Artículo de método

Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro

DOI:

10.3791/59220

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9 de abril de 2019

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1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Principios de detección de medicamentos del sistema nervioso en un pertinente y confiable en el modelo de cellulo BBB para su penetración y su interacción con la barrera y el parénquima cerebral sigue siendo una necesidad insatisfecha. Para llenar este vacío, hemos diseñado un 2D en modelo de cellulo, BBB-Minibrain, mediante la combinación de una membrana porosa cultura inserto humano BBB modelo un Minibrain formado por una tri-cultura de células de cerebro humano (neuronas, astrocitos y células de la microglía) de poliéster. El BBB-Minibrain nos permitió probar el transporte de un candidato a fármaco neuroprotector (p. ej., Neurovita), a través de la BBB, para determinar la focalización específica de esta molécula a las neuronas y para mostrar que la propiedad neuroprotectora de la droga se conserva después de la droga había cruzado el BBB. También hemos demostrado que BBB-Minibrain constituye un interesante modelo para detectar el paso de las partículas del virus a través de la barrera de las células endoteliales y a controlar la infección de la Minibrain neuroinvasive partículas del virus. El BBB-Minibrain es un sistema fiable, fácil de manejar para investigador entrenado en la tecnología de cultivo celular y predictivo de los fenotipos de las células del cerebro después del tratamiento o insulto. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: introducción de derisking pasos temprano en el desarrollo de drogas en una mano y reducir el uso de animales en experimentación por otro lado.

Introducción

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El cerebro se separa de la circulación sistémica por una estructura no-permeable que restringe los intercambios entre el parénquima del cerebro y la sangre, llamada barrera blood - brain (BBB). Compuesto principalmente de células endoteliales cerebrales, el BBB interactúa dinámicamente con astrocitos, microglía perivascular y las neuronas del parénquima cerebral vecino. Las tres funciones principales de la BBB son la creación y mantenimiento de la homeostasis iónica de funciones neuronales, fuente del cerebro con nutrientes y protección de lesiones tóxicas o entrada de agentes patógenos1,2, que contribuyen a el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y sus funciones3. Esta barrera es tan eficiente que sólo algunas drogas pueden cruzar el BBB4,5. En la actualidad, los métodos disponibles para predecir si una molécula pasará el BBB y difusa en el cerebro consisten en ex vivo estudios sobre seguimiento de imagen material, autopsia del cerebro de voluntarios humanos por MRI (resonancia magnética) o PET (posición de emisión tomografía) o farmacodinámica y farmacocinética preclínica en animales6,7,8. Estas técnicas y modelos tienen algunas limitaciones, tales como la limitada resolución del PET y la baja sensibilidad de MRI6,8, la dificultad para cuantificar moléculas (es decir, moléculas de anticuerpo base por ejemplo) que mal penetrar el cerebro7, para la preclínica estudios y su alto costo y su complejo de pruebas en animales.

El último punto es importante porque, según el 3R reglas (reemplazo, reducción y refinamiento de los experimentos con animales) han pedido a las administraciones reguladoras que los investigadores urgentemente desarrollan científicamente correcta alternativa a animal experimentación9,10,11,12,13,14,la15.

En las últimas décadas, varios modelos in vitro de BBB han propuesto16,17,18 por cultivar en filtro de membrana inserta las células endoteliales de diferentes especies como el ratón, rata, bovino y cerdo. En cuanto a la especie humana, la escasa y difícil disponibilidad de células primarias incitó a los investigadores a desarrollar modelos humanos basados en las células endoteliales de cerebro inmortalizado o células madre procedentes de humanos19,20, 21. Estas barreras son adecuadas in vitro sustitutos de BBB que expresan marcadores de células endoteliales, marcadores de ensambladura apretada, transportadores de eflujo, portadores de soluto, receptores y responder a los estímulos endotelial 20. Se ensayaron algunos modelos BBB mediante filtro membrana insertos recubiertos con células endoteliales y otros tipos de células (es decir, astrocitos, neuronas o del22,del pericitos23,24). El objetivo de estas culturas Co fue aumentar las características físicas de BBB aprovechándose de la secreción de factores solubles por astrocitos/neuronas o del pericitos.

