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Artículo de método

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

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DOI:

10.3791/59194

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10 de abril de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

En este artículo

Resumen

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Resumen

La enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad devastadora de los recién nacidos. Se caracteriza por múltiples alteraciones fisiopatológicas en el epitelio intestinal humano, conduce a aumento de la permeabilidad intestinal, alteración de restitución y aumenta la muerte celular. Aunque existen numerosos modelos animales de NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Además, es éticamente desafiante para el estudio de la fisiopatología de la enfermedad o nuevos agentes terapéuticos directamente en seres humanos, especialmente los niños. Por lo tanto, es altamente deseable para el desarrollo de un modelo novedoso de NEC con tejido humano. Enteroids son 3 dimensiones organoides derivados de las células epiteliales intestinales. Son ideales para el estudio de las interacciones fisiológicas complejas, señalización celular y defensa huésped-patógeno. En este manuscrito se describe un protocolo enteroids humana las culturas después de aislar las células madre intestinales de pacientes sometidos a resección intestinal. Las células de la cripta se cultivan en medios que contienen factores de crecimiento que estimulan la diferenciación en el varios nativo de tipos celulares del epitelio intestinal humano. Estas células crecen en una mezcla sintética, colágeno de proteínas que sirven como andamio, mímico la membrana basal extracelular. Como resultado, enteroids desarrollar polaridad apical basolateral. La administración concomitante de lipopolisacárido (LPS) en medios de comunicación provoca una respuesta inflamatoria en enteroids, que conduce a histologic, genética y alteraciones de la expresión de proteína similares a ésos vistos en NEC humana. Un modelo experimental de NEC utilizando tejido humano puede proporcionar una plataforma más precisa de drogas y tratamiento de prueba antes de los ensayos en humanos, como nos esforzamos por identificar una cura para esta enfermedad.

Introducción

Enteroids humanas son un ex vivo sistema de 3 dimensiones de la cultura generado a partir de células madre aisladas de criptas intestinales de las muestras de tejido intestinal humano. Este modelo innovador fue pionero por Hans Clevers et en 2007 tras el descubrimiento de Lgr5 + células en las criptas del intestino en ratones1. Su trabajo sentó las bases para el establecimiento de un ex vivo cultura epiteliales intestinales múltiples tipos de células que pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Desde este descubrimiento, enteroids se han utilizado como un modelo novedoso para el estudio de la fisiología digestiva normal y la fisiopatología de enfermedades intestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal, interacciones huésped-patógeno y medicina regenerativa2.

El uso de enteroids como una ex modelo vivo para el estudio de la fisiopatología intestinal tiene varias ventajas sobre técnicas alternativas. Durante las últimas décadas, se han utilizado para estudiar la fisiología intestinal3,4,5modelos animales y líneas celulares inmortalizadas de derivados del cáncer intestinal. Cultivos celulares solo no representan la diversidad de tipos de células presentes en el epitelio intestinal normal, careciendo de tal modo Charla cruzada de célula a célula y segmento-especificidad de expresión de la proteína, la señalización y la enfermedad inducida por el patógeno6. Las células madre en enteroids se diferencian en los principales tipos de células epiteliales como enterocitos, células de Paneth, células caliciformes, células enteroendocrinas y más3. Presentan polaridad, realizar funciones de transporte epiteliales y permiten de especificidad del segmento intestinal6. Desde enteroids puede recapitular los múltiples tipos de células de epitelio intestinal humano, son capaces de superar esta limitación reconocida de sistemas basadas en células de cáncer. Con el tiempo, derivados de líneas celulares se subcloned y evolucionan para exhibir una mayor diversidad en la expresión y localización de proteínas3. Por el contrario, enteroids pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Aunque existen numerosos modelos animales para NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Como resultado de estas limitaciones, terapias derivadas de modelos animales fallan el 90% del tiempo en los ensayos en humanos debido a diferencias en la toxicidad y eficacia3. Enteroids servir como modelos preclínicos prometedores que pueden superar estas deficiencias conducen a una mejor comprensión de la compleja Fisiopatología intestinal y por lo tanto, más exitosas y rentables de las innovaciones terapéuticas. También hay evidencias recientes que la edad del tejido que un enteroide se genera a partir sigue siendo biológicamente importantes7. Esto es un detalle especialmente importante para nuestro modelo ya enteroids se generan a partir del tejido neonatal, manteniendo así relevancia fisiológica en pacientes con NEC.

