Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

Oligosacáridos de leche humana (HMO) son oligosacáridos derivados de la lactosa, generalmente formado por monómeros de azúcar de tres a ocho. Tienen una reducción de la lactosa (Gal-β1, 4-Glc) final y son más alargadas por enlaces glicosídicos (β-1, 3 - o β-1, 6-) glucosa (Glc), galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Además, fucosa (Fuc, α-1, 2 - o α-1, 3-) o ácido siálico (Sia o NeuAc, 2,6 2,3 α o α-) residuos a menudo se añaden¹.

Análisis actual de oligosacáridos y otros hidratos de carbono es limitado en alcance y rendimiento por la necesidad de cromatografía/masa espectrométrica (MS) tecnología^{2,3,4,5, 6 , 7}, que puede tomar aproximadamente una hora por muestra, sin dejar de mencionar la necesidad de equipo costoso, columnas especializadas y agentes derivatizando y conocimientos sobre el funcionamiento de este equipo⁸. Vínculos de oligosacáridos son particularmente difíciles de determinar, requiriendo avanzado MS^9,10 o técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN)¹¹. Optimización rápida de la síntesis de estos oligosacáridos está así limitada por el rendimiento de este lento paso analítico.

En este estudio, demostramos la detección de acoplamiento específicos de trisacárido fucosylated HMO basada en lactosa, centrándose en 2'-fucosyllactose (2'-FL) que es la HMO más abundante en la leche humana, usando un codificado genéticamente células enteras de Escherichia coli biosensor con un límite de detección en 4 mg/L. Una característica importante de este biosensor es su capacidad para distinguir entre trisacáridos isoméricos. El principio de diseño se basa en la expresión de la específica fucosidases en e. coli que liberar lactosa de HMO, la presencia de la cual es detectada por el operón lac , que a su vez genera una señal fluorescente. Logramos esto mediante la construcción de un sistema de dos plásmidos, uno que el fucosidase específicos de acoplamiento y el otro una proteína fluorescente reportera. Esta plataforma de biosensores es adecuada para el cribado de alto rendimiento por citometría de flujo o lector de micro placas. Nos demuestran también la utilización del biosensor en la cuantificación de 2'-FL producida por una cepa ingeniería¹². Dentro de este estudio, también presentamos tres estrategias de eliminación selectiva de lactosa que puede dar lugar a falsa señal positiva de los biosensores, dado que se cultiva la cepa productora Ingeniería en lactosa.

Tomados en conjunto, los biosensores genéticamente codificados permiten detectar y cuantificar las HMO de una manera específica de acoplamiento, que es difícil incluso con cromatografía, MS y NMR técnicas. Debido a su alto rendimiento y facilidad de uso, este método debe tener aplicaciones generalizadas en la ingeniería metabólica y la síntesis de las HMO.

1. célula cultura, condiciones de inducción

Nota: En los experimentos siguientes, se utilizan tres cepas: e. coli BL21 (DE3) con un vector vacío, e. coli BL21 (DE3) con plásmidos pAfcA¹⁴ y pET28:green proteínas fluorescentes (GFP) y e. coli BL21 (DE3) con los plásmidos pAfcB¹⁴ y pET28:GFP. Todas las cepas se cultivan en caldo Luria-Bertani (LB) o los medios mínimos con los antibióticos apropiados. Preparar las soluciones madre de kanamicina x 1.000 (50 mg/mL) y carbenicilina (100 mg/mL) desionizada (DI) agua.

1. Preparación de medios de comunicación
   1. Preparar los medios LB añadiendo 25 g de LB caldo de polvo para 1 L de agua desionizada. Autoclave 121 ° C durante 20 minutos esterilizar la solución. Espere hasta que la temperatura media en LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de añadir 1 μl del stock de antibióticos por cada 1 mL de medio LB.
   2. Para preparar placas LB, añadir agar 15 g a los medios de comunicación de libras antes de la esterilización. Espere hasta que la temperatura de agar LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de la adición de antibiótico.
   3. 1.1.3 para las células de biodetección, preparar placas con dos antibióticos y kanamicina, carbenicilina o los medios de comunicación.
2. Inductores de hidratos de carbono
   1. Preparar las soluciones madre de los inductores de hidratos de carbono en molares equivalentes a 20 g/L de lactosa: 29 g/L de FL 2' y 3-FL.
      Nota: Cada 200 μL de células requieren 20 μl de la 2'-FL o 3-FL.
   2. Inducir a 200 μL de células con concentración final de 2,0 g/L de lactosa o 2,9 g/L de concentración final de 2'-FL/3-FL. incubar a 37 ° C con agitación continua y deje las culturas crecen durante la noche.
3. Cultivo de células
   1. El día antes del experimento de la semilla 5 mL de medio LB con kanamicina y carbenicilina de una fresca Colonia bacteriana, utilizando una técnica estéril.
   2. Incubar los cultivos a 37 ° C con agitación y crecen los cultivos durante la noche.
   3. Transferir 50 μl del cultivo durante la noche en 5 mL de medio de LB/M9 fresco con kanamicina y carbenicilina. Incubar a 37 ° C con agitación continua y crecer hasta que la cultura ha alcanzado la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,5 a 0,7. En esta fase de registro medio, se pueden inducir las células.

2. medición de la fluorescencia y límites de detección

1. Preparación de células por citometría de flujo
   1. Transferencia de los cultivos durante la noche para tubos de 1.5 mL y centrifugar a 12.500 x g durante 1 minuto.
   2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 500 μl de salina de 1 x de tampón fosfato (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM de NaCl en agua desionizada, pH 7.2) para preparar una suspensión unicelular y transferencia de la célula suspensión a tubos de citómetro de flujo de 5 mL.
   3. Mantener las células en la oscuridad a 4 ° C hasta correr las muestras en un citómetro de flujo. Para mejores resultados, analizar las células tan pronto como sea posible.
   4. Seleccione 488 nm láser para excitar GFP. Recoger niveles de fluorescencia fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, cerradas de dispersión hacia delante y lateral evitar desechos y agregadas células) con un filtro de paso de banda de 525/50 nm.
2. Calibrar el biosensor
   1. Para hacer una curva de calibración, hacer diluciones de 8 a 10 de la norma 2'-FL en el rango 0 – 2.500 mg/L.
   2. Las células de biodetección de 2'-FL (contiene pAfcA y pET28:GFP) de la cultura e inducirlos con las diluciones estándar, como se describe anteriormente en la sección 1.3. Realizar tres réplicas biológicas para cada dilución.

3. detección y cuantificación de 2'-FL en una cepa productora

1. Cultivo de la cepa productora
   1. Para hacer mínimo media, preparar soluciones separadas de 1 M K₂HPO₄, FeSO₄·7H₂O, citrato de sodio y 1 M tiamina-HCl. esterilizar las soluciones usando un filtro de 0,22 μm. Mezclar media M9 polvo de caldo con 1 L de agua desionizada. Autoclave de la solución de M9 a 121 ° C durante 15 minutos enfriar la solución hasta 50 ° C. Agregar MgSO₄, CaCl₂, K₂HPO₄, FeSO₄·7H₂O, citrato de sodio, tiamina a concentración final de 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L y 7.5 μg/L, respectivamente.
   2. Iniciar una cultura de la 2'-FL produciendo tensión, por ejemplo, JM109 gwBC-F2, en 5 mL de medio LB y dejarlo crecer durante la noche a 37 ° C, como se describe en Baumgartner et al¹².
   3. Subcultura en el 1% como se describe anteriormente en el paso 1.3.3 en 250 mL de los mínimos medios preparados en paso 3.1.1. Agregar glicerol a una concentración final de 10 g/L e incubar el cultivo a 37 ° C.
   4. Cuando el cultivo alcanza un OD₆₀₀ de 0.5 – 0.7, añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM y lactosa a una concentración final de 2 g/L.
   5. Incubar a 37 ° C con agitación continua y dejar que las culturas crecen durante 24 h.
2. Extracción de 2'-FL
   1. Transferencia de los cultivos durante la noche a tubos estériles de 50 mL y centrifugar a 900 x g durante 15 minutos.
   2. 3.2.2 descartar sobrenadante y Resuspenda el sedimento en agua desionizada. Repetir el lavado tres veces para eliminar la lactosa residual y finalmente resuspender en 5 mL de agua desionizada.
   3. Para lisar la suspensión de células, utilice un sonicador en el 30% de energía, en pulsos de s 30. Mantener las células en hielo en todo momento.
   4. Centrifugar las células sometidas a lisis por 25 min a 2.000 x g. Eliminar el sobrenadante, pasar por un estéril (p. ej., 0.22 μm) filtrar y almacenar a 4 ° C hasta su análisis.
3. Cuantificación con biosensor
   1. Sembrar una cultura de células de biodetección de 2'-FL y en fase logarítmica media, inducir con equivalente lisado de célula a concentraciones aproximadamente de 2'-FL utilizado para hacer la curva de calibración como se describe en la sección 2.2. Realice la calibración en el mismo medio que la muestra a analizar (por ejemplo, lisado de célula) mediante la adición de las diluciones de 2'-FL para controlar (es decir, no productor) lisado antes de inducir células biosensor filtrado celular.
   2. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Generar una curva dosis-respuesta mediante el trazado de la salida de fluorescencia contra la concentración de oligosacáridos. Comparar la respuesta de los estándares para el lisado celular.