Sin embargo, ninguno de estos modelos incluye tejido cerebral para estudiar y predecir el destino de un candidato una vez ha pasado la barrera. Por lo tanto, nuestro objetivo era construir un cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y un cultivo de neuronas mezcladas en un solo equipo. El BBB-Minibrain utiliza un sistema de cultivo que consiste en un filtro poroso en un pozo de una placa de cultivo celular pocillos. El filtro está recubierto con células hCMEC/D3, una línea de células endoteliales del cerebro humano que ha demostrado ser altamente confiable para prueba25,26,27, para formar el BBB de la droga BBB. Minibrain, que es una cultura Co diferenciada de las neuronas humanas y astrocitos derivados de la NTera/Cl2.D1 de la célula línea28,29 mezclan junto con la línea de células microgliales humano CHME/Cl530 en proporción correspondiente a la microglia vs relaciones neurona-astrocitos del cerebro31, se cultiva en la parte inferior de la placa del bien.

Además de estudiar el pasaje de drogas a través de la BBB y su destino en el parénquima, el interfaz de sangre-cerebro en cellulo modelo podría ser una poderosa herramienta para abordar la entrada de patógenos en el cerebro (neuroinvasiveness), la dispersión en el cerebro (neurotropismo) y la toxicidad (neurovirulencia) puede ejercer sobre las células del parénquima cerebral. Neurovirulencia y neuroinvasiveness estudios benefician el desarrollo de un eficiente modelo de cellulo y ventajosa para reemplazar a los modelos animales. Usando el kit de BBB-Minibrain32, demostró el fenotipo neuroinvasive de raros mutantes virales que acumula en la cepa del virus neurotrópico francés del Virus de la fiebre amarilla (es decir, FNV-YFV33,34) para preparar un suspender la vacuna viva de YFV y el paso de una biomolécula neuroprotectivos y neuroprotectoras llamado Neurovita (referido como NV en adelante en el manuscrito)35. Porque NV ni naturalmente cruza la membrana celular ni el BBB, NV fue fundido con la parte variable (VHH) de anticuerpos de cadena única llama que atraviesa las membranas biológicas incluyendo la BBB y funciona como una célula penetrando molécula (CPM)36. La propiedad CPM de VHH parece depender del punto isoeléctrico y la longitud de los VHH37.

En prueba de cellulo debe hacerlo posible ordenar las moléculas que potencialmente podrían cruzar el BBB antes de realizar farmacocinética y farmacodinámica análisis en animales e idealmente en el mismo tiempo ser capaz de predecir su comportamiento nervioso parénquima. Este sistema es biológicamente relevante y fácil de configurar y manejar por profesionales bien formados en la célula cultura26,29,30,38. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: reducir los costos de ensayos preclínicos en la una mano y reducir el uso de pruebas en animales por otra parte.

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Protocolo

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1. la célula de trabajo de la cultura de Ntera/CL2. D1 para preparar un cocultivo de hNeurons poste-mitotic y hAstrocytes (NT2-no disponible)

Nota: Este es el componente de Minibrain (figura 1).