La utilidad de enteroids como modelos de enfermedades humanas continúa expandiéndose, con la esperanza de encontrar curas para condiciones severas y penetrantes. Enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad intestinal devastadora de los recién nacidos caracterizada por necrosis intestinal y con frecuencia conduce a la perforación de la pared intestinal, septicemia y muerte8. Debido a la fisiopatología compleja y multifactorial de la NEC, el mecanismo exacto de la enfermedad ha no aún se han aclarado completamente; sin embargo, el aumento de la permeabilidad intestinal se ha implicado claramente en el proceso de la enfermedad8. Dado que el estudio de posibles agentes terapéuticos y NEC es éticamente desafiante en seres humanos, especialmente los niños, es muy conveniente utilizar un modelo biológicamente relevantes enteroide de NEC utilizando tejido humano neonatal. Hasta el momento, enteroids tienen un papel limitado en el estudio de NEC. Este protocolo describe el uso de enteroids derivada de las muestras de tejido intestinal humano como una novela de la ex modelo vivo para el estudio de la enterocolitis necrosante.

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Protocolo

Se obtuvo aprobación de la Junta de revisión institucional (IRB 2013 # 15152) para recogida de muestras de tejido de pacientes sometidos a resección intestinal en Ann y Robert H. Lurie Infantil Hospital de Chicago, Chicago, Illinois. Todos los protocolos se realizaron conforme a las directrices institucionales y nacionales y reglamentos para el bienestar humano. Consentimiento informado parental fue requerido y obtenido antes de la recogida de la muestra en todos los casos.

1. preparación del reactivo

  1. Preparar solución stock de medios de cultivo para la colección de todo tejido: 1 L de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), 110 mL de suero bovino Fetal (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL de insulina filtro esterilizado (concentración final 0,1%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  2. Preparación de Buffer quelante #1: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en la 1.1), 600 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) (concentración final 10 mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  3. Preparación de Buffer quelante #2: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en la 1.1), 300 μL de EDTA 0,5 M (concentración final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  4. Preparar medios Minigut humano: mL 41,4 DMEM/F-12, 5 mL de SFB (final 10%), 500 μl de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μl de L-glutamina (concentración final 1%), 500 μl de gentamicina (concentración final 1%), 100 μl de la anfotericina B (final concentración 0.2%), 500 μl de ácido sulfónico N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane M 1 (HEPES) (concentración final 10 mM), 500 μl de 100 x N-2 suplemento y 1 mL de 50 x B-27 suplemento menos vitamina A para un volumen total de 50 mL. Almacene la solución stock a-20 ° C.
  5. Preparación completa de medios Minigut humano: 10 mL de Minigut Human Media (preparado en 1.4), 10 μl de Wnt3a de 100 μg/mL (concentración final 100 ng/mL), 10 μl de Noggin (concentración final 100 ng/mL), 10 μl de 1 mg/mL R-Spondin de 100 μg/mL (concentración final 1 μg/mL) , 10 μl de 500 μg/mL del Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (concentración final 50 ng/mL), 10 μl de 1 M N-acetilcisteína (concentración final 1 mM), 10 μl de 10 mM Y-27632 (concentración final 10 μm), 10 μl de 500 μm A-83 (concentración final 500 nM), 10 μl de 10 mM (final de SB202190 concentración 10 μm), 100 μl de 1 M nicotinamida (concentración final 10 mM) y 1 μl de 100 μm [leu] 15-gastrin 1 (concentración final 10 nM). Volumen total de 10 mL. Almacenar la solución a 4 ° C.
    Nota: Las soluciones deben utilizarse dentro de 48 h.

