Artículo de método

Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

DOI:

10.3791/59213

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1 de abril de 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

En este artículo

Resumen

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Presentamos una sencilla técnica citogenética 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar la tasa de fertilización y primaria cociente del sexo de la plaga invasora del haplodiploid Bemisia tabaci.

Resumen

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Algunas especies de moscas blancas chupando savia son algunas de las plagas más dañinas de terrestres en todo el mundo debido a los daños que causan y que vector de virus de plantas. A pesar de numerosos estudios de la biología de estas especies en diferentes ambientes, un parámetro clave historia de la vida, proporción de sexos de crías, ha recibido poca atención, sin embargo, es importante para predecir la dinámica de la población. El principal sex ratio (cociente del sexo en oviposición) de Bemisia tabaci no se ha divulgado nunca pero puede encontrarse determinando la tasa de fertilización de huevos de este insecto haplodiploid. La técnica implica la dechorionation de huevos con bleach, una serie de pasos de fijación y la aplicación de la general mancha fluorescente del ADN, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, un colorante fluorescente de ADN), para enlazar a los pronúcleos femeninos y masculinos. Aquí, presentamos la técnica y un ejemplo de su aplicación, para probar si una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, había influenciado la principal proporción de sexos de B. tabaci. Este método puede ayudar en los estudios de población de mosca blanca, o determinar si existe asignación sexo con ciertos estímulos ambientales.

Introducción

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El estudio de asignación de sexo, o la inversión relativa en la descendencia masculina y femenina, es una piedra angular de la ecología conductual1,2,3. Además de su poder para probar modelos adaptativos de comportamiento, conocer la estrategia de asignación de sexo de un organismo puede mejorar modelos de la dinámica de su población. En muchas especies, asignación de sexo es controlada por las madres. Para determinar la asignación de sexo, es importante determinar la proporción de sexos primaria o la proporción de hembras en el momento de la deposición del huevo. Aunque el cociente del sexo en adultos aparición pueden proporcionar pistas para la asignación de sexo, mortalidad desarrollo diferencial entre los juveniles masculinos y femeninos puede comúnmente sesgar la proporción de sexos adultos substancialmente. En algunas especies de himenópteros, la orden de insectos que incluye hormigas, abejas y avispas, la principal proporción de sexos se ha determinado mediante ensayos citogenéticos, tinción de los embriones para ver genética ADN. Porque agroecosistemas son haplodiploid, un incipiente huevo macho es haploide y contiene sólo el pronúcleo femenino (n), mientras que huevos mujer incipientes son diploides y contienen pronúcleos masculinos y femeninos (2n). Aunque Aleyrodidae, la familia sap-alimentación de chinches (Hemiptera) conocido como moscas blancas, son también haplodiploid, no ha sido un ensayo establecido para encontrar la proporción de sexos primaria en estos insectos. Esto quizás es sorprendente dada la intensidad de estudio de los pocos parásitos serios cosmopolitas en esta familia y la importancia de la proporción de sexos en interacciones competitivas de moscas blancas4,5,6,7 ,8,9,10 y en la dinámica de la población general. En los insectos haplodiploid, cocientes del sexo no tienen restricciones de sistemas de determinación del sexo, permitiendo la posibilidad de la fertilización selectiva y lábiles cocientes del sexo que varían con el medio ambiente2. Presentamos aquí una técnica para determinar la proporción de sexos primaria del complejo de especies de moscas blancas conocidos colectivamente como la mosca blanca del camote, B. tabaci. Este nombre de una especie abarca más de 28 especies en todo el mundo11e incluye algunos de los más dañinos plagas invasoras global12,13. La aplicación de esta técnica para determinar los patrones de asignación de sexo en B. tabaci y otra Aleyrodidae permitirá una investigación más rigurosa de las variables, como temperatura, planta huésped, las bacterias endosimbióticas o planta/mosca blanca patógenos, que pueden influir en mosca blanca primaria sexo relaciones y dinámica de poblaciones de mosca blanca.

Somos inconscientes de cualquier técnica de manchas de huevo comparable de B. tabaci. El protocolo es conveniente en comparación con métodos de tinción utilizados para otros insectos huevos14 ya que omite un paso de fijación durante la noche y por lo tanto, se puede terminar dentro de 3 h. Como un ejemplo de una aplicación, una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, se asocia con sesgo femenino en nuestras líneas de laboratorio de B. tabaci Medio Oriente Asia menor 1 (MEAM1)15,16. En una línea de laboratorio MEAM1 B. tabaci («MAC1,"recogidos desde el centro agrícola de Maricopa), probamos si Rickettsia-infectados (R+) hembras fertilizan más huevos que las hembras no infectadas de (R–).

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Protocolo

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Nota: Asegúrese de que todo trabajo se realiza a temperatura ambiente en un área bien ventilada o bajo una campana de humos. Todas las 'gotas' en el presente Protocolo se definen como 5-20 μl, según la preferencia del operador.

1. primera instalación

  1. Permiten que las moscas blancas a ovipositan en las hojas limpias. Arenas de oviposición por ejemplo jaulas de clip o las hojas cortadas para caber en el agar en una placa Petri. Hacer un agujero coverable de la jaula clip o cubierta de la placa de Petri para insertar y retirar a los adultos. Como alternativa, poner rápidamente un vaso de adultos recogidos en el hielo y, después, depositarlos sobre la hoja. Limitar el tiempo entre la oviposición y fijación de huevo a no más de 60 minutos, para asegurar la observación de la transición de esperma en el pronúcleo paterno en los huevos.
    Nota: Huevos no eliminados de la hoja pueden criarse a la edad adulta para grabar cocientes del sexo adulto.
  2. Antes o durante la oviposición de la mosca blanca, preparar un portaobjetos de microscopio limpiándolo con agua y jabón, secarlo bien y luego estirar un pedazo de parafina película sobre uno de los extremos, asegurándose de que no se rompa la superficie de la película de parafina (figura 1).
    Nota: La película de parafina es hidrófoba y Semiopaco, líquidos para formar gotas y huevos para ser visto más fácilmente.

2. Dechorionation

  1. Con un vaso Pasteur pipeta, añada gotas de solución de lejía (hipoclorito sódico al 0,83%) a la película de parafina.
    Nota: Es más fácil hacer un seguimiento de huevos si sólo son 2 – 3 huevos en cada gota. Por otra parte, para gestionar un número de huevo grande, recoger los huevos en gotas de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).
    PRECAUCIÓN: El blanqueador es corrosivo; Use guantes cuando maneje blanqueador y no inhalan.
  2. Eliminar la mosca blanca adulta de la hoja.
  3. Coloque la hoja debajo de un microscopio para ver claramente los huevos y recoger los huevos por separado y con cuidado con una sonda fina. Para hacer una punta de prueba, inserte un pasador de nadel minuten en 45° o en un ángulo de trabajo cómodo en una punta de pipeta fundido (figura 2).
  4. Transferir los huevos a bleach o PBS 1 x. Si utiliza 1 x PBS, retire 1 x PBS con un vidrio Pasteur pipeta una vez todos los huevos se recogen y, luego, añadir lejía a los huevos.
    Nota: Al recoger huevos, levante lentamente el huevo desde su base hasta que el pedicelo se extrae de la hoja. El pedicelo es pegajoso, y el huevo se adhieren comúnmente a punta de la sonda hasta que se sumergió en el blanqueador.
    Nota: Se recomienda utilizar Pipetas Pasteur de vidrio separado para todos los reactivos, y las pipetas pueden ser modificadas con el calor para hacer las puntas más estrechas y reducir el riesgo de aspiración accidental de huevos de mosca blanca. Para evitar la contaminación y residuos, limpiar las pipetas con agua desionizada después de cada uso.
  5. Espere 10 minutos. Si hay un interés en la embriogénesis en mayores de 1 h de huevos, dejar los huevos en lejía hasta 15 min.
    Nota: Huevos que son hasta 1 h de edad, de 10 minutos es suficiente.

3. fijación

Nota: Estos pasos son tomados de un protocolo de himenópteros17.

  1. Quitar el cloro (que contienen los fragmentos del chorion) con un pipeta Pasteur de vidrio y deséchelo. Agregar gotas de ácido acético glacial con un vidrio Pasteur pipeta y esperan 3 minutos.
    PRECAUCIÓN: Proceder con este paso bajo una campana de humos. Ácido acético glacial es corrosivo; usar guantes al manipular ácido acético glacial y no inhalar, especialmente en combinación con el cloro residual.
  2. Quitar el de ácido acético glacial con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de solución de Clarke (3:1 de etanol absoluto: ácido acético glacial) con un vaso Pasteur pipeta. Espere hasta que se haya evaporado la mayor parte de la solución (o máximo 10 minutos).
  3. Añadir gotas de etanol al 70% a los huevos con una pipeta Pasteur de vidrio y espere hasta que se haya evaporado la mayor parte del etanol (o 10 minutos máximo).

