Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Principios de detección de medicamentos del sistema nervioso en un pertinente y confiable en el modelo de cellulo BBB para su penetración y su interacción con la barrera y el parénquima cerebral sigue siendo una necesidad insatisfecha. Para llenar este vacío, hemos diseñado un 2D en modelo de cellulo, BBB-Minibrain, mediante la combinación de una membrana porosa cultura inserto humano BBB modelo un Minibrain formado por una tri-cultura de células de cerebro humano (neuronas, astrocitos y células de la microglía) de poliéster. El BBB-Minibrain nos permitió probar el transporte de un candidato a fármaco neuroprotector (p. ej., Neurovita), a través de la BBB, para determinar la focalización específica de esta molécula a las neuronas y para mostrar que la propiedad neuroprotectora de la droga se conserva después de la droga había cruzado el BBB. También hemos demostrado que BBB-Minibrain constituye un interesante modelo para detectar el paso de las partículas del virus a través de la barrera de las células endoteliales y a controlar la infección de la Minibrain neuroinvasive partículas del virus. El BBB-Minibrain es un sistema fiable, fácil de manejar para investigador entrenado en la tecnología de cultivo celular y predictivo de los fenotipos de las células del cerebro después del tratamiento o insulto. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: introducción de derisking pasos temprano en el desarrollo de drogas en una mano y reducir el uso de animales en experimentación por otro lado.
Introducción
El cerebro se separa de la circulación sistémica por una estructura no-permeable que restringe los intercambios entre el parénquima del cerebro y la sangre, llamada barrera blood - brain (BBB). Compuesto principalmente de células endoteliales cerebrales, el BBB interactúa dinámicamente con astrocitos, microglía perivascular y las neuronas del parénquima cerebral vecino. Las tres funciones principales de la BBB son la creación y mantenimiento de la homeostasis iónica de funciones neuronales, fuente del cerebro con nutrientes y protección de lesiones tóxicas o entrada de agentes patógenos1,2, que contribuyen a e....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. la célula de trabajo de la cultura de Ntera/CL2. D1 para preparar un cocultivo de hNeurons poste-mitotic y hAstrocytes (NT2-no disponible)
Nota: Este es el componente de Minibrain (figura 1).
- Cultivo de la Ntera/Cl2.D1
- Retire un frasco de las células del tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
- Descongelar las células rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
- Transferencia de las células en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de medio completo DMEM F12 (medio de Eagle modificado de Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12) suplementado con 10% suero bovino f....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El BBB-Minibrain es un cellulo en experimental modelo de interfaz de sangre del cerebro.
El BBB-Minibrain está configurado en el sistema de inserción de cultura membrana poliéster para imitar un compartimiento de la sangre en el nivel superior y un compartimiento del cerebro en el nivel inferior de la interfaz de sangre-cerebro (figura 2AB). Consiste en un compartim.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este artículo hemos demostrado cómo construir una cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y la cultura de mezcla cerebro células cerebrales (Minibrain) en un solo equipo. Este sistema es biológicamente relevante, fácil de configurar y manejar para experimentadores bien ensen $ ados en cultivo celular.
En cuanto a cualquier otro modelo in vitro de BBB, se obtendrían resultados confiables si se aplica el drástico control de la tirantez de la barrera. Re.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
La propiedad intelectual del sistema fue las patentes referidas a 32, 35 y 38.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por becas internas del Instituto Pasteur incluyendo una subvención de Incitative (PTR 435) y por una donación "Contrat de Soutien à la Recherche" de Sanofi Pasteur Institut Pasteur. A. da Costa fue apoyada por la concesión de Sanofi-Pasteur y Florian Bakoa es beneficiario de una beca de doctorado proporcionada por la ANRT (Asociación Nacional de la Recherche et de la Technologie). Estamos agradecidos a Pr Pierre-Olivier Couraud y Dr. Florencia Molinero por discusiones útiles.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 12 pocillos | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2' desoxiuridina | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Placa de Petri | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-etanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | A petición del Dr. Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Citosina β-D-arabinofuranósido | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Placas oscuras de 96 pocillos | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO Merck-Sigma Aldrich | D2650 | ||
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | medio de células endoteliales |
| Etanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehído | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Cabra-Anti Ratón | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Cabra-Anti Conejo | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS con Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminina | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamina | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Amarillo | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| con Paraformaldehído | 15714 | ||
| PBS sin Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pluma/Estreptococo | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-D-Lisina | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rata Colágeno I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Ácido retinoico All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| Kit de purificación de ARN | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Bicarbonato de sodio 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Piruvato de sodio | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Matraz | Sarstedt | 83-1813-302 | Matraz de poliestireno para cultivo de tejidos con tratamiento superficial específico (Cell+) para células adherentes sensibles |
| Transwell | Corning | 3460 | insertos de cultivo de membrana porosa de poliéster |
| Tripsina-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Agua ultrapura | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vial |
Referencias
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Modelo de la barrera hematoencefálicamodelo de la BHE humanacultivo de minicerebropermeabilidad de las células endotelialestransporte de amarillo de luciferdetección del paso de virustransporte de fármacos Neurovitabiomolécula de direccionamiento neuronalcélulas endoteliales microvasculares cerebralesinserto de cultivo de membrana de poliéster