2. cripta aislamiento y forro de todo tejido

  1. En el momento de la recogida en el operativo conjunto, coloque la muestra de tejido intestinal pequeño humano en de frío Dulbecco fosfato tampón salino (DPBS). Lavar a la muestra en frío DPBS hasta claro de heces y sangre. Almacenar la muestra a 4 ° C en Medio RPMI 1640 hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta.
    Nota: Tejido no se puede almacenar más de 24 h.
    1. Asegúrese de que la muestra esté libre de heces y sangre. Con tijeras de disección delicadas, quite cualquier exceso grasa quirúrgicas clips/grapas o etcetera. Pesar a la muestra.
      Nota: Objetivo para una pieza de aproximadamente 0.75-2.5 g.
  2. Cortar a la muestra en trozos de 0,5 cm y colocar en 30 mL de Buffer quelante #1 (como preparado en el paso 1.2).
    1. Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tejido a través de 100 μm tamiz de célula y deseche el flujo a través.
  3. Añadir el tejido a 30 mL de Buffer quelante #2 (como preparado en el paso 1.3).
    1. Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tejido a través de un tamiz celular de 100 μm y deseche el flujo a través.
  4. Descongelar 500 mL de matriz de la membrana del sótano en hielo para su uso en el paso 2.8.
  5. Añadir tejido a 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL y agitar vigorosamente a mano 10 s.
    1. Filtrar con un colador de celda de 100 μm y recoger el flujo a través de (sello #1). Mantenga el tubo #1 en el hielo.
    2. Añadir tejido a otro 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL separados y agite vigorosamente a mano 10 s.
    3. Filtrar con un colador de celda de 100 μm y recoger el flujo a través (sello #2).
    4. Repetir dos veces más hasta que hay cuatro tubos cónicos con flujo a través de (tubos etiquetados #1-4).
  6. Filtro tubo solución #1 a través de una 100 μm células colador y la transferencia de flujo a través de en tubo cónico de 15 mL (etiqueta #1). Repetir #2-4.
    1. Centrifugar 15 mL tubos #1-4 a 200 x g durante 15 min a 4 ° C.
  7. En la campana de flujo laminar, retire el sobrenadante de los tubos #1-4 y deseche. Evitar perturbar la nube de tejido inmediatamente por encima de la pelotilla, incluso si eso significa dejar algunas sobrenadante.
    1. Transfiriendo poco a poco, mezclar el sedimento con las sobras de sobrenadante en tubos #1-4.
    2. Transferir la mezcla de tubos #1-4 en un tubo cónico de solo 2 mL.
    3. Centrifugar el tubo cónico a 200 x g durante 20 min a 4 ° C.
  8. Quite el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μl de la matriz de la membrana del sótano.
    Nota:     mantener la matriz de la membrana del sótano en hielo en todo momento y trabajar rápidamente para los próximos pasos. Este producto se polimeriza muy rápidamente a temperatura ambiente.
    1. Aplique 50 μl de suspensión de matriz de la membrana basal muestra al centro de un pozo en una placa de 24 pozos. Esto debe aparecer en forma de cúpula.
      Nota: Uso de puntas de pipeta frío ayuda en la transferencia suave de la suspensión, reduciendo al mínimo la polimerización.
    2. Repetir 9 veces para rellenar pozos total 10.
  9. Colocar la placa de 24 pocillos de 37 ° C, 5% CO2 incubadora de 30 min permitir la polimerización.
  10. Añadir 500 μl de humano Minigut los medios de comunicación (como preparado en el paso 1.5) a cada pocillo. Reemplace cada 2 días.
  11. Recoger enteroids después de 5-10 días, cuando se visualiza el florecimiento. Ver pasos 4 y 5 para las instrucciones de la colección.

3. inducción de NEC Experimental

  1. Añadir 10 μl de 5 mg/mL de lipopolisacárido (LPS) a 500 μl de humano Minigut los medios de comunicación (como preparado en el paso 1.5) en cada pozo en el día 0. Reemplace cada 2 días hasta la colección.

