Artículo de método

Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

DOI:

10.3791/59259

⸱

27 de marzo de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coloboma ocular congénito es un trastorno genético que típicamente se observa como una hendidura en el aspecto inferior del ojo resultante cierre de fisura coroide incompleta. Recientemente, la identificación de individuos con coloboma en el aspecto superior del iris, retina y lente conducido al descubrimiento de una nueva estructura, denominada la fisura superior o surco ocular superior (SOS), que es transitorio presente en el dorsal aspecto de la Copa óptica durante el desarrollo del ojo vertebrado. Aunque esta estructura se conserva en ratones, pollos, pescados y newt, nuestra comprensión actual de los SOS es limitada. Con el fin de dilucidar los factores que contribuyen a su formación y cierre, es imprescindible para poder observar e identificar anormalidades, tales como retraso en el cierre de la SOS. Aquí, nos propusimos para crear una serie estandarizada de protocolos que puede utilizarse para visualizar eficientemente el SOS combinando técnicas de microscopía disponible con técnicas de biología molecular comunes tales como coloración inmunofluorescente y mRNA sobreexpresión. Mientras que este conjunto de protocolos se centra en la capacidad de observar el retardo de cierre de SOS, es adaptable a las necesidades del experimentador y pueden modificarse fácilmente. En general, esperamos crear un método accesible a través del cual se puede avanzar nuestra comprensión de la SOS para ampliar el conocimiento actual del desarrollo del ojo vertebrado.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formación del ojo vertebrado es un proceso altamente conservado en que vías de señalización intercelulares cuidadosamente orquestadas establecen tipos de tejidos y especifican identidad regional1. Perturbaciones a la morfogénesis temprana de ojo provocar defectos profundos en la arquitectura del ojo y con frecuencia son ciego2. Una de esas enfermedades resultado de la falta para cerrar la fisura ocular coroide en la parte ventral de la taza óptica3. Este trastorno, conocido como coloboma ocular, se estima para ocurrir en 1 fuera de 4-5000 nacidos vivos y causa el 3-11% de ceguera pediátrica, que se manifiesta comúnmente como una ojo de la cerradura-como la estructura que sobresale en parte inferior de la pupila en el centro del ojo4, 5,6. La función de la fisura coroide es proporcionar un punto de entrada de vasculatura temprana creciendo en la Copa óptica, después de que los lados de la fisura fusible para incluir los vasos7.

Mientras que el coloboma ocular ha sido conocido desde la antigüedad, recientemente hemos identificado un nuevo subconjunto de pacientes con coloboma con pérdida de tejido que afectan el aspecto dorsal superior del ojo. Trabajos recientes en nuestro laboratorio ha conducido al descubrimiento de una estructura ocular en el ojo dorsal del pez cebra, que llamamos el surco ocular superior (SOS) o fisura superior8. Es importante tener en cuenta que la estructura tiene características de un surco y una fisura. Similar a un surco, es una capa de tejido continuo que abarca desde la nasal de la retina temporal. Además, el cierre de la estructura no está mediado por una fusión de los dos opuestos de la membrana del sótano, y que parece requerir un proceso morfogenético por que la estructura está poblada por las células. Sin embargo, similar a una fisura, forma una estructura que separa las partes nasal y temporales del ojo dorsal con la membrana basal. Coherencia, nos referiremos a él como SOS en este texto.

El SOS es evolutivamente conservado en vertebrados, siendo visible durante la morfogénesis de ojo de pescado, pollo, newt y mouse8. En contraste con la fisura coroide, que está presente desde la fecundación después de 20-60 horas (hpf) en el pez cebra, el SOS es muy transitorio, visible de 20-23 hpf y ausente por hpf 268. Investigaciones recientes en nuestro laboratorio ha encontrado que, similar a la fisura de la coroide, el SOS desempeña un papel en dirección vascular durante la morfogénesis de ojo8. Aunque los factores que controlan la formación y el cierre del SOS no se entienden todavía completamente, nuestros datos destacan papeles ojo dorsal ventral patrones genes8.

Pez cebra es un organismo modelo excelente para estudiar el SOS. Como sistema modelo, ofrece una serie de ventajas en el estudio de desarrollo del ojo: es un modelo vertebrado; cada generación presenta alta fecundidad (~ 200 embriones); su genoma se ha secuenciado completamente lo que facilita la manipulación genética; y aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un pez cebra orthologue, convirtiéndolo en un modelo ideal basado en la genética de la enfermedad humana9,10. Lo más importante, su desarrollo lleva a cabo externamente a la madre, y sus larvas son transparentes, que permite la visualización del ojo en desarrollo con relativa facilidad11.

En este conjunto de protocolos, se describen las técnicas a través del cual se puede visualizar el SOS en larvas de pez cebra. La variedad de técnicas de visualización utilizado en este informe permitirá observación clara de los SOS durante el desarrollo normal del ojo, así como la capacidad para detectar defectos de cierre de SOS. Nuestros protocolos de ejemplo contará con investigaciones de Gdf6, un BMP localizada en la dorsal ojos y conocido regulador de cierre de SOS. Además, estas técnicas pueden combinarse con manipulaciones experimentales para identificar factores genéticos o agentes farmacológicos que afectan el cierre y la correcta formación de SOS. Además, hemos incluido un protocolo mediante el cual la imagen fluorescente de todas las membranas celulares es posible, lo que permite al experimentador observar cambios morfológicos en las células que rodean el SOS. Nuestro objetivo es establecer una serie de protocolos estandarizados que pueden utilizarse en toda la comunidad científica para ofrecer nuevas penetraciones en la estructura de novela del ojo en desarrollo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad del Comité de uso y cuidado de animales de Alberta.

1. Protocolo n ° 1: Visualización de SOS con Estereomicroscopio y proyección de imagen de interferencia diferencial (DIC) de contraste

  1. Colección de embriones
    1. En un tanque de agua declorada, preparar cruces de gdf6a+- pez cebra en la noche por la vinculación de un pez cebra macho con una hembra pez cebra. Asegúrese de separar el macho de la hembra mediante un divisor para asegurar que los embriones nacen dentro de un intervalo pequeño de tiempo.
    2. A la mañana siguiente, tire el divisor y permiten el pez cebra criar para no más de 30 minutos recogen los embriones en placas de Petri con los medios E3, se describe en el libro de los peces cebra12y colocarlos en una incubadora de 28,5 ° C.
    3. Eliminar huevos no fertilizados o embriones muertos, que aparecen blanco y opaco.
  2. Preparación y vivir-la proyección de imagen de embriones de pez cebra
    1. 20 hpf, reemplace el E3 media medios E3 que contienen 0.004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) para evitar la producción de pigmento.
      Nota: Además de PTU en un punto un poco más tarde, como 22-24 hpf, es improbable que interfieran con el experimento de debido a la temprana edad de los embriones en el momento de la proyección de imagen. Sin embargo, se recomienda para el tratamiento de los embriones temprano para prevenir totalmente la pigmentación ya que hay una banda de pigmentación que aparece en la vista dorsal, que puede interferir con la imagen de la SOS.
    2. Garantizar que todos los embriones en las etapas de desarrollo correcto en varios puntos a la hora de observación. Se recomienda que se realice en las etapas en que somite número es claramente visible como se indica por Kimmel et al.13. Eliminar aquellos que son inmaduros al desarrollo.
    3. Coloque los embriones bajo un microscopio de disección y dechorionate los embriones tirando suavemente aparte el corion con unas pinzas finas. Visualizar el SOS en la vista dorsal. El SOS puede aparecer como una muesca en el margen dorsal del ojo, y una línea debe ser visible a través de la vista dorsal. Para el cierre de SOS normal, observar los embriones en torno a 20-23 hpf. Para la examinación de los fenotipos de cierre de SOS retrasadas, observar los embriones 28 hpf o más tarde.
    4. Clasificar los embriones que muestran retardo del cierre de SOS de los que no.
    5. Para fotografiar estos embriones utilizando un microscopio de disección, preparar un plato de Petri que contenga 1% agarosa en E3. Pinchar ligeramente el centro de la agarosa para crear un agujero poco profundo en el que la yema del embrión puede sentarse cuando el embrión se coloca en la agarosa. Esto asegurará que el embrión no está en un ángulo oblicuo al ser fotografiados.
    6. Anestesiar los embriones con Metanosulfonato de 0.003% en E3 y lateralmente en la agarosa.
    7. Para los embriones usando un microscopio compuesto o confocal de imágenes, transferir el embrión en 35 mm placa de Petri que contiene un pequeño bolo de no cuajó bajo punto de fusión punto de agarosa al 1% en E3 (w/v). Coloque el embrión lateralmente usando un sedal fino o una pestaña y esperar a que la agarosa se enfríe rápidamente. Una vez firme la agarosa, vierta suficiente E3 en el plato para cubrir la agarosa. Para más detalles, ver Distel y Köster14.
      Nota: Si está usando un microscopio invertido, el embrión puede ