pero no serán cubiertos por él.
  4. Inmediatamente la transferencia de la cultura inserta en una placa de 6 pozos nuevos con medio fresco de cultivo precalentada.
  5. Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL de medio de cultivo fresco precalentado cada 2-3 días hasta fijación de láminas.

6. inmunohistoquímica (tiempo de práctica ≈ 1:30 – 2 h)

Nota: Llevar a cabo los pasos 6.1. 6.3. bajo una campana de humos. Evitar exposición a paraformaldehido (PFA) y consulte la hoja de datos de seguridad de producto para la adecuada manipulación y protección.

  1. Uso de fórceps para levantar cada cultura inserta manteniendo el borde plástico y retire el medio de cultivo por debajo de los insertos de la membrana de cada pozo.
  2. Arreglar las rodajas cerebelosas por 30 min, añadir 2 mL de 4% PFA en 1 x pH 7,4 de la PBS en los insertos de la membrana.
    Nota: El momento de la fijación depende de la etapa de mielinización estudiado: DIV 4 corresponde al inicio de la mielinización, 7 DIV a rodajas totalmente mielinizados. En caso de tratamiento de LPC, DIV 9 corresponde al pico de desmielinización, la 11 DIV al inicio de la remielinización y 14 DIV a totalmente remyelinated rodajas.
  3. Lave los insertos con los trozos de tres veces con 2 mL 1 x PBS durante 10 minutos.
  4. Separar las rodajas de los insertos de membrana bajo el microscopio binocular con un x 25 a 30 aumentos, empujándolas suavemente con un bisturí o una brocha. Como alternativa, para evitar el riesgo de dañar las rebanadas al desprendimiento de la membrana, usar un bisturí para cortar la membrana con las rebanadas fijadas.
  5. Transferir los trozos flotantes en los pocillos de una placa de 4 pozos que contiene 1 x PBS, utilizando un cepillo.
  6. Aspirar el PBS de cada pozo e incubar las rebanadas en etanol al 100% previamente enfriado a-20 ° C durante 15 a 20 minutos. Este paso facilita la penetración del anticuerpo en fibras mielínicas.
  7. Aspirar el etanol 100% y lavar una vez brevemente con 1 x PBS, luego dos veces en PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Aspirar el PBS e incubar las rebanadas durante 30 a 45 minutos con una solución que contiene 1 x PBS 5% NGS, 0.3% de detergente no iónico a temperatura ambiente para bloquear sitios de fijación de anticuerpos no específicos.
  9. Aspire la solución de bloqueo. No lavado es necesario.
  10. Incubar durante una noche las rebanadas con los anticuerpos primarios diluidos en el bloqueo de la solución a 4 ° C. Para visualizar la mielina en rebanadas organotypic cerebelosa, utilice MBP (pollo, 1/150 o IGg2b de ratón, Smi99, 1/200) o PLP (rata, hibridoma, 1/5 a 1/10) anticuerpos.
    Nota: Para descubrir la expresión de más de un antígeno en el mismo segmento, realizar un doble o un triple procedimiento de tinción (ver figura 1 como ejemplo). Para realizar la incubación al mismo tiempo, asegurar anticuerpos primarios se producen en las diferentes especies. A continuación, utilice sus correspondientes anticuerpos secundarios acoplados a diferentes fluoróforos (véase Tabla de materiales nodal y paranodal marcador18 anticuerpos).
  11. En el segundo día, lavar las rodajas de tres veces en PBS 1 x durante 10 minutos.
  12. Incubar durante 3 horas con los anticuerpos secundarios diluidos en el bloqueo de solución (dilución 1/500) en la oscuridad a temperatura ambiente.
    Nota: Optimización del tiempo de disolución y de incubación de anticuerpos puede ser necesario cuando se utiliza otros anticuerpos que las descritas aquí.
  13. Lavar las rodajas de tres veces en PBS 1 x durante 10 min en la oscuridad.
  14. Microscopio binocular, montar los cortes en un portaobjetos de vidrio. Colocar 100 μl de PBS 1 x en la diapositiva y transferir las rebanadas en PBS con un cepillo. Desplegar las rodajas si es necesario y aplanar en la diapositiva. Retire el exceso de PBS. En el caso de la inmunomarcación se lleva a cabo con cortes fijados a membranas, montaje con las láminas hacia el cubreobjetos con la membrana en el portaobjetos de cristal.
  15. Coloque una gota de medio de montaje directamente sobre el cubreobjetos de vidrio y cubrir ligeramente las rodajas. Diapositivas montadas pueden almacenarse durante varios meses a 4 ° C en la oscuridad.