  1. Cultivo de la Ntera/Cl2.D1
    1. Retire un frasco de las células del tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
    2. Descongelar las células rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
    3. Transferencia de las células en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de medio completo DMEM F12 (medio de Eagle modificado de Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM glutamina, 100 UI de penicilina y 100 μg estreptomicina (es decir, completa Medio de F12 DMEM).
    4. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Disociar el sedimento en 2 mL de medio completo DMEM F12.
    5. Transferir en un matraz de cultivo de tejidos T75 en poliestireno con tratamiento específico para células adherentes sensibles (T75Cell+) que contiene 13 mL de medio completo DMEM F12.
    6. Las células en una incubadora que mantiene a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia de la cultura (es decir, alrededor de 5 días). Cambiar el medio cada 2-3 días.
  2. Subcultivo de la Ntera/Cl2.D1 y la amplificación
    1. Retire el medio del frasco.
    2. Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) suplementada con Ca2 + y Mg2 +.
    3. Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución de EDTA (mantenida a temperatura ambiente).
    4. Añadir 3 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% tripsina EDTA 0,02%) e incubar 2 minutos a TA.
    5. Agitar el frasco y asegúrese de que las células son separadas de la superficie de plástico.
    6. Añadir 10 mL de medio completo DMEM F12 para inactivar la tripsina, la transferencia en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g a TA.
    7. Disocian el sedimento con 10 mL de medio completo y use hasta 1 mL para inocular cada nuevo matraz que contiene 14 mL de medio completo DMEM F12.
      Nota: Treinta frascos T75 celular+ son necesarios para la diferenciación de cada uno.
    8. Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia.
  3. Diferenciación de NTera/Cl2.D1 en la cultura Co humano neurona-astrositos
    Nota: Este es el principal componente de la Minibrain.
    1. En el día 0, disociar las células con tripsina-EDTA como se describe en el paso 1.2 y disociar el sedimento celular de cada frasco con 2 mL de medio completo DMEM F12.
    2. Añadir 1 mL de la suspensión celular (correspondiente a 5 x 106 células) en cajas Petri de plástico 60 de 85 mm de diámetro que contiene 11 mL de medio completo DMEM F12.
      Nota: Las células no se adherirá al plástico y se agregan de forma pseudo neuroesferas (ver fotografía en la parte inferior de la figura 1). Incubar las cajas 60 Petri a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad para un día.
    3. En el día 1, agregar 1 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 130 μm de all-Trans retinoico (ATRA) por caja de Petri (concentración final ATRA 10 μm) y devolver las placas a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad durante 24 horas.
    4. En el día 2, transferir cuidadosamente el medio con esferas de células de cada Petri Dish en un tubo de 50 mL y centrifugar durante 10 min a x 50 g y RT Desvínculo cuidadosamente el sedimento suelto con 13 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 10 μm ATRA y añadir th e 13 mL en una nuevo 85 mm de diámetro placa de Petri.
      Nota: Sobre los diferentes pasos, es muy importante mantener la densidad de las esferas tan alta como la densidad obtenida en el día 2 (es decir, alrededor de una densidad de 70%). Por lo tanto, si la densidad de la esfera es bajar, reducir el número total de platos de Petri según el número de células.
    5. Repita el procedimiento anterior (paso 1.3.4) a los días 4, 6 y 8.
    6. En 10 días, repita el procedimiento anterior pero agregar las esferas a los matraces T75 celular+ en lugar de platos de Petri. Añadir las células de una placa de Petri en un matraz de T75 celular+ .
    7. Días 11, 13, 15 y 17, cambiar el medio usado con 14 mL de completa F12 de DMEM suplementado con 10 μm ATRA.
    8. En el día 19, cambio medio con 14 mL de medio DMEM F12 completo sin ATRA por frasco.
    9. En el día 20, disociar suavemente las células con tripsina/EDTA como sigue.
      1. Cada matraz T75 celular+ , de lavar las células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +; Incubar las células con 4 mL de EDTA por 5 min a TA.
      2. Retire con cuidado el EDTA y 2 mL de tripsina-EDTA e incubar 7 min en RT. Agitar suavemente el matraz y añadir cuidadosamente 8 mL de medio completo DMEM F12.
      3. Centrifugar 10 min a 160 x g y RT. disociar el precipitado de células en 13 mL de medio completo DMEM F12 y transferencia en un matraz T75 celular+ .
        Nota: La disociación muy suave con tripsina-EDTA permitirá recuperar el ATRA distingue las células de las células originales de teratocarcinoma, que se unen fuertemente a la vajilla de plástico.
    10. Al día 21, quite el medio y las células muertas. Añadir 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI penicilina, 100 μg estreptomicina y 0.5 μm de AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completa 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. A los días 23, 25 y 28, reemplazar utiliza medio con 14 mL de 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. A 29 días hasta 49 (cada dos días), reemplazar utiliza medio con 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 μg estreptomicina, 5 μm de FudR (5-fluoro-2' deoxiuridina) y 10 μm Urd (uridina) (completado 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. En el día 50, reemplazar utilizada medio con 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% SFB, 2 mM glutamina, 100 UI de penicilina, 100 μg estreptomicina y 10 μm Urd (completa 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. En 51 días hasta 95 (dos veces por semana), reemplazar utiliza medio con 14 mL de completa 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Nota: Las células pueden ser utilizado para experimentos de día 51 pero no más tarde de día 95. El uso de seriales tratamientos con inhibidores de la mitosis permite recuperar población pura de la cultura de hNeuron poste-mitotic y hAstrocytes (NT2-no disponible).
    15. Para las células de la semilla, proceder a tripsinización suave como se describe para el día 20.

