Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.
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Artículo de método
Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR
En este artículo
Resumen
Resumen
La explosión oxidativa o respiratoria se utiliza para describir el rápido consumo de oxígeno y la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) por los fagocitos en respuesta a varios estímulos inmunes. ROS generados durante la activación inmune ejerce potente actividad antimicrobiana sobre todo a través de la capacidad de ROS para dañar el ADN y las proteínas, causando la muerte de los microorganismos. Ser capaz de medir la producción de ROS reproducible y con facilidad es necesario para evaluar la contribución de varias vías y moléculas para este mecanismo de defensa del huésped. En este trabajo, demostrar el uso de sondas fluorescentes y citometría de flujo para detectar la producción de ROS. Aunque ampliamente utilizado, es muy problemático, especialmente en cuanto a medición de ROS inducida por estímulos específicos y no mitogénicos medición fluorescente de ROS. Presentamos una metodología detallada para la detección de ROS generados como resultado de la estimulación específica de FcγR comenzando con generación de macrófago, cebado, coloración, FcγR Cross-linking y terminando con el análisis cytometric del flujo.
Introducción
Especies reactivas del oxígeno (ROS) son moléculas reactivas o radicales libres que son subproductos de la respiración aeróbica (revisado en 1). Estas incluyen el anión superóxido, peróxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y los iones hidroxilo, entre otros. En condiciones fisiológicas normales, ROS son producidos principalmente por las mitocondrias y oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y son desintoxicados rápidamente por varias enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa y glutatión. Una exagerada producción de ROS o un defecto en la capacidad de eliminar ROS puede resultar en estrés oxidativo, po....
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Protocolo
El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Comité institucional el cuidado Animal y del uso (IACUC) de University of Central Florida.
1. generación de la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs)
-
Preparación de medios de cultivo
- Preparar los medios base D10F: A de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), añadir 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
Nota: Aunque es mejor utilizar medios D10F frescos, D10F base media puede preparar hasta dos semanas por adelantado para se....
- Preparar los medios base D10F: A de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), añadir 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
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Resultados
Utilizando el protocolo descrito dentro, presentamos datos representativos mostrando detección cytometric del flujo de producción de ROS resultantes de la estimulación de WT C57BL/6J BMDMs a través del FcγR. Como se esperaba, observamos cambios mínimos en la fluorescencia FL1 o FL2 por encima de los niveles de fondo en las células sin estimular (Figura 3A, Comparar "manchadas, sin estimular" vs "sin manchas, sin estimular" punto parcelas). Observamos un marcado aumento en fluorescencia FL1 y.......
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Discusión
DCFH2-DA y detección basada en DHE de ROS es una técnica ampliamente utilizada14,15. Facilidad de uso y la adaptabilidad de estas sondas ROS para microplacas cinética formatos, análisis de fluorescencia microscopía o flujo cytometric ha contribuido a su popularidad. Sin embargo, en nuestros estudios de las funciones de macrófagos mediada por FcγR, no parecía ser un protocolo estándar para la realización de este ensayo para el análisis cytometric del fl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a otros miembros del laboratorio de Tigno Aranjuez como Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy, Roopin Singh por su ayuda en el mantenimiento de colonias de mantenimiento y el ratón de laboratorio. Apoyo para esta investigación fue proporcionado por grant R00 HL122365 y fondos de puesta en marcha a J.T.T-A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Investigación innovadora anti-BSA IgG1 | IBSA9E2C2 | ||
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticuerpo | BioLegend | 400626 | |
| Anti-ratón CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anticuerpo anti-ratón F4/80 conjugado con Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anticuerpo anti-ratón F4/80 conjugado con FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anticuerpo anti-ratón/humano CD11b conjugado con Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoetanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Sondas moleculares | C6827 | Puede ser un sustituto del reactivo de detección de estrés oxidativo en el kit Enzo |
| Dihidroetidio (DHE) | Sondas moleculares | D11347 | Puede ser un sustituto del reactivo de detección de superóxido en el kit Enzo |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM sin fenol rojo | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhidro | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rata IgG2a, κ Isotipo Ctrl Anticuerpo | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamina | Gibco | 25030-081 | |
| Células LADMAC | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| ratón IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-acetil-L-cisteína | EMD Milipore | 106425 | Puede ser un sustituto del inhibidor/eliminador de ROS en el kit |
| Enzo Citómetro de flujo de novocitos con muestreador automático | Acea | 2060R | |
| Piocianina (inductor de ROS) | 10009594 químico Caimán | Puede ser un sustituto del inductor en el kit Enzo Kit | |
| ROS-ID ROS total / kit de detección de superóxido | ENZO | ENZ-51010 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referencias
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
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Reimpresiones y permisos