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Resultados

Ejemplos de mielina representante immunostainings en rebanadas cerebelosa organotypic obtenidos P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figura 2A), así como de ratones transgénicos de PLP-GFP (figura 2B), junto con la tinción de las células de Purkinje. Myelinate de la materia blanca cerebelosas rebanadas pistas región de las láminas hacia la periferia de la folia y mielinización de las células de Purkinje se obtiene sobre todo después ...

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Discusión

Aquí detallamos un protocolo para generar un ex vivo modelo correspondientes a las culturas de rebanada de ratón organotypic cerebelosa, adaptado de previamente métodos publicados15,16,19 y la mielina posterior inmunotinción de estos preparados. Esta estrategia ofrece la posibilidad de visualizar los componentes de la mielina con una alta resolución en Estados sanos y patológicos.

Cerebelosa organotyp...

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Divulgaciones

Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon y Dr. Thomas Roux valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el INSERM, ICM, ARSEP becas R13123DD, R17127DD de la ANR (para DC) y beca FRM, SPF20110421435 (para DC), FDT20170437332 (a M.T.). Agradecemos a las instalaciones de cultura de célula CELIS y la RIC. Plataforma de proyección de imagen de Quant.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio BMEThermoFisher Scientific41010026
Hank' s Solución salina equilibrada (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Suero de caballo inactivado por calorThermoFisher Scientific26050088
Penicilina– Estreptomicina (10.000 UI/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Gey' s Solución salina equilibradaSigma AldrichG9779-500ML
Solución de D-glucosa (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
Lisofosfatidilcolina (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
Paraformaldehído (PFA)Microscopía electrónica Ciencias15714
Etanol absoluto (100% etanol)VWR Chemicals20821.330Enfriado a -20 grados; C
Tritón® X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% Suero de Cabra Normal (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Solución tampón de fosfatoEuroMEDEXET330-ApH 7.4
Anticuerpo anti-GFP (policlonal, pollo)Merck Millipore06-896Dilución 1/300
Anticuerpo anti-mielina proteína básica (MBP) (policlonal, pollo)Merck MilliporeAB9348Dilución 1/150
Anticuerpo anti-Proteína Básica de Mielina (MBP) (Monoclonal, IgG2b de ratón)Merck MilliporeNE1019Dilución 1/200
Anticuerpo Anti-PLP (Rata, Hibridoma)Regalo del Dr. K. Ikenaka; Okasaki, JapónDilución 1/5 a 1/10
Canal antisódico, anticuerpo Pan (monoclonal, IgG1 de ratón, clon K58/35)Sigma AldrichS8809Dilución 1/150
Anticuerpo anti-Caspr (policlonal, conejo)Abcamab34151Dilución 1/500
Anticuerpos secundarios de cabra conjugados con Alexa Fluor 488, 594, 647 o 405ThermoFisher ScientificDilution 1/500
FluoromountSouthernBiotech0100-20
Picadora de tejidosMcIlwain
Hojas de afeitar Tijeras
grandesF.S.T14101-14
Tijeras pequeñasF.S.T91500-09
Pinzas finas-rectasF.S.T91150-20
Pinzas curvas-finasF.S.T11297-00
Placas de cultivo celular (60 mm y 100 mm)TPP
Placas de cultivo de 4 y 6 pocillosTPP
Insertos de cultivo Millicell (0,4 y micro; m, 30 mm de diámetro)Merck MilliporePICM0RG50
Incubadora decelulares 37° C, 5% CO2
Puntas de pipeta de punta finaDutscher134000CL
Puntas de pipeta de diámetro anchoThermoFisher Scientific2079G
Jeringa estérilTerumo Europe20 o 50 mL
Filtros de jeringa estérilesTerumo Europe0.22 µ m
BisturíSwann-Morton0510
Portaobjetos de microscopiode
Cubreobjetos de vidrioRS France22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Tejidos LimpiadoresKimberly-Clark Professional5511
Microscopiobinocular
cultivos cepillo RS France 76 mm x 26 mm x 1,1 mm

Referencias

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