2. célula cultura trabajo de microglial humano células CHME/Cl5

Nota: Este es el componente de la microglía de la Minibrain (Figura 1).

  1. Cultivo la microglía humano células CHME/Cl5
    1. Retire un frasco de las células desde el tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
    2. Descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
    3. La transferencia de las células en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina y 100 μg estreptomicina (es decir, medio completo DMEM F12 de FBS 5%).
    4. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a TA. Desvínculo el sedimento con 2 mL de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
    5. Transferir en un matraz T75 celular+ 13 ml de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
    6. Células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia. Cambiar el medio cada 2-3 días.
  2. Subcultivo de las células microgliales humano CHME/Cl5
    1. Retire el medio del frasco.
    2. Lavar la monocapa de células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +.
    3. Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución de EDTA (mantenida a temperatura ambiente).
    4. Añadir 3 mL de solución de tripsina-EDTA e incubar 2 minutos a TA.
    5. Agitar el frasco y asegúrese de que las células son separadas de la superficie de plástico.
    6. Añadir 10 mL de medio completo de FBS DMEM F12 5% para inactivar la tripsina, la transferencia en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g y RT.
    7. Disocian el sedimento con 10 mL de medio completo y use hasta 1 mL para inocular cada nuevo matraz que contiene 14 mL de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
    8. Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia.

3. la cultura de trabajo con la hCMEC/D3 capa porosas insertos y preparar BBB

  1. Cultivo de las células endoteliales humanas hCMEC/D3 (figura 2)
    1. Diluir el tipo de colágeno la rata a la 1:30 con agua pura estéril (grado de cultura de célula).
    2. Transferir 10 mL a un matraz T75 celular+ e incubar 2 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% humedad incubadora.
    3. Retirar la solución de colágeno y reemplazarlo con 15 mL de medio de célula endotelial suplementado con 10 mM de HEPES (referido como medio completo celular endotelial).
    4. Retire un frasco de cryo de células desde el tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
      Nota: Las células fueron cultivadas, y un lote de semilla se realizó según lo descrito por el fabricante. La línea celular está cubierta por un acuerdo de transferencia de material biológico. Las células se obtienen en el número 25 de paso y no se deben utilizar más el paso 35.
    5. Descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
    6. Transferencia de las células en el matraz T75 celular+ y devolver el frasco a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad para 2 a 4 h.
    7. Retire con cuidado el medio sin perder o eliminar células. Enjuague las celdas una vez con 10 mL de medio completo celular endotelial.
    8. Añadir 15 mL de medio completo celular endotelial.
    9. Células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta el 100% de confluencia (no menos de 4 días) sin cambiar el medio.
  2. Subcultivo del hCMEC/D3 para preparar el relleno de la BBB
    1. Cubrir un nuevo matraz T75 celular+ o insertos con el tipo I colágeno de rata como se describió anteriormente (paso 3.1).
    2. Retire el medio del frasco. Lavar la monocapa de células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +.
    3. Añadir 2 mL de solución de tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C.
    4. Agitar el frasco y asegúrese de que las células son completamente separadas de la superficie de plástico.
    5. Añadir 4 mL de medio de célula endotelial completa inactivación de la tripsina.
    6. Con una pipeta de plástico de 5 mL, disocian mecánicamente las células por aspiración y lavado a la suspensión de células mientras que mantener la pipeta de 5 mL en el fondo del matraz por lo menos 5 veces.
    7. Uso de 5 x 104 células/insertar para una cultura de membrana poliéster bien 12 insertos inserto y 2 x 106 células para un matraz T75 celular+ y contar las células. Preparar también tres filtros sin células para los experimentos de PELy (es decir, permeabilidad de las células endoteliales a véase Lucifer amarillo abajo del párrafo 4.2) con las inserciones de cultura de membrana de poliéster.
    8. Incube los frascos o insertos a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta el 100% de confluencia.
    9. No cambie el medio para matraz T75 celular+ hasta un nuevo paso. Por el contrario de BBB en la cultura de membrana poliéster inserta: cambio medio en los días 2 y 4, utilizar el BBB para los experimentos en el día 6.

4. construcción y control de calidad de la BBB-Minibrain (Figura 2)

  1. Configurar un poliéster de BBB-Minibrain cultura membrana Inserte dispositivo (figura 2B)
    1. Crecen las células hCMEC/D3 12 bien poliester cultura membrana insertar filtros para 6 días en medio de la célula endotelial antes de usar para el experimento.
    2. Cubrir una placa bien 12 con poly-D-lisina (1 mL/pozo, 10 μg/mL, 4 h a temperatura ambiente) y, a continuación, laminina (1 mL/pocillo, 1 μg/mL, durante la noche a temperatura ambiente).
    3. Retirar laminina y añadir 1 mL de células endoteliales medio suplementado con 5% FBS (media de 5% de células endoteliales).
    4. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    5. Trypsinize el NT2-N/A (como se describe en el paso 1.3.9) y CHME/Cl5 (como se describe en el paso 2.2) y disociar los pellets de células con medio completo celular endotelial.
    6. Cuenta las celdas, mezcla 3.6 x 105 NT2-N/A y 0,4 x 105 células/pozo CHME/Cl5 y placa bien semillas el 12.
    7. En T = 24 h (24 h después de la siembra): cambiar el medio usado con medio completo fresco de la célula endotelial (Minibrain células y células endoteliales) y transferir el filtro hCMEC/D3 poliester membrana cultura inserto en la parte superior de las células Minibrain. Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
      Nota: La BBB-Minibrain entonces consistirá en una capa de células endoteliales humanas hCMEC/D3 en filtro aísla el compartimiento luminal (o compartimiento de la "sangre") y de una cultura mixta de células humanas hNT2-N/A y hCHME/Cl5 (Minibrain) en la parte inferior del bien definición el compartimiento abluminal (o compartimiento del "cerebro") (figura 2B).
  2. Validación de la permeabilidad endotelial de la BBB-Minibrain (Control de calidad) (figura 2)
    1. Preparar el tampón de transporte (TB), que es tampón HBSS (solución salina balanceada con Hanks) con Ca2 + y Mg2 + con piruvato de sodio HEPES y 1 mM de 10 mM.
    2. Preparar platos bien 12 con 1,5 mL de tampón de transporte por pozo.
    3. En T = 0, hacer fresco tampón de transporte complementado con 50 μm Lucifer amarillo (LY-TB).
    4. Invierta cada filtro para quitar cuidadosamente el medio sin afectar la barrera endotelial de la célula.
    5. Colocar el filtro en el plato bien 12 relleno y agregar 0,5 mL de LY-TB.
    6. Incubar las placas en una incubadora a 37° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    7. En la transferencia de T = 10 min los filtros nuevos TB llena 12 placas bien y mantienen el compartimiento abluminal de la primera placa para la lectura de OD.
    8. En T = 25 min, repetir en 4.2.7.
    9. En T = 45 min, pare el transporte mediante la eliminación de los filtros de las placas. Mantenga abluminal y luminales compartimentos medidas OD.
    10. Transferencia en un oscuro 96 bien las placas de las muestras: 10 μl con 190 μl TB la LY-TB y los compartimientos del luminales 200 μL de la muestra para los compartimientos abluminal.
    11. Medir la fluorescencia de la LY-TB presente en las diferentes muestras a λ428 nm λ535 nm (longitud de excitación y de emisión de ondas respectivamente).
    12. Calcular la permeabilidad endotelial (Pe) hacia LY-TB (PeLY) según Siflinger-Birnboim, A et al (1987)39 y Da Costa, A et al (2018)34 mediante la fórmula:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) y PeLY= PSe/S.
      Nota: PSf es la permeabilidad del filtro sin las células, PSt es la permeabilidad del filtro con las células de PSe es la permeabilidad de la época de la monocapa endotelial la superficie de la capa monomolecular, S es la superficie de la monocapa (un filtro bien 12 = 1,12 cm2 ), PeLY se expresa en cm/min. Para hCMEC/D3 PeLY debe estar entre 0,7 y 1,2 x 10-3 cm/min dependiendo principalmente de los equipos utilizado en los experimentos. Importante: un PeLY superior 1.2 significa que el BBB no es lo suficientemente apretado y se observan algunas fugas. Eliminar estas barreras.

