Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Summary

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

Abstract

La importancia de cultivos in vitro de 3D se acentúa considerablemente en cultura de célula y tejidos. Sin embargo, la falta de repetibilidad experimental es una de las restricciones. Produciendo pocos resultados repetibles de formación, deteriora el análisis de los mecanismos subyacentes a la propia organización. Reducción de la variación en las condiciones de cultivo inicial, como la densidad de la célula y la distribución en la matriz extracelular (ECM), es crucial para mejorar la repetibilidad de una cultura 3D. En este artículo, se demuestra un procedimiento sencillo pero robusto para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener las formaciones patrón altamente repetible. Micromold con forma deseada fue fabricado utilizando Fotolitografía o un proceso de mecanizado, y formó un bolsillo 3D en el ECM contenido en un cubo de gel híbrido (HGC). Células altamente concentradas entonces se inyectaron en el bolsillo de manera que la forma de racimo de células con la forma del molde fabricado. La HGC empleada permitió multidireccional de su rotación, lo que permitió la proyección de imagen de alta resolución y la captura de la estructura de tejido entero aunque se utilizó una lente de baja magnificación. Células epiteliales bronquiales humanas normales fueron utilizadas para demostrar la metodología.

Introduction

La importancia de una cultura 3D, que mejor simula entornos biológicos que hace una cultura 2D, se acentúa considerablemente en el tejido de la célula cultura^1,2,3. La interacción entre las células y matriz extracelular (ECM) proporciona pistas importantes sobre morfogénesis^4,5. Muchas formaciones de tejido pueden surgir sólo en entornos 3D, como el plegamiento proceso^6,7, invaginación⁸formación tubular^9,

Protocol

1. fabricación de híbrido gel cubo dispositivo

1. Preparar una estructura cúbica de policarbonato (PC) mediante un proceso de mecanizado o una impresora 3D. El tamaño de la estructura de PC depende del tamaño de la muestra. En este estudio, utilizamos un marco de 5 mm a cada lado para que las ramas tenían suficiente espacio para estirarse durante el cultivo.
2. Coloque el marco de la PC en un portaobjeto previamente enfriado u otra superficie lisa en una caja de hielo (< 0 ° C) (figura 1A).
3. Añadir 12 μl de agarosa 1.5% precalentado (w/v) de la cara superior de la estructura cúbica en la superficie inferior con una ....

Results

Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) fueron utilizadas para demostrar la metodología ilustrada y control de la geometría de la celda colectiva inicial para lograr una forma de cilindro y una forma de prisma, respectivamente, en un ambiente de ECM. Se presentan los resultados imagenológicos multidireccionales por contraste de fases, así como phalloidin tinción de una forma del cilindro (Figura 4AB) y la forma de prisma (

Discussion

El método presentado en este trabajo es simple y puede realizarse sin equipos de alta tecnología. Al mismo tiempo, puede obtenerse un resultado del control preciso de la célula cluster forma en el espacio 3D de hidrogel. Después del control inicial, las células pueden crecer en el HGC, tanto como se cultivan en un plato. La proyección de imagen multi-direccional se realiza girando la muestra con la HGC utilizando cualquier sistema de microscopía, y mejora significativamente la calidad de imagen. La elección de los materi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 12 pocillos	Corning  Inc.	3513
Acetato de 2-metoxi-1-metiletilo	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% de paraformaldehído	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarosa, baja temperatura de gelificación  Biorreactivo	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM kit de balas	Lonza	CC-3170	Medio especializado para células NHBE
Solución de albúmina sérica bovina (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit Lonza		CC-3162	Medio especializado para células endoteliales
Lípidure	NOF co.		Polímero
MPC Matrigel factor de crecimiento matriz de membrana basal reducida	Corning  Inc.	354230
Suero de cabra normal (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Células epiteliales bronquiales humanas normales	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Resina base y catalizador para PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Fotorresistencia negativa gruesa (espesor: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416