Este protocolo describe métodos in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar completamente los vasos hialoide, un modelo de regresión vascular en los ojos del ratón, utilizando tomografía de coherencia óptica y angiografía de fundus fluoresceina para la imagen en vivo y ex vivo aislamiento y posterior montaje plano del hialoides para el análisis cuantitativo.
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Artículo de método
Evaluación y caracterización de recipientes hialoides en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
En el ojo, los vasos hialoides embrionarios nutren la lente en desarrollo y la retina y retroceden cuando se desarrollan los vasos retinianos. La regresión persistente o fallida de los vasos hialoidese se puede ver en enfermedades como el vítreo primario hiperplásico persistente (PHPV), lo que conduce a una trayectoria de luz obstruida y a una función visual deteriorada. Comprender los mecanismos subyacentes a la regresión del vaso hialoide puede conducir a nuevas perspectivas moleculares sobre el proceso de regresión vascular y posibles nuevas formas de manejar enfermedades con vasos hialoides persistentes. Aquí describimos los procedimientos para la toma de imágenes de hialoide en ratones vivos con tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía de fundus fluoresceína (FFA) y un protocolo técnico detallado de aislar y montar hialoide ex vivo para análisis cuantitativo. Los ratones noqueadores relacionados con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) se utilizaron como modelo experimental de vasos hialoide persistentes, para ilustrar las técnicas. Juntos, estas técnicas pueden facilitar una evaluación exhaustiva de los vasos hialoides como un modelo experimental de regresión vascular y estudios sobre el mecanismo de los vasos hiloide persistentes.
Introducción
El suministro de sangre en el ojo es esencial para asegurar el desarrollo normal de la retina y los tejidos oculares circundantes y para equipar una función visual adecuada. Hay tres camas vasculares en el ojo: la vasculatura de la retina, la coroides y una red circulatoria embrionaria transitoria de vasos hialoides. El desarrollo de la vasculatura ocular requiere coordinación espacial y temporal a lo largo de la embriogénesis y la maduración de tejidos. Entre las tres camas vasculares, la vasculatura hialoide es el primer sistema funcional de suministro de sangre que proporciona nutrición y oxígeno a la lente embrionaria recién formada y la retina en desarrollo. Los ....
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Protocolo
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en La Investigación Oftálmica y de La Visión para experimentos con animales, siguiendo las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH) con respecto al cuidado y uso de animales para procedimientos experimentales y las regulaciones establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Boston Children's Hospital. Lrp5-/- ratones (stock no 005823; Laboratorio Jackson) y sus ratones c57BL/6J de control de tipo salvaje (stock no 000664; Laboratorio Jackson....
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Resultados
Imágenes in vivo de vasos hialoide en ratones vivos
Figura 3 A revela vistas transversales de imágenes de PTU para la retina y los tejidos hialoides en ratones WT y Lrp5-/-de 3 meses de edad, un modelo animal con hiloide persistente. El ojo WT muestra la ausencia de tejido hialoide, mientras que el ojo Lrp5-/-muestra dos vasos hialoide persistentes derivados de la cabeza del nervio óptico. Figur.......
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Discusión
Las técnicas para evaluar y caracterizar los vasos hialoides son procedimientos intuitivos y necesarios para observar la regresión del vaso hialoide en modelos animales, para permitir estudios sobre los mecanismos subyacentes a la regresión vascular durante el desarrollo. Si bien la imagen retiniana in vivo permite la observación longitudinal de la regresión hialoides en el mismo animal, el acceso a un sistema de imágenes de fondos para roedores para LA OCT y la FFA puede ser un factor limitante. Además, la toma de imáge.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01 EY024963 y EY028100) a J.C. Z.W. contó con el apoyo de una beca de iniciación profesional de la Knights Templar Eye Foundation. El procedimiento de aislamiento hialoide descrito en este estudio fue adaptado con la modificación de protocolos generosamente compartidos por los doctores Richard Lang, Toshihide Kurihara y Lois Smith, a quienes los autores están agradecidos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AK-Fluor (inyección de fluoresceína, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anticuerpo anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Medio de montaje antidecoloración | Thermo Fisher | S2828 | |
| Medio de montaje antidecoloración con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Gotas oftálmicas de lágrimas artificiales | Systane | N/A | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J | ratones The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica CM3050S | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Clorhidrato de ciclopentolato y fenilefrina gotas oftálmicas de clorhidrato | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Tablero de calentamiento | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectina GS-IB4, 594 conjugado | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Inyección de clorhidrato de ketamina | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- | ratones The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Desarrollado por Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV y OCT | Phoenix Research | Labs N/A | Imágenes software: |
| Microscopio | InSight Zeiss | discovery v8 | |
| Pinza de microcirugía | Scanlan International | 4004-05 | |
| Tijeras de microcirugía | Scanlan International | 6006-44 | |
| Temperatura óptima de corte compuesto | Tissue-Tek | 4583 | |
| Temperatura óptima de corte compuesto | Agar Scientific | ||
| Paraformaldehído (16%) | Electrón Microscopía Sciences | 15710 | |
| Moldes de inclusión desechables Peel-A-Way (moldes de tejidos) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (10X) | Teknova | P0496 | |
| Portaobjetos de vidrio para portaobjetos | Premiere | 94-2222-10 | |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Solución estéril de xilacina | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Referencias
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and it....
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Reimpresiones y permisos