5. uso de BBB-Minibrain a destacar la presencia de partículas virales neuro invasivo en una muestra de vacuna de Virus de fiebre amarilla, el virus neurotrópico francés YFV-FNV 34 (Figura 3)

  1. Cruce de BBB y la multiplicación de virus de fiebre amarilla en el Minibrain
    1. Utilizar el BBB-Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7 24 h antes de la adición del virus; sustituir el medio por medio de celular endotelial de FBS 2%.
      Nota: Es extremadamente importante evitar cambiar el medio justo antes de añadir el virus. Cambiar el medio puede activar las células endoteliales humanas y transitoriamente abrir la barrera que permite el paso del virus. Aquí el medio se cambia 24 h antes de comenzar el experimento.
    2. En T = 0, añadir 3500 placa formando unidades (PFU) de YFV-FNV diluido en 50 μl de 2% medio de célula endotelial FBS muy cuidadosamente en la parte superior el compartimiento luminal. El control Minibrain BBB se inocula con 50 μl de medio de células endoteliales de FBS 2% sin virus. Determinar bien PeLY de compañera.
    3. Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    4. Después de 24 h, retire el dispositivo de filtro de membrana de poliéster cultura insertos y PeLY, muestra 1 mL del compartimiento abluminal de determinar y valorar el virus descrito por A. da Costa et al (2018)34. Reemplace el medio por medio fresco de células endoteliales de la FBS del 2%.
    5. Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    6. Después de 72 h, el medio del compartimiento abluminal de la muestra y valorar el virus, o extraer el ARN de las células Minibrain para análisis de expresión génica como es descrito por A. da Costa et al (2018)34.
  2. Amplificación de variantes neurotrópica de YFV-FNV en células Minibrain por pasajes seriales
    1. Uso Minibrain células habían cubierto 12 placas bien (es decir, pasos 4.1.6 y 4.1.7).
    2. Al tiempo 0 h, el punto agregar 3.500 placa formando unidades de YFV-FNV diluido en 50 μl de medio de células endoteliales de FBS 2% muy cuidadosamente la parte superior de las células (compartimiento luminal).
    3. Después de 1 h, quitarlo del medio con el inóculo de virus y reemplazar con medio fresco de células endoteliales de la FBS del 2%.
    4. Después de 48 h, 500 μl de medio de cultivo de la muestra e infectar células Minibrain
    5. Después de 120 h, 500 μl de medio de cultivo de la muestra e infectar células Minibrain.
    6. Después de 192 h, excepto el medio de cultivo (= acción de virus enriquecida) y extraer el ARN de las células Minibrain para análisis de expresión génica como es descrito por A. da Costa et al (2018)34.

6. uso de BBB-Minibrain cruce de BBB y cerebro de la célula objetivo de una biomolécula