4. selectiva eliminación de lactosa

Nota: Las células de biodetección son sensibles a la lactosa y es deseable que el biosensor detectar selectivamente las HMO en lactosa. Una estrategia incluye lavado de células como se describe en la sección 3.2. Tres otras estrategias se describen a continuación.

1. Tratamiento con β-galactosidasa purificada comercial
   1. Disolver el liofilizado β-galactosidasa a 1.000 (lactasa FCC) unidades/mL, 1 mm MgCl₂ o uso comercial de β-galactosidasa en solución.
   2. Para determinar la concentración óptima de enzima necesaria, crecer un inóculo de 2'-FL biosensores células e inducir con lactosa 2 g/L y 2,9 g / L 2'-FL en fase logarítmica media.
   3. A las culturas de μl 100, añadir cantidades variables de β-galactosidasa, hasta 12 unidades y dejar las culturas crecen durante la noche a 37 ° C con agitación continua.
   4. Medir la fluorescencia como se describe en la sección 2.1 y calcular las unidades óptimas de enzima necesaria en la determinación de la concentración de enzima mínima para lograr la deseada atenuación de señal.
   5. 2'-FL produciendo las células cultivadas por 24 h, añadir unidades óptimas de la β-galactosidasa e incubar durante una noche a 37 ° C. Proceder con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.
2. Tratamiento previo con LacZ + cepa
   1. Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar el cultivo a 37 ° C durante 24 h.
   2. Inocular una e. coli BL21 (DE3) cultura en LB, crecer a la fase de registro medio a 37 ° C y añadir 50 mL del cultivo (2:1) a la cultura de 24 h.
   3. Incubar a 37 ° C por 3 h. proceda con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.
3. Precipitación de lactosa con etanol
   Nota: Esta sección está adaptada de agudo et al¹².
   1. Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar a 37 ° C durante 24 h.
   2. Añadir dos volúmenes de etanol al 100% a la cultura, agite bien e incubar a 37 ° C por 4 h.
   3. Centrifugar la suspensión a 900 x g durante 15 minutos recoge el sobrenadante e incubar durante una noche a 4 ° C, que se precipita la lactosa.
   4. Eliminar la lactosa precipitada pasando la solución a través de un filtro de papel (11 μm). Recoger el filtrado que es la célula que contiene el 2'-FL, que puede ser cuantificada por el siguiente artículo 3.3 lisada.