4. coloración

  1. Retire cualquier residual etanol con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de 1 x PBS para los huevos con un vaso de pipeta Pasteur para obtener el pH cerca de 7.0. Coloque el portaobjetos en una cámara de humedad para evitar la desecación, por ejemplo, en una caja de punta de la pipeta vacía con una toalla de papel húmeda dentro (figura 3). Espere al menos 30 minutos.
    Nota: Esto es lo mejor si una pausa es necesaria, como la cámara de humedad puede prevenir la desecación.
  2. Quitar el PBS 1 x con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de 0,1 μg/mL DAPI, una tinción fluorescente del ADN, con un vaso Pasteur pipeta. Establecer el portaobjetos en una cámara oscura y espere al menos 15 minutos.
    PRECAUCIÓN: DAPI es un irritante, para manejar con guantes.

5. lavado

  1. Retire el DAPI con un pipeta Pasteur de vidrio.
  2. Añadir gotas de 1 x TBST (5 x solución de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polisorbato 20 y 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] y llevado a 1 L con agua de grado de polimerización en cadena) a los huevos con un vaso Pasteur pipeta. Esperar 5 minutos antes de retirar el 1 x TBST con un pipeta Pasteur de vidrio. Repetir este paso 2 veces.

6. montaje

  1. Después del último lavado, Pipetear cuidadosamente todos los huevos de la película de parafina sobre una parte limpia de la diapositiva del microscopio. Quitar exceso 1 x TBST; Luego, añada 20 μl de medio de montaje (glicerol al 80% y 20% 1 x TBST con 2% n-propyl-gallate) y coloque un portaobjetos limpia cubierta encima de los huevos.
  2. Para almacenamiento a largo plazo, sello de la diapositiva de cubierta con esmalte de uñas transparente y, luego, guardar la diapositiva en la oscuridad entre 2 ° C o inmediatamente lo ve bajo un microscopio de fluorescencia.

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Resultados

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Para probar si la Rickettsia afecta la tasa de fertilización de las hembras MEAM1 B. tabaci , cría Rickettsia-infectados (R+) o no infectados (R–) de B. tabaci en plantas de caupí (Vigna unguiculata) en separar jaulas a 27 ° C, 70% de humedad relativa y un fotoperíodo oscuro h 16 h luz/8. R+ R– cuarto ínstar moscas blancas fueron cuidadosamente extraídos de hojas y aislados en tubos de tira de 200 μl....

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Discusión

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Este protocolo es el primero en capturar la tasa de fertilización o de masculinidad primaria de B. tabaci. El reto de este protocolo es que requiere de los investigadores a aprender cómo manejar los huevos de la mosca blanca rápidamente, asegurándose de que no más de 1 h ha pasado desde que los huevos eran ovipositaron hasta que son fijos. En experimentos preliminares, huevos que fueron fijados en 3 h o más postoviposition eran demasiado viejos para observar fecundación, como había ocurrido syngamy y divisiones ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue financiada por una subvención de NSF (DEB-1020460) a M.S.H. y una subvención del USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Los autores agradecen que Brennan Zehr coloración de huevos de mosca blanca con mucha habilidad y Zen. Los autores agradecen que Mike Riehle permitiendo el uso de su microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Marco Gebiola para las imágenes de huevo. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Jimmy Conway para ayudar en momentos cruciales durante los experimentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBSCualquiera
1x TBSTCualquier5x hecha de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 y 1,0 g de NaN3 pH 7,5, y llevada a 1 L con agua de grado PCR
LejíaCloroxCualquier lejía doméstica funcionará siempre que se pueda diluir al 0,83% Hipoclorito de sodio
Esmalte de uñas transparenteCualquier
DAPI dilactatoSanta Cruz Biotechnologysc300415
EtanolCualquierdiluido al 70% EtOH
Microscopio fluorescenteNikon NikonEclipse 50i se utilizó en este experimento, pero se puede utilizar cualquier microscopio fluorescente con filtro de excitación de 340/380 nm y aumento de al menos 4-10x
Ácido acético glacialMallinckrodtUN2789
GlicerolPara
este experimento se utilizó un microscopio Wild M5A, pero se puede utilizar cualquier microscopio en el que el operador pueda ver claramente los huevos de mosca blanca.
Será necesario agregar más medios de montaje para cubiertas de portaobjetos más grandes.
Portaobjetos de microscopioCualquier
clavija Minuten nadelBioQuip1208SALas clavijas Minuten nadel son opcionales para modelar como sondas con puntas de pipeta
NaClCualquier
NaN3Any
n-propil-galatoSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmPipetas Bemis
PasteurFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Pipetas desechables de vidrio de borosilicato Pasteur 5.75 in. También puede ser necesario un quemador Bunsen si el operador desea alargar y estrechar las pipetas
Agua de grado PCRCualquier
punta de pipetaCualquierLas puntas de pipeta son opcionales para su diseño como sondas con clavijas Minuten Nadel Bombilla
cuentagotas pequeñaCualquieraDebe caber en la pipeta Pasteur
TrisAny
Tween-20Cualquiera
solución

Referencias

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