  1. Transporte a través de la BBB de una neurona a biomoléculas
    1. Utilice el BBB Minibrain preparado como paso descrito 4.1.7.
    2. En el momento 0 h, añadir las biomoléculas (en el ejemplo proporcionado en la sección de resultados, 58.75 ng, BBB de las moléculas de NeuroTag-NV florescente de célula fueron agregados por BBB Minibrain insertar.
    3. Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    4. Después de 24 h, retire el dispositivo de filtro de membrana de poliéster cultura insertos y determinar PeLY, mancha las células Minibrain para hNeurons neurofilament Nf200 y detectar la presencia de las biomoléculas en el Minibrain (en el ejemplo incluido en el resultado sección, NeuroTag-NV fue detectada utilizando un anticuerpo dirigido contra el Strep-Tag contiene35,40).
  2. Transporte a través de la BBB de una biomolécula neuroprotectivos y neuroprotector posteriores análisis en el Minibrain después la biomolécula ha cruzado el BBB
    1. Utilice el BBB Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7.
      Nota: Para las moléculas dirigidas a las neuronas solamente, células Minibrain pueden ser sustituidas por la única de las neuronas células (NT2-N)38.
    2. En el momento 0 h, añadir 58.75 ng/BBB-Minibrain bien el Florescente NV de moléculas de célula (forma activa CPM-NeuroTag-NV, inactivo forma CPM-NeuroTag-NVΔ) descrito por C. Prehaud et al (2014)35.
    3. Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    4. Después de 4 h, hacer heridas individuales con una aguja de inyección (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Bélgica) en las células Minibrain. Hacer rayones por lo menos 10 en cada bien. Determinar bien PeLY en el compañero.
    5. Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    6. Después de 8 h, sustituir el medio en el compartimiento abluminal por medio completo fresco de la célula endotelial.
      Nota: Es importante cambiar el medio en este paso ya que las heridas sufridas por las células Minibrain pueden conducir a muerte celular y la liberación de compuestos citotóxicos.
    7. Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
    8. Después de 48 h, tinción las células para la regeneración del axon de hNeurons descrito por C. Prehaud et al (2013)40.

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Resultados

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El BBB-Minibrain es un cellulo en experimental modelo de interfaz de sangre del cerebro.

El BBB-Minibrain está configurado en el sistema de inserción de cultura membrana poliéster para imitar un compartimiento de la sangre en el nivel superior y un compartimiento del cerebro en el nivel inferior de la interfaz de sangre-cerebro (figura 2AB). Consiste en un compartim...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo hemos demostrado cómo construir una cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y la cultura de mezcla cerebro células cerebrales (Minibrain) en un solo equipo. Este sistema es biológicamente relevante, fácil de configurar y manejar para experimentadores bien ensen $ ados en cultivo celular.

En cuanto a cualquier otro modelo in vitro de BBB, se obtendrían resultados confiables si se aplica el drástico control de la tirantez de la barrera. Re...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La propiedad intelectual del sistema fue las patentes referidas a 32, 35 y 38.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por becas internas del Instituto Pasteur incluyendo una subvención de Incitative (PTR 435) y por una donación "Contrat de Soutien à la Recherche" de Sanofi Pasteur Institut Pasteur. A. da Costa fue apoyada por la concesión de Sanofi-Pasteur y Florian Bakoa es beneficiario de una beca de doctorado proporcionada por la ANRT (Asociación Nacional de la Recherche et de la Technologie). Estamos agradecidos a Pr Pierre-Olivier Couraud y Dr. Florencia Molinero por discusiones útiles.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 12 pocillosCorning3336
5-fluoro-2' desoxiuridinaMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Placa de PetriSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-etanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleA petición del Dr. Lafon
CMCCalbiochem217274
Citosina β-D-arabinofuranósidoMerck-Sigma AldrichC1768
Placas oscuras de 96 pocillosCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSO Merck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004medio de células endoteliales
EtanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldehídoMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Cabra-Anti RatónJackson Immuno Research115-545-003
Cabra-Anti ConejoThermofisher ScientificR37117
HBSS con Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LamininaMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminaThermofisher Scientific25030-024
Lucifer AmarilloMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
con Paraformaldehído15714
PBS sin Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Pluma/EstreptococoEurobioCXXPES00-07
Poly-D-LisinaMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Rata Colágeno ICultrex3443-100-01
Ácido retinoico All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Kit de purificación de ARNQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Bicarbonato de sodio 5.6%EurobioCXXBIC00-07
Piruvato de sodioThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ MatrazSarstedt83-1813-302Matraz de poliestireno para cultivo de tejidos con tratamiento superficial específico (Cell+) para células adherentes sensibles
TranswellCorning3460insertos de cultivo de membrana porosa de poliéster
Tripsina-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Agua ultrapuraThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarVial
Ciencias de la Microscopía Electrónica de vacuna

Referencias

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