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Artículo de método

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta

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DOI:

10.3791/59195

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22 de abril de 2019

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1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método reproducible para el desarrollo de un modelo Murino ortotópico de cabeza y cuello de células escamosas. Tumores demuestran clínicamente relevantes características histopatológicas de la enfermedad, como necrosis, pobre diferenciación, metástasis ganglios, infiltración inmune. Ratones con tumores síntomas clínicamente relevantes incluyendo disfagia, desplazamiento de la mandíbula y pérdida de peso.

Resumen

Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es una enfermedad debilitante y mortal con una alta prevalencia de repetición y fracaso del tratamiento. Para desarrollar mejores estrategias terapéuticas, comprensión tumor microambiental los factores que contribuyen a la resistencia al tratamiento es importante. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas celulares murinas que se asemejan a lo agresivo y metastásico de HNSCCs humanas. Además, la mayoría de modelos murinos emplear implantes subcutáneos de los tumores que carecen de funciones fisiológicas importantes de la región de cabeza y cuello, incluyendo la alta densidad vascular y vasculatura linfática extensa flora residente mucosa. El propósito de este estudio es desarrollar y caracterizar un modelo ortotópico de HNSCC. Contamos con dos líneas celulares murinas genéticamente distintos y tumores establecidos en la mucosa bucal de ratones. Optimizar métodos de digestión de tumor de base de colagenasa para la recuperación óptima de las células de tumores establecidos. Los datos aquí presentados muestran que ratones desarrollan tumores altamente vascularizados que metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Análisis de citometría de masas multiparamétrico unicelular muestran la presencia de diversas poblaciones inmunes con células mieloides que representan a la mayoría de todas las células inmunes. El modelo propuesto en este estudio tiene aplicaciones en la biología del cáncer, Inmunología tumoral y desarrollo preclínico de nuevas terapias. El parecido del modelo ortotópico de características clínicas de la enfermedad humana le brindan una herramienta para la traducción mejorada y mejora los resultados del paciente.

Introducción

HNSCC es la malignidad más común en quinto lugar a nivel mundial, con más de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. A pesar del tratamiento agresivo con quimioterapia y radioterapia (RT), la tasa general de supervivencia (SG) para pacientes HNSCC sin infección humana del papillomavirus (HPV) sigue siendo inferior al 50% después de 5 años2. Esto se atribuye principalmente a un microambiente tumoral compleja como pueden originar tumores de varios sitios anatómicos distintos dentro de la región de cabeza y cuello, incluyendo la mucosa bucal, lengua, piso de la boca, cavidad nasal, cavidad oral, faringe, Oropharynx y hypopharynx. Además, la región de cabeza y cuello es altamente vascularizada y contiene casi la mitad de todos los nodos de linfa en el cuerpo3. La mayoría de estudios que investigan la biología tumoral de cabeza y cuello se basan en modelos de tumores en la región de flanco. Tales modelos pueden ofrecer visión de mecanismos intrínsecos de tumor, pero la falta del microambiente natural de cabeza y cuello puede afectar significativamente el potencial traslacional de tales resultados. Un método que se ha utilizado para inducir tumores orales es a través de la exposición al carcinógeno 9, 10-Dimetil-1, 2-benzanthracene (DMBA)4. Sin embargo, este método está asociado a un proceso largo, induce tumores en ratas y hamsters pero no en ratones, y los tumores resultantes no poseen muchas de las características histológicas de SCCs diferenciados5,6. La introducción de la carcinogen4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), un derivado de la quinolona soluble en agua, resultaron en tumores orales de ratón cuando se aplica por vía oral pero también sufrió de tiempos de exposición largos (16 semanas) y una limitada tome velocidad dentro y entre lotes de ratones7,8,9. Para desarrollar modelos clínicamente relevantes, varios grupos utilizaron modelos transgénicos que implican la manipulación de oncogenes de controlador o genes supresores de tumores, incluyendo TP53, TGFB, KRAS, HRAS y SMAD410. Estos modelos pueden ofrecer información sobre tumores con genes de la conductor conocido pero no recapitular la compleja heterogeneidad de HNSCCs humanas.

En este trabajo se demuestra la viabilidad de realizar una inoculación intramucosal de carcinoma de células escamosas células en ratones. Células inoculadas se convierten en tumores agresivos dentro de 1 semana de la inyección. Similar a la humanas HNSCCs, los tumores metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Caracterizar las características histológicas y clínicas de la enfermedad y proporcionar la penetración en el microambiente inmunológico del tumor. Proponemos que este modelo ortotópico de HNSCC tiene aplicaciones en Biología del cáncer, Inmunología tumoral y estudios preclínicos. Mecanismos de evasión inmune, resistencia al tratamiento, progresión tumoral y metástasis representan áreas de significación clínica que se puede abordar utilizando el modelo propuesto.

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Protocolo

Animales todos los procedimientos fueron realizados según un aprobado animales uso y cuidado Comité (IACUC) protocolo institucional de la Universidad de Colorado Denver (protocolo 00250 #).

1. tumor de la célula cultura

Nota: Las líneas celulares B4B8 y LY2 se utilizaron para generar tumores HNSCC ortotópico: B4B8 las células del tumor fueron derivadas de queratinocitos mucosa transforma carcinógeno (de ratones BALB/C)11. Las células del tumor LY2 se derivaron de las metástasis de nodo de linfa de un transformado espontáneamente ratones BALB/C queratinocitos línea (Pam 212)12,13. Ambas líneas celulares fueron amablemente proporcionados por Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).

  1. Uso mediana F/12 (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% reactivo antimicrobiano para el mantenimiento de la línea de celular. Mantener estas líneas de células en una incubadora estéril a 37 ° C y 5% CO2. Células puede usarse para la inoculación antes de más de 15 pasos.
  2. Placa de 2 x 106 4 x 106 células en frascos de cultivo de células de 175 cm2 .
    Nota: Las células sean menos del 90% confluente para evitar inducir una respuesta de estrés.
  3. Cuando las células son 70% confluente (~ 48 h), retire el matraz de la incubadora y lavar las células 3 x con frío solución salina con tampón fosfato (PBS).
  4. Separar las células del frasco usando tripsina 0.25%, suficiente para cubrir la superficie de la placa.
    1. Para ello, pipetear 4 mL de tripsina en un matraz de2 175 cm 70% células confluentes. Incubar las células con tripsina para 3-4 min en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Visualizar las células bajo un microscopio para asegurar la separación de la célula.
    3. Agregar 12 mL de medio DMEM F/12 que contiene FBS para neutralizar la actividad de la tripsina.
  5. Aspire la suspensión de células y colóquelo en un tubo cónico de 50 mL.
  6. Agitar el tubo que contiene las células invirtiendo x-4 3 x.
  7. Opcionalmente, mezclar una alícuota de 10 μl de suspensión celular con 10 μl de azul tripán en un tubo de microcentrífuga y contar las células usando un hemocitómetro. Determinar viabilidad celular restando el número de células de Trypan-blue-positivos del número total de células y dividir por el número total de células.
  8. Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.
  9. Resuspender las células en DMEM libre de suero y antibióticos, en un volumen adecuado para que 1 x 106 células están presentes en 50 μl de los medios de comunicación.
    Nota: Basado en la agresividad de la línea de células in vivo (determinada empíricamente), 1 x 106 células por sitio de inyección por ratón se consideraba apropiado para las células B4B8 y LY2.
  10. Coloque el frasco que contiene la suspensión de células en el hielo.
  11. Coloque la matriz de la membrana del sótano previamente descongelados en hielo.
    Nota: La matriz de la membrana del sótano fue descongelada durante la noche a 4 ° C.

2. células de inyección en ratones

  1. Prepare una mezcla 1:1 de la matriz de la membrana de las células: sótano (50 μL).
  2. Añadir las células primero; Luego, poco a poco pipetear la matriz de la membrana del sótano. Evitar la introducción de burbujas de aire. Asegúrese de que la mezcla se hace inmediatamente antes de la inyección del animal. Adición de células a matriz de la membrana del sótano para un período prolongado de tiempo puede resultar en celular en la mezcla de matriz, lo que dificulta la mezcla agitar rigurosamente. Esto provocará una considerable variabilidad en el tamaño del tumor entre ratones.
  3. Mezclar suavemente. Asegúrese de que todos los pasos que involucra la matriz se realizan en el hielo. Matriz de la membrana basal se polimerizan a temperatura ambiente.
  4. Preparar jeringas para la inoculación.
  5. Jeringas de insulina 0,5 mL (23 G) de la carga con 100 μl de la solución de matriz de la membrana basal de la célula.
  6. Mantenga las jeringas en hielo para evitar la polimerización de la matriz de la membrana del sótano.
  7. Anestesiar ratones colocándolos en una cámara con isoflurano y el oxígeno (2,5%).
  8. Asegúrese de que los ratones son profundamente anestesiados antes de realizar la inyección (asegurándose de que la falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie).
  9. Inserte la aguja en la región bucal derecha o izquierda. Esto se realiza a través del espacio abierto disponible a ambos lados de la boca.
  10. Asegúrese de que lengua del ratón no está en el camino.
    Nota: Es fácil de meter la lengua, que se traducirá en tumores de la lengua. Mover la lengua hacia el lado opuesto si es necesario.
  11. Mantenga la jeringa paralela a la región bucal dentro de la cavidad bucal.
  12. Cuando esté listo para inyectarse, retire la jeringa y lentamente Inserte la jeringa en un ángulo de 10°.
  13. Inyectar 100 μl de la suspensión de matriz de la membrana celular basal durante un período de 5 s.
  14. Sostenga la jeringa en lugar de un adicional 5 s para asegurar todo el material es inyectado.
    Nota: Para los ratones de control nontumor-cojinete, inyectar una mezcla de medios libres de suero y de la matriz (como se describe anteriormente) sin las células del tumor.
  15. Retire la jeringa cuidadosamente.
  16. Seguir el procedimiento anterior con los ratones restantes.
  17. Permitir 1 semana hasta que los tumores comienzan a aparecer grueso (50 – 200 mm3 de las células B4B8 y LY2).

3. seguimiento del ratón

  1. Realizar la primera medición usando pinzas en 1 semana después de la inyección de células de tumor. Para calcular el volumen de tumor usando calibradores externos, determinar el diámetro longitudinal mayor (longitud) y el mayor diámetro transversal (ancho) y utilizar la fórmula elipsoidal modificado14,15.
    figure-protocol-1
  2. Seguir para llevar a cabo medidas pinza regular para el volumen del tumor (x x-2 1 por semana a intervalos regulares).
  3. Medir el peso de los animales para evaluar los efectos del crecimiento del tumor en la alimentación.

4. recolección de tumores

  1. Cuando se alcanza el extremo experimental, eutanasia a los animales usando las medidas apropiadas (por ejemplo, CO2 asfixia, decapitación o la dislocación cervical).
    Nota: En este estudio, el punto final fue alcanzado si los ratones se convirtieron moribundos (con una pérdida de peso > 15% de su peso inicial, falta de aseo, caquexia) o si el tamaño de tumor alcanza 1.000 mm3.
  2. Comenzar la disección del animal mediante la creación de una larga incisión a través de la línea media en la región del cuello.
    1. Uso de fórceps romos para agarrar la piel y afiladas tijeras para cortar la piel.
  3. Introducir tijeras suavemente debajo de la piel que cubre el tumor y crear bolsas de aire, empujando las tijeras a través y en la piel.
  4. Una vez que la piel esté suficientemente separada del tumor, identificar los nodos de linfa de drenaje (DLNs) e impuestos especiales para evitar que el tejido del tumor confundido por la presencia de ganglios linfáticos.
    Nota: Tumores grandes pueden alcanzar o cubrir la DLN. Dependiendo del tipo de ensayo se realiza, el aislamiento de los ganglios linfáticos intactos es esencial para evitar el derramamiento de las células inmunes en el tumor, que darán lugar a sesgar los resultados del ensayo.
  5. Corte a través de las fronteras del tumor hasta que se extrae todo el volumen.

5. tumor de procesamiento para aplicaciones posteriores

  1. Para la examinación histologic aguas abajo, coloque los tumores en formalina al 10% a temperatura ambiente. Para evitar overfixation, sustituir el formol con etanol al 70%. Para el análisis de citometría de flujo, proceso de los tumores como se describe a continuación.
    Nota: El tejido puede conservarse en formol durante 72 h antes de overfixation puede ser problemático para algunos tipos de manchas.
  2. Cortar el tumor en 1-2 mm-tamaño de piezas usando una hoja de afeitar estéril o unas tijeras afiladas.
  3. Colocar las piezas de corte del tumor en un tubo cónico de 50 mL con colagenasa III (4.250 unidades por muestra), DNasa I (0.1 mg por muestra) y el inhibidor de tripsina (1 mg por muestra).
  4. Incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación cada 10 minutos.
    Nota: Las muestras pueden colocarse en una bolsa resellable, esterilizados con etanol al 90% y colocado en una incubadora de cultivo celular.
  5. Después de 30 min, añadir 20 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) y centrifugado a 300 x g durante 5 minutos.
    Nota: HBSS está compuesto por cloruro de potasio, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico y glucosa.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 – 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr). Pipeta con rigor.
    Nota: Tampón de lisis RBC se compone de disodio, cloruro de amonio y bicarbonato de sodio.
  7. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
    Nota: Incubación más largo puede ser tóxico para otras poblaciones de la célula.
  8. Añadir 20 mL de la HBSS para neutralizar el efecto de tampón de lisis.
  9. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  10. Resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS.
  11. Pasar la solución a través de un limitador de nylon 70 μm y centrifugar a 300 x g durante 5 min descarte el sobrenadante.
  12. Repita los pasos 5.8, 5.10 y pasar la suspensión celular a través de un limitador de nylon de 40 μm para garantizar que cualquier escombro adicional se quita de la suspensión.

6. células de tinción y adquisición de datos

  1. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de HBSS.
  2. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado, tal como se describe en el paso 1.7
  3. Determinar el número de células totales y concentración adecuada para la tinción.
    Nota:     la concentración celular ideal para tinción de citometría de flujo es de 1 millón de células. Por ejemplo, si la coloración se realiza en una placa de 96 pocillos y hay 10 millones de células, Resuspender la muestra en 1 mL y la placa de 100 μL para 1 millón de células por pozo.
  4. Añadir bloque Fc (CD16/CD32) a una concentración de 1: 100 con el fin de evitar la fijación específica de nonantigen de las inmunoglobulinas a los receptores FcγIII y FcγII. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    1. Centrifugar y resuspender el precipitado de células en 100 μl de células de citometría de flujo tampón de tinción (compuesto de solución salina que contiene 5% SFB, 2% EDTA y 1% HEPES).
  5. Realizar la superficie de la célula tinción según las instrucciones proporcionadas por el proveedor (añadiendo cada anticuerpos en la dilución). Incubar por 60 min a temperatura ambiente.
    1. Centrifugar y resuspender el precipitado de células en 100 μl de HBSS. Repita 2 x para deshacerse del exceso del anticuerpo.
  6. Ejecutar ejemplos en un citómetro de flujo apropiado.
    1. Si analizando marcadores intracelulares (por ejemplo, foxp3), realizar permeabilización celular y tinción según las instrucciones del proveedor.

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Resultados

La evaluación in vitro de la proliferación celular LY2 y B4B8 mostraron que ambas líneas celulares tienen tiempos de duplicación similares (21 h y 23 h, respectivamente). In vivo, ambas líneas celulares forman una masa única, visible y palpable dentro de 1 semana de inoculación (figura 1A). En ratones tumores LY2, la mandíbula fue desplazada por 3 semanas debido a la carga del tumor (figura 1A). Ratones control que no recibió las...

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Discusión

Riguroso análisis y caracterización del microambiente tumoral representan una estrategia importante para los mecanismos de comprensión del desarrollo del tumor, la progresión y la metástasis y para el desarrollo de terapias efectivas. Cáncer de cabeza y cuello es una enfermedad compleja que puede originar de múltiples sitios anatómicos en la región de cabeza y cuello. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas de células de ratón murino que se aseme...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colagenasa IIIWorthington Biochemical Corp.
DNasa IWorthington Biochemical Corp.
Bloque Fc (CD16/32)BD Biosciences553141  Clonar 2.4G2 
tampón de tinción para citometría de flujoeBioscience00-4222-26
HBSSThermoFisher Scientific14175079calcio, sin magnesio, sin fenotipo rojo
Citómetro de masas HeloisFluidigmNA
Matrigel matriz de membranaCorning CB-40234B
Escáner de resonancia magnéticaBrukerNA7.4 Tesla
Tampón de lisis RBCBioLegend420301
Inhibidor de tripsinaWorthington Biochemical Corp.
LS004183LS006328LS002830

Referencias

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