Presentamos una sencilla técnica citogenética 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar la tasa de fertilización y primaria cociente del sexo de la plaga invasora del haplodiploid Bemisia tabaci.
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Artículo de método
Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética
En este artículo
Resumen
Resumen
Algunas especies de moscas blancas chupando savia son algunas de las plagas más dañinas de terrestres en todo el mundo debido a los daños que causan y que vector de virus de plantas. A pesar de numerosos estudios de la biología de estas especies en diferentes ambientes, un parámetro clave historia de la vida, proporción de sexos de crías, ha recibido poca atención, sin embargo, es importante para predecir la dinámica de la población. El principal sex ratio (cociente del sexo en oviposición) de Bemisia tabaci no se ha divulgado nunca pero puede encontrarse determinando la tasa de fertilización de huevos de este insecto haplodiploid. La técnica implica la dechorionation de huevos con bleach, una serie de pasos de fijación y la aplicación de la general mancha fluorescente del ADN, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, un colorante fluorescente de ADN), para enlazar a los pronúcleos femeninos y masculinos. Aquí, presentamos la técnica y un ejemplo de su aplicación, para probar si una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, había influenciado la principal proporción de sexos de B. tabaci. Este método puede ayudar en los estudios de población de mosca blanca, o determinar si existe asignación sexo con ciertos estímulos ambientales.
Introducción
El estudio de asignación de sexo, o la inversión relativa en la descendencia masculina y femenina, es una piedra angular de la ecología conductual1,2,3. Además de su poder para probar modelos adaptativos de comportamiento, conocer la estrategia de asignación de sexo de un organismo puede mejorar modelos de la dinámica de su población. En muchas especies, asignación de sexo es controlada por las madres. Para determinar la asignación de sexo, es importante determinar la proporción de sexos primaria o la proporción de hembras en el momento de la deposición del huevo. Aunque el c....
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Protocolo
Nota: Asegúrese de que todo trabajo se realiza a temperatura ambiente en un área bien ventilada o bajo una campana de humos. Todas las 'gotas' en el presente Protocolo se definen como 5-20 μl, según la preferencia del operador.
1. primera instalación
- Permiten que las moscas blancas a ovipositan en las hojas limpias. Arenas de oviposición por ejemplo jaulas de clip o las hojas cortadas para caber en el agar en una placa Petri. Hacer un agujero coverable de la jaula clip o cubierta de la placa de Petri para insertar y retirar a los adultos. Como alternativa, poner rápidamente un vaso de adultos recogidos en el hielo....
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Resultados
Para probar si la Rickettsia afecta la tasa de fertilización de las hembras MEAM1 B. tabaci , cría Rickettsia-infectados (R+) o no infectados (R–) de B. tabaci en plantas de caupí (Vigna unguiculata) en separar jaulas a 27 ° C, 70% de humedad relativa y un fotoperíodo oscuro h 16 h luz/8. R+ R– cuarto ínstar moscas blancas fueron cuidadosamente extraídos de hojas y aislados en tubos de tira de 200 μl........
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Discusión
Este protocolo es el primero en capturar la tasa de fertilización o de masculinidad primaria de B. tabaci. El reto de este protocolo es que requiere de los investigadores a aprender cómo manejar los huevos de la mosca blanca rápidamente, asegurándose de que no más de 1 h ha pasado desde que los huevos eran ovipositaron hasta que son fijos. En experimentos preliminares, huevos que fueron fijados en 3 h o más postoviposition eran demasiado viejos para observar fecundación, como había ocurrido syngamy y divisiones .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por una subvención de NSF (DEB-1020460) a M.S.H. y una subvención del USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Los autores agradecen que Brennan Zehr coloración de huevos de mosca blanca con mucha habilidad y Zen. Los autores agradecen que Mike Riehle permitiendo el uso de su microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Marco Gebiola para las imágenes de huevo. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Jimmy Conway para ayudar en momentos cruciales durante los experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Cualquiera | ||
| 1x TBST | Cualquier | 5x hecha de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 y 1,0 g de NaN3 pH 7,5, y llevada a 1 L con agua de grado PCR | |
| Lejía | Clorox | Cualquier lejía doméstica funcionará siempre que se pueda diluir al 0,83% Hipoclorito de sodio | |
| Esmalte de uñas transparente | Cualquier | ||
| DAPI dilactato | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Etanol | Cualquier | diluido al 70% EtOH | |
| Microscopio fluorescente | Nikon Nikon | Eclipse 50i se utilizó en este experimento, pero se puede utilizar cualquier microscopio fluorescente con filtro de excitación de 340/380 nm y aumento de al menos 4-10x | |
| Ácido acético glacial | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glicerol | Para | ||
| este experimento se utilizó un microscopio Wild M5A, pero se puede utilizar cualquier microscopio en el que el operador pueda ver claramente los huevos de mosca blanca. | |||
| Será necesario agregar más medios de montaje para cubiertas de portaobjetos más grandes. | |||
| Portaobjetos de microscopio | Cualquier | ||
| clavija Minuten nadel | BioQuip | 1208SA | Las clavijas Minuten nadel son opcionales para modelar como sondas con puntas de pipeta |
| NaCl | Cualquier | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propil-galato | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Pipetas Bemis | ||
| Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Pipetas desechables de vidrio de borosilicato Pasteur 5.75 in. También puede ser necesario un quemador Bunsen si el operador desea alargar y estrechar las pipetas |
| Agua de grado PCR | Cualquier | ||
| punta de pipeta | Cualquier | Las puntas de pipeta son opcionales para su diseño como sondas con clavijas Minuten Nadel Bombilla | |
| cuentagotas pequeña | Cualquiera | Debe caber en la pipeta Pasteur | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Cualquiera |
Referencias
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R.
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Reimpresiones y permisos