4. preparación para inclusión en parafina

  1. Retire con cuidado los medios de comunicación.
    1. Añadir 1 mL de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disolver la matriz de la membrana basal con cuidado de no lisar la enteroids.
    2. Centrifugar una mezcla de PBS/enteroide a < 300 x g durante 5 min para pellets y eliminar PBS.
  2. Añadir el paraformaldehído al 4% para fijar a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Centrifugue a < 300 x g durante 5 min para la pelotilla y después quitar PBS.
    1. Lavar suavemente con 1 mL de PBS y centrifugue a < 300 x g durante 5 min para la pelotilla y después quitar PBS.
    2. Repetir el punto 4.3.1.
  4. Fundir un volumen suficiente del proceso de gel (alrededor de 300 μL) colocando la cantidad deseada en un tubo cónico y calentamiento en una incubadora de baño seco a 65 ° C durante 3-10 min hasta que el líquido del tejido.
    1. Añadir el gel a la pelotilla de proceso del tejido y mezclar suavemente.
    2. Sobre un cubreobjetos, colocar un pequeño anillo de clonación.
    3. Pipeta el tejido mezcla de gel y enteroide de procesamiento en un anillo de clonación montado sobre un cubreobjetos.
  5. Deje que la mezcla de gel y enteroide solidificar a 4 ° C por 1 h de proceso del tejido.
    1. Sumerja el anillo de clonación con la mezcla solidificada en etanol al 70% en preparación para la inclusión en parafina.

5. enteroide colección para extracción de proteínas y ARN

  1. Suavemente Retire humano Minigut Media completa de cada bien.
  2. Añadir 1 mL de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disolver la matriz de la membrana del sótano. Tenga cuidado de no disociar el enteroids.
    1. Coloque la mezcla de PBS/enteroide en un tubo cónico estéril de 2 mL.
    2. Centrifugue a < 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten.
    3. Retire suavemente el PBS, teniendo cuidado de no para eliminar el enteroids.
  3. Repetir paso serie 5.2 dos veces más.
  4. Congelación de-80 ° C hasta que esté listo para la proteína o la extracción de RNA.
  5. Realizar gene expresión y proteína de aislamiento de la enteroids uso bien establecido de qRT-PCR y técnicas de Western blot.

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Resultados

Inmediatamente después de la galjanoplastia, las criptas intestinales recién aisladas aparecen como barras alargadas. Dentro de las horas, el enteroide tendrá un aspecto redondo (figura 1a). En los próximos días, iniciará el enteroids formando esferas como se ve en la figura 1b. Florecimiento debe ocurrir entre 5-10 días (figura 1c) y colección enter...

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Discusión

Esta novela ex vivo enteroide intestinal humano modelo sirve como un método útil para el estudio de la disfunción de la barrera intestinal en la enterocolitis (NEC) necrotizante. Los métodos de procesamiento enteroide presentados aquí fueron adaptados de la obra anterior de los Drs. Misty Good, Michael Helmrath y Jason Wertheim10,11,12.

Detalles que rodean toda la colección de tejidos y el tiempo de a...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto de Salud Instituto Nacional de Diabetes y el Jay Grosfeld Premio de la Asociación Americana de cirugía pediátrica C.J.H., digestivo y riñón enfermedad Grant (K08DK106450)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% ParaformaldehídoThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Anfotericina BThermoFisher15290026
B-27 suplemento menos Vitamina AThermoFisher17504-044
Matriz de membrana basal (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM/F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)ThermoFisher14190-144
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)SigmaE9644-.2MG
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)SigmaEDS-500G
Suero fetal bovino (FBS)Gemini Bio-Pro100-125
GentamicinaSigmaG5013-1G
GlutaMAX ( L-glutamina)ThermoFisher35050-061
InsulinaSigmaI9278-5mL
[leu] 15-gastrina 1SigmaG9145-.1MG
Lipopolisacárido (LPS)SigmaL2630-25MG
N-2 suplementoThermoFisher17502-048
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico (HEPES)ThermoFisher15630-080
N-acetilcisteínaSigmaA9165-5G
NicotinamidaSigma N0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher15140-148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640Medium Invitrogen11875093
R-SpondinPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
Gel para procesamiento de tejidos (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& D Sistemas INC5036-WN-010
Y-27632SigmaY0503-1MG

Referencias

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