Hemos diseñado un biosensor de toda célula específico 2'-FL que pueden utilizarse en conjunción con la producción biotecnológica de los oligosacáridos. Esto se basa en la ruptura enzimática específica de modificar azúcares terminales generadoras de lactosa y de tal modo la activación de la lac operón, conduce a la expresión de una proteína fluorescente de reportero bajo un promotor inducible de la lactosa, proporcionalmente a la cantidad de 2' de FL. Para demostrar su especificidad de acoplamiento, 3-fucosyllactose (3-FL), un isómero, también fue probado. El circuito genético contiene dos partes: un gen de fucosidase, afcA o afcB, conducida por un promotor constitutivo, dando por resultado la expresión constitutiva clonado en un vector con una secuencia señal de pelB codificada corriente arriba del gen fucosidase a facilitar la exportación periplasmic, así como un sistema reportero fluorescente que contiene el promotor T7 conduce la expresión de GFP. La primera parte se expresa en plásmido pAfcA y el segundo sistema de reportero en el plásmido pET28:GFP. La construcción final se transformó en e. coli BL21 (DE3), una cepa ampliamente disponible que tiene la polimerasa del RNA T7 integra en el genoma bajo control del promotor lactosa-sensible pLacUV5. Figura 1A se muestra el diseño esquemático para que el lector puede seguir el principio de funcionamiento del biosensor. Figura 1B ilustra la señal fluorescente bajo diferentes condiciones de inducción como analizaron en un citómetro de flujo. Coherentes con nuestra hipótesis, sobre un 100-fold aumento en fluorescencia se observan con el biosensor de 2'-FL en comparación con el control vector sólo o con el biosensor para 3-FL. Esto demuestra la alta especificidad de acoplamiento del biosensor. Para asegurar que la señal es debido a defucosylation, se llevó un control mediante la adición de α-1, 2-fucosidase comercial a la cultura durante la inducción, que se confirma como se muestra en las barras de la derecha. La sensibilidad del ensayo puede determinarse generando una curva dosis-respuesta con diversos niveles de hidratos de carbono (figura 2A). De la parcela, el rango dinámico lineal de detección de 2'-FL es entre 40 y 400 mg/L y el límite de detección es de 4 mg/L. Este ensayo puede realizarse en el transcurso de un día de trabajo, como lo demuestran las mediciones instantáneas de la dinámica de expresión de reportero (figura 2B).

Finalmente, presentamos cómo las células de biosensores se pueden utilizar para detectar y cuantificar 2'-FL de una cepa productora de ingeniería 2'-FL. Ya que esta cepa utiliza la lactosa como sustrato, desarrollamos estrategias para reducir la señal de lactosa exógena para que la lectura de la señal se correspondería directamente a la concentración de 2'-FL (Figura 3A). Una estrategia es degradar enzimáticamente la lactosa lactosa modificada usando una β-galactosidasa que no actúa. Esto puede lograrse utilizando β-galactosidasa comercial que actúa preferentemente en lactosa, reducción de la señal de lactosa al 20% de la original (figura 3B) o a través de la incubación con una cepa de LacZ +, tipo salvaje BL21 (DE3), que en tres horas cae la lactosa la señal a niveles de fondo (figura 3). La última estrategia utiliza el etanol, que no sólo precipita selectivamente la lactosa sino también descompone mediante lisis el productor células, lisis celular siendo un necesario paso aguas abajo (figura 3D). Se trata de un proceso de extracción simple, pero debe tener cuidado debido a la baja recuperación de 2'-FL en comparación con otros métodos, posiblemente de pérdidas debido a algunos cristalización de 2' de FL. A pesar de la adición de etanol, no observamos inhibición significativa del crecimiento de las células de biodetección, probablemente porque las concentraciones finales de etanol están baja (< 2%, v/v) en las culturas. Finalmente, el método más eficaz pero lento que demostramos es pelotilla y lavar las células antes de la lisis celular para liberar el intracelular 2'-FL (figura 3E). Aconsejamos al lector a utilizar discreción para seleccionar el método adecuado para la eliminación de lactosa basado en la eficiencia y disponibilidad de tiempo y reactivos.

Figura 3E demuestra también nuestra capacidad para cuantificar confiablemente 2'-FL en contexto biotecnológico. Cultiva sea una cepa 2' FL-productores de ingeniería11 o un fucosyltransferase negativo mutantes (control negativo) con lactosa para supervisar la producción de 2'-FL en lisado de célula. Después de cultivar las células, medimos la concentración utilizando el biosensor y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la validación (suplementario Figura 1). Las curvas de dosis respuesta para productor de lisado y control lisado añadió 2'-FL son muy similares, que demuestra la medición cuantitativa de 2'-FL en el contexto de lisado de célula.

Figura 1: esquema de datos de diseño y representante de biosensor de 2'-FL. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) entra en el periplasma bacteriano y se convierte a la lactosa por fucosidase heterologously expresado. La lactosa es transportada al citoplasma y se convierte en allolactose. Esto activa el promotor LacUV5 nativo en e. coli BL21 (DE3), producción de RNAP T7, que transcribe GFP bajo el promotor de T7, conduciendo a la expresión de la proteína fluorescente. 3-FL. células que contienen pET28:GFP y pAfcA (verde), pAfcB (magenta) o un control de vector vacío (azul) y (B) detección de 2'-FL fueron inducidos durante la noche no hay azúcar, FL 2', 2'-FL con α-1,2-fucosidase exógeno agregado, 3-FL o lactosa. Todos los datos son un promedio de tres réplicas biológicas, que cada uno analizado por triplicado, donde barras de error representan la desviación estándar de la media. Significación estadística se determinó mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey y ** es indicativa de p < 0.01.  Esta figura primero apareció en el Enam y Mansell14 y se reutiliza con su autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: caracterización del biosensor para detección de 2'-FL. (A) límites de detección y la transferencia de funciones de biosensores. Curvas de respuesta que representan la fluorescencia media pAfcA/2 ' FL (círculo verde) o vector de control vacía (diamante azul) en cantidades variables de 2'-FL cultivadas. (B) curso temporal de la expresión del reportero. Cepa pAfcA se incubó con 2'-FL (cuadrado verde) y la fluorescencia fue monitoreada durante 8 h de la inducción. Cepa pAfcA incubada con lactosa se incluye como control. Todos los datos son un promedio de tres réplicas biológicas, que cada uno analizado por triplicado, donde barras de error representan la desviación estándar de la media. Esta figura primero apareció en el Enam y Mansell14 y se reutiliza con su autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: detección y cuantificación de 2'-FL de una cepa productora. (A) flujo de trabajo que demuestra el uso de biosensores en un simple protocolo con enfoque clave en la eliminación de ruidos de lactosa residual. (B) eliminación de la lactosa por la digestión enzimática de β-galactosidasa. Culturas que contiene 0.3% 2'-FL (cuadrado verde) o 0.2% lactosa (círculo azul) se incubaron con culturas de biosensor que contienen diferentes cantidades de β-galactosidasa exógena en el tiempo de inducción han sido analizadas por fluorescencia después de la incubación durante la noche. (C) eliminación de la lactosa por la incubación con LacZ + cepa de tipo salvaje. LB que contiene 0.3% 2'-FL (círculo verde), 0.2% de lactosa (cuadrado azul) o una mezcla de 1:1 (0.2% lactosa equivalente, es decir, 0.1% lactosa + 0.15% 2'-FL, triángulo magenta) fue incubado para varias veces con BL21 (DE3) las células y agregan a las culturas de biosensores para medida de fluorescencia después de la incubación durante la noche. (D) precipitación de lactosa y la célula lysis por el tratamiento previo de etanol. Fermentaciones de JM109 gwBC-F2 (círculo magenta) o JM109 gwBC (triángulo azul) células fueron incubadas con 2 volúmenes de etanol y filtradas antes de la incubación con las células de biosensores fluorescentes y en comparación con la fluorescencia de untreated JM109 (cultura) gwBC-F2 cuadrado verde). (E) cuantificación de 2'-FL en lisado de célula. El biosensor se evaluó por su capacidad para detectar 2'-FL de una cepa productora metabólicamente ingeniería. Mediciones de la fluorescencia generadas por la adición de cualquier lisado de JM109 gwBC-F2 (círculo magenta, 2'-FL como cuantificados por LC-MS), 2'-FL en cantidades definidas para la cepa JM109 gwBC celular lysate (cuadrado verde) de nonproducer o lisado de JM109 gwBC cepa (azul crudo crudo diamante). Resultados fueron validados por cuantificación de HPLC de la 2'-FL en la cepa productora. Todos los datos son un promedio de tres réplicas biológicas cada uno analizó por triplicado, donde barras de error verticales representan la desviación estándar de la media de la fluorescencia y barras de error horizontales representan la desviación estándar en 2'-FL medido por HPLC en el triplica. Esta figura primero apareció en el Enam y Mansell14 y se reutiliza con su autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 1: Análisis de HPLC-MS de 2'-FL. (A) extrajeron los cromatogramas de iones de la 2'-FL (m/z 511). Cromatograma de un estándar comercial se muestra en la parte superior. Cromatograma de 2'-FL de la cepa JM109gwBC-F2 (dilución 10 veces) aparece en la parte inferior. El pico en el 511 m/z es el sodio aducción. (B) una ampliación del espectro de masas de m/z de 300−800, donde se concentraron las señales más abundantes se muestra el comercial estándar (parte superior) y 2'-FL de la cepa productora (abajo). (C) A curva estándar fue creada por LC-MS análisis con diferentes niveles de comercial 2'-FL. Barras de error representan desviaciones estándar de las mediciones por triplicado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.