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Artículo de método

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

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DOI:

10.3791/59253

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13 de abril de 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

En este artículo

Resumen

Describimos aquí el alto rendimiento detección y cuantificación de fucosylated oligosacáridos de leche humana (HMO) utilizando un biosensor de célula entera. También demostramos aquí, la adaptación de esta plataforma hacia análisis de cepas de producción de HMO, centrándose en mejorar la relación señal a ruido.

Resumen

Oligosacáridos de leche humana (HMO) son componentes de hidratos de carbono complejos de la leche materna humana que exhiben abundantes beneficios en la salud infantil. Sin embargo, optimización de su síntesis biotecnológica está limitada por el relativamente bajo rendimiento de detección y cuantificación de monosacárido y vínculos. Las técnicas convencionales de análisis de glicanos incluyen cromatografía/masa-spectrometric métodos con capacidad de producción del orden de cientos de muestras por día sin automatización. Aquí, demostramos un biosensor bacteriano genéticamente codificado para la detección de alto rendimiento, específicos de acoplamiento y cuantificación de las estructuras de fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose y 3-fucosyllactose, que logramos mediante heteróloga expresión de fucosidases. Como la presencia de lactosa en leche o en procesos biotecnológicos podría llevar a falsos positivos, demostramos también la reducción de la señal de lactosa utilizando diferentes estrategias. Debido al alto rendimiento de esta técnica, podrían ensayarse muchas condiciones de la reacción o parámetros de biorreactor en paralelo en cuestión de horas, lo que permite la optimización de la fabricación de HMO.

Introducción

Oligosacáridos de leche humana (HMO) son oligosacáridos derivados de la lactosa, generalmente formado por monómeros de azúcar de tres a ocho. Tienen una reducción de la lactosa (Gal-β1, 4-Glc) final y son más alargadas por enlaces glicosídicos (β-1, 3 - o β-1, 6-) glucosa (Glc), galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Además, fucosa (Fuc, α-1, 2 - o α-1, 3-) o ácido siálico (Sia o NeuAc, 2,6 2,3 α o α-) residuos a menudo se añaden1.

Análisis actual de oligosacáridos y otros hidratos de carbono es limitado en alcance y rendimiento por la necesidad de cromatografía/masa espectrométrica (MS) tecnología2,3,4,5, 6 , 7, que puede tomar aproximadamente una hora por muestra, sin dejar de mencionar la necesidad de equipo costoso, columnas especializadas y agentes derivatizando y conocimientos sobre el funcionamiento de este equipo8. Vínculos de oligosacáridos son particularmente difíciles de determinar, requiriendo avanzado MS9,10 o técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN)11. Optimización rápida de la síntesis de estos oligosacáridos está así limitada por el rendimiento de este lento paso analítico.

En este estudio, demostramos la detección de acoplamiento específicos de trisacárido fucosylated HMO basada en lactosa, centrándose en 2'-fucosyllactose (2'-FL) que es la HMO más abundante en la leche humana, usando un codificado genéticamente células enteras de Escherichia coli biosensor con un límite de detección en 4 mg/L. Una característica importante de este biosensor es su capacidad para distinguir entre trisacáridos isoméricos. El principio de diseño se basa en la expresión de la específica fucosidases en e. coli que liberar lactosa de HMO, la presencia de la cual es detectada por el operón lac , que a su vez genera una señal fluorescente. Logramos esto mediante la construcción de un sistema de dos plásmidos, uno que el fucosidase específicos de acoplamiento y el otro una proteína fluorescente reportera. Esta plataforma de biosensores es adecuada para el cribado de alto rendimiento por citometría de flujo o lector de micro placas. Nos demuestran también la utilización del biosensor en la cuantificación de 2'-FL producida por una cepa ingeniería12. Dentro de este estudio, también presentamos tres estrategias de eliminación selectiva de lactosa que puede dar lugar a falsa señal positiva de los biosensores, dado que se cultiva la cepa productora Ingeniería en lactosa.

Tomados en conjunto, los biosensores genéticamente codificados permiten detectar y cuantificar las HMO de una manera específica de acoplamiento, que es difícil incluso con cromatografía, MS y NMR técnicas. Debido a su alto rendimiento y facilidad de uso, este método debe tener aplicaciones generalizadas en la ingeniería metabólica y la síntesis de las HMO.

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Protocolo

1. célula cultura, condiciones de inducción

Nota: En los experimentos siguientes, se utilizan tres cepas: e. coli BL21 (DE3) con un vector vacío, e. coli BL21 (DE3) con plásmidos pAfcA14 y pET28:green proteínas fluorescentes (GFP) y e. coli BL21 (DE3) con los plásmidos pAfcB14 y pET28:GFP. Todas las cepas se cultivan en caldo Luria-Bertani (LB) o los medios mínimos con los antibióticos apropiados. Preparar las soluciones madre de kanamicina x 1.000 (50 mg/mL) y carbenicilina (100 mg/mL) desionizada (DI) agua.

  1. Preparación de medios de comunicación
    1. Preparar los medios LB añadiendo 25 g de LB caldo de polvo para 1 L de agua desionizada. Autoclave 121 ° C durante 20 minutos esterilizar la solución. Espere hasta que la temperatura media en LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de añadir 1 μl del stock de antibióticos por cada 1 mL de medio LB.
    2. Para preparar placas LB, añadir agar 15 g a los medios de comunicación de libras antes de la esterilización. Espere hasta que la temperatura de agar LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de la adición de antibiótico.
    3. 1.1.3 para las células de biodetección, preparar placas con dos antibióticos y kanamicina, carbenicilina o los medios de comunicación.
  2. Inductores de hidratos de carbono
    1. Preparar las soluciones madre de los inductores de hidratos de carbono en molares equivalentes a 20 g/L de lactosa: 29 g/L de FL 2' y 3-FL.
      Nota: Cada 200 μL de células requieren 20 μl de la 2'-FL o 3-FL.
    2. Inducir a 200 μL de células con concentración final de 2,0 g/L de lactosa o 2,9 g/L de concentración final de 2'-FL/3-FL. incubar a 37 ° C con agitación continua y deje las culturas crecen durante la noche.
  3. Cultivo de células
    1. El día antes del experimento de la semilla 5 mL de medio LB con kanamicina y carbenicilina de una fresca Colonia bacteriana, utilizando una técnica estéril.
    2. Incubar los cultivos a 37 ° C con agitación y crecen los cultivos durante la noche.
    3. Transferir 50 μl del cultivo durante la noche en 5 mL de medio de LB/M9 fresco con kanamicina y carbenicilina. Incubar a 37 ° C con agitación continua y crecer hasta que la cultura ha alcanzado la densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,5 a 0,7. En esta fase de registro medio, se pueden inducir las células.

2. medición de la fluorescencia y límites de detección

  1. Preparación de células por citometría de flujo
    1. Transferencia de los cultivos durante la noche para tubos de 1.5 mL y centrifugar a 12.500 x g durante 1 minuto.
    2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 500 μl de salina de 1 x de tampón fosfato (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM de NaCl en agua desionizada, pH 7.2) para preparar una suspensión unicelular y transferencia de la célula suspensión a tubos de citómetro de flujo de 5 mL.
    3. Mantener las células en la oscuridad a 4 ° C hasta correr las muestras en un citómetro de flujo. Para mejores resultados, analizar las células tan pronto como sea posible.
    4. Seleccione 488 nm láser para excitar GFP. Recoger niveles de fluorescencia fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, cerradas de dispersión hacia delante y lateral evitar desechos y agregadas células) con un filtro de paso de banda de 525/50 nm.
  2. Calibrar el biosensor
    1. Para hacer una curva de calibración, hacer diluciones de 8 a 10 de la norma 2'-FL en el rango 0 – 2.500 mg/L.
    2. Las células de biodetección de 2'-FL (contiene pAfcA y pET28:GFP) de la cultura e inducirlos con las diluciones estándar, como se describe anteriormente en la sección 1.3. Realizar tres réplicas biológicas para cada dilución.

3. detección y cuantificación de 2'-FL en una cepa productora

  1. Cultivo de la cepa productora
    1. Para hacer mínimo media, preparar soluciones separadas de 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato de sodio y 1 M tiamina-HCl. esterilizar las soluciones usando un filtro de 0,22 μm. Mezclar media M9 polvo de caldo con 1 L de agua desionizada. Autoclave de la solución de M9 a 121 ° C durante 15 minutos enfriar la solución hasta 50 ° C. Agregar MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato de sodio, tiamina a concentración final de 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L y 7.5 μg/L, respectivamente.
    2. Iniciar una cultura de la 2'-FL produciendo tensión, por ejemplo, JM109 gwBC-F2, en 5 mL de medio LB y dejarlo crecer durante la noche a 37 ° C, como se describe en Baumgartner et al12.
    3. Subcultura en el 1% como se describe anteriormente en el paso 1.3.3 en 250 mL de los mínimos medios preparados en paso 3.1.1. Agregar glicerol a una concentración final de 10 g/L e incubar el cultivo a 37 ° C.
    4. Cuando el cultivo alcanza un OD600 de 0.5 – 0.7, añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM y lactosa a una concentración final de 2 g/L.
    5. Incubar a 37 ° C con agitación continua y dejar que las culturas crecen durante 24 h.
  2. Extracción de 2'-FL
    1. Transferencia de los cultivos durante la noche a tubos estériles de 50 mL y centrifugar a 900 x g durante 15 minutos.
    2. 3.2.2 descartar sobrenadante y Resuspenda el sedimento en agua desionizada. Repetir el lavado tres veces para eliminar la lactosa residual y finalmente resuspender en 5 mL de agua desionizada.
    3. Para lisar la suspensión de células, utilice un sonicador en el 30% de energía, en pulsos de s 30. Mantener las células en hielo en todo momento.
    4. Centrifugar las células sometidas a lisis por 25 min a 2.000 x g. Eliminar el sobrenadante, pasar por un estéril (p. ej., 0.22 μm) filtrar y almacenar a 4 ° C hasta su análisis.
  3. Cuantificación con biosensor
    1. Sembrar una cultura de células de biodetección de 2'-FL y en fase logarítmica media, inducir con equivalente lisado de célula a concentraciones aproximadamente de 2'-FL utilizado para hacer la curva de calibración como se describe en la sección 2.2. Realice la calibración en el mismo medio que la muestra a analizar (por ejemplo, lisado de célula) mediante la adición de las diluciones de 2'-FL para controlar (es decir, no productor) lisado antes de inducir células biosensor filtrado celular.
    2. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Generar una curva dosis-respuesta mediante el trazado de la salida de fluorescencia contra la concentración de oligosacáridos. Comparar la respuesta de los estándares para el lisado celular.

4. selectiva eliminación de lactosa

Nota: Las células de biodetección son sensibles a la lactosa y es deseable que el biosensor detectar selectivamente las HMO en lactosa. Una estrategia incluye lavado de células como se describe en la sección 3.2. Tres otras estrategias se describen a continuación.

  1. Tratamiento con β-galactosidasa purificada comercial
    1. Disolver el liofilizado β-galactosidasa a 1.000 (lactasa FCC) unidades/mL, 1 mm MgCl2 o uso comercial de β-galactosidasa en solución.
    2. Para determinar la concentración óptima de enzima necesaria, crecer un inóculo de 2'-FL biosensores células e inducir con lactosa 2 g/L y 2,9 g / L 2'-FL en fase logarítmica media.
    3. A las culturas de μl 100, añadir cantidades variables de β-galactosidasa, hasta 12 unidades y dejar las culturas crecen durante la noche a 37 ° C con agitación continua.
    4. Medir la fluorescencia como se describe en la sección 2.1 y calcular las unidades óptimas de enzima necesaria en la determinación de la concentración de enzima mínima para lograr la deseada atenuación de señal.
    5. 2'-FL produciendo las células cultivadas por 24 h, añadir unidades óptimas de la β-galactosidasa e incubar durante una noche a 37 ° C. Proceder con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.
  2. Tratamiento previo con LacZ + cepa
    1. Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar el cultivo a 37 ° C durante 24 h.
    2. Inocular una e. coli BL21 (DE3) cultura en LB, crecer a la fase de registro medio a 37 ° C y añadir 50 mL del cultivo (2:1) a la cultura de 24 h.
    3. Incubar a 37 ° C por 3 h. proceda con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.
  3. Precipitación de lactosa con etanol
    Nota: Esta sección está adaptada de agudo et al12.
    1. Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar a 37 ° C durante 24 h.
    2. Añadir dos volúmenes de etanol al 100% a la cultura, agite bien e incubar a 37 ° C por 4 h.
    3. Centrifugar la suspensión a 900 x g durante 15 minutos recoge el sobrenadante e incubar durante una noche a 4 ° C, que se precipita la lactosa.
    4. Eliminar la lactosa precipitada pasando la solución a través de un filtro de papel (11 μm). Recoger el filtrado que es la célula que contiene el 2'-FL, que puede ser cuantificada por el siguiente artículo 3.3 lisada.

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Resultados

Hemos diseñado un biosensor de toda célula específico 2'-FL que pueden utilizarse en conjunción con la producción biotecnológica de los oligosacáridos. Esto se basa en la ruptura enzimática específica de modificar azúcares terminales generadoras de lactosa y de tal modo la activación de la lac operón, conduce a la expresión de una proteína fluorescente de reportero bajo un promotor inducible de la lactosa, proporcionalmente a la cantidad de 2' de FL. Para demostrar su especificid...

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Discusión

Presentamos una estrategia de alto rendimiento para la detección de acoplamiento específicos de fucosylated oligosacáridos de leche humana. Esto se logró mediante la construcción de biosensores de célula entera por ingeniería genética de e. coli que en inducción con glycans específicas responden con una señal fluorescente. El protocolo también detalles sobre cómo se puede utilizar el biosensor para detectar y cuantificar las HMO en una cepa bacteriana metabólicamente ingeniería.

Nuest...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el estado de Iowa Universidad Inicio fondos. F.E. fue parcialmente financiado por la NSF Trinect compañerismo y Manley Hoppe Cátedra. T.J.M. fue apoyada parcialmente por la Karen y Denny Vaughn Facultad beca. Los autores agradecen a la instalación de citometría de flujo de Iowa estado Universidad y el laboratorio de investigación de Metabolómica de W.M. Keck para la asistencia con fluorescencia y LC-MS estudios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2'-Fucosil-lactosa Carbosynth 41263-94-9
3-Fucosil-lactosa Carbosynth 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500 Cloruro
de calcio, dihidratoFisher ScientificC79-500
Carbenicillin Fisher ScientificBP26481
dextrosa (D-glucosa), anhidraCitómetrode flujo Fisher Scientific D16-1
BDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 Series Sistema de HPLC
Columna de HPLCLunaC18 columna de fase reversa
KanamicinaFisher Scientific
Caldo LB, Miller  Fisher Scientific12-795-027
LactosaFisher Scientific64044-51-5
M9, Sales mínimas, 5xSigma-AldrichM6030
Sulfato de magnesio, anhidroFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesTrampa selectiva de masa Detector
SL Cloruro de sodioSigma-Aldrich7647-14-5
Fosfato de sodio dibásicoSigma-Aldrich7558-79-4
Fosfato de sodio monobásicoSigma-Aldrich13472-35-0
11815024

Referencias

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