Presentamos aproximaciones experimentales para estudiar interactianos de RNA de doble cadena RNA Unión proteína quinasa RNA-activado (PKR) durante el ciclo celular mamífero con células HeLa. Este método utiliza formaldehído complejos RNA-PKR la reticulación y la inmunoprecipitación para enriquecer PKR-limite RNAs. Estos RNAs pueden analizarse más a través de la secuenciación de alto rendimiento o qRT-PCR.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera
En este artículo
Resumen
Resumen
Kinase de proteína RNA-activado (PKR) es un miembro de las proteínas de la respuesta inmune innata y reconoce la estructura secundaria de doble cadena de ARN viral. Cuando se enlaza a los RNAs virales de doble hebra (dsARN), PKR experimenta la dimerización y autophosphorylation posterior. PKR fosforilada (pPKR) se activa e induce la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α) para suprimir el traductor global. Creciente evidencia sugiere que PKR puede activarse en condiciones fisiológicas durante el ciclo celular o bajo diferentes condiciones de estrés sin infección. Sin embargo, nuestra comprensión de los activadores de RNA de PKR es limitado debido a la falta de un método experimental estandarizado para capturar y analizar la interacción PKR dsRNAs. Aquí, presentamos un experimental protocolo específicamente enriquecer y analizar PKR obligado RNAs durante el ciclo celular con células HeLa. Utilizamos la actividad eficiente de la reticulación de formaldehído para fijar complejos ARN-PKR y aislarlos mediante inmunoprecipitación. PKR co-immunoprecipitated RNAs pueden entonces ser procesados para generar una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Una clase importante de dsRNAs celular interactuando PKR es RNAs mitocondriales (mtRNAs), que pueden existir como dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y las RNAs de filamento de la luz. Para estudiar el strandedness de estos mtRNAs duplex, también presentamos un protocolo específico de filamento qRT-PCR. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de PKR-limite RNAs, pero puede ser fácilmente modificado para estudiar celular dsRNAs o RNA-interactianos de otras proteínas de Unión dsRNA.
Introducción
La proteína quinasa RNA-activado (PKR), también conocido como eucariótico de iniciación factor 2-alfa 2 (EIF2AK2), es una quinasa bien caracterizado que transmite informaciones de RNAs. Pertenece a la alfa de la subunidad de iniciación 2 traducción en eucariotas (eIF2α) familia cinasa y fosforila eIF2α en serina 51 en respuesta a la infección para suprimir traductor global1. En este contexto, el PKR es activado por RNAs virales de doble hebra (dsARN), que proporcionan una plataforma para PKR dimerización y autophosphorylation2. Además de eIF2α, PKR puede también fosforilan p53, sustrato del receptor de insulina 1, inhibi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. solución y célula preparación
- Preparación de la solución
- Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM).
Nota: Pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo celular, pero no utilizamos antibióticos. - Para el 0,1% paraformaldehido, disolver paraformaldehído al 4% (p/v) de 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con calefacción en un plato caliente y diluido para hacer 30 mL de paraformaldehído al 0,1% (v/v) mediante la adición de 1 x PBS.
PRECAUCIÓN: Realizar todos los pasos en una campana de humos y tenga cu....
- Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Un esquema para el proceso de detención de las células HeLa en la fase S o M del ciclo celular se muestra en la figura 1. Para una muestra de fase detenido M, claramente podemos visualizar células redondas formadas bajo el microscopio (figura 2A). Para examinar la eficacia de la detención del ciclo celular, el contenido nuclear de la célula puede ser analizado utilizando FACS (figura 2B). La figura 3 muestra datos represe.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El proceso de preparación de muestras detenidas en fase S o M se ilustra en la figura 1. Para detener las células en la fase S, se utilizó un método de doble bloque de timidina donde tratamos las células con timidina dos veces con un lanzamiento de 9 h en el medio para asegurar eficacia de detención alto (figura 1A). De detención de la fase de M, tratamos a las células una vez con timidina seguido de un lanzamiento de 9 h y después se aplicaron nocodazole bloque.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea Ministerio de ciencia y TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,5 m EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 m Tris, pH 7,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 m Tris, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X Tampón de carga de ADN | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL tubo cónico | SPL | 50015 | |
| Adaptador | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3 | ||
| M Acetato de sodio pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptador | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 m NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| tubo cónico de 50 mL | SPL | 50050 | |
| Cloroformo ácido-fenol, pH 4,5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Las perlas magnéticas limpian el ADN/ARN |
| de la fosfatasa alcalina antártica | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Hecho en casa | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Tecnología de señalización celular | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Sal sódica azul de bromofenol | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Fosfatasa | alcalina intestinal de terneraTaKaRa | 2250A | |
| Raspador de células 25 cm 2 posiciones | Sarstedt | 83.183 | |
| promotora CMV | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco's | ||
| medio de águila modificado | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mezcla (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Etanol, Absoluto, Grado ACS | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Suero fetal bovino | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamida | Merck | 104008 | |
| Glicina | Bio-básica | GB0235 | |
| Coprecipitante GlycoBlue (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | Kit de depleción de ARNr | E6318 | New England Biolabs |
| Nocodazol | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| de señalización de células | IgG de conejo normal | 2729S | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR cebador directo (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| Índice de PCR cebador inverso (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'Tubos | ||
| de PCR con tapa plana, 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Tableta de solución salina con bufer de fosfato (PBS) | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad | New England Biolabs | M0530 | Polimerasa |
| de alta fidelidadMicrocentrífuga PlateFuge con rotor basculante | Benchmark | c2000 | |
| Polinucleótido quinasa (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinasa K, recombinante, grado PCR | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| secuencia de cebadores qPCR: CO1 Pesado | adelante/atrás: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CO1 Light | Forward/Reback: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CO2 Pesado | Adelante/Atrás: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CO2 Light | Forward/Reback: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CO3 Heavy | Forward/Reback: 5′-CCTTTTACCACCACCCCCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CO3 Light | Forward/Reback: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CYTB Heavy | Forward/Reback: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: CYTB Light | Forward/Reback: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: GAPDH | Adelante/Atrás: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND1 Pesado | hacia adelante/atrás: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND1 Light | Forward/Reback: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND4 Pesado | hacia adelante/atrás: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND4 | Light Forward/Reback: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND5 Pesado | hacia adelante/atrás: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND5 Light | Forward/Reback: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND6 Pesado | hacia adelante/atrás: 5′-TCATACTCTCTCTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores qPCR: ND6 Light | Forward/Reback: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Hexámero aleatorio | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Dnasa I recombinante (sin ARNasa) (5 U/μ L) | TaKaRa | 2270A | |
| Inhibidor recombinante de la rnasa (40 U/μ L) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Kit de eliminación | Illumina | MRZH116 | rRNA Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT secuencia de cebadores: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGGCGGTGTGTTAG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| Secuencia de cebador RT: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| Secuencia de cebador RT: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTGTGTGTGATGATG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| Secuencia de cebadores RT: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Tubo G de polipropileno siliconado de 1,5 mL | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Dedecil sulfato de sodio | Biosesang | S1010 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERasa Inhibidor de la rnasa | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III transcriptasa inversa | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Transcriptasa inversa para la preparación de bibliotecas |
| Transcriptasa inversa SuperScript IV Thermo | Fisher Scientific | 18090010 Transcriptasa inversa para qRT-PCR | |
| SYBR tinción gl de ácido nucleico de oro | Thermo Fisher | Scientific S11494 | |
| Polinucleótido quinasa T4 | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 ARN ligasa 2, truncado KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| ThermoMixer | Eppendorf ThermoMixer C con ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tampón Tris-borato-EDTA (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Perlas de sefarosa de proteína A | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Perlas de proteína A |
| Ultrasonicador | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Mezclador de vórtice | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xileno cianol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3,3 y mu; M) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Referencias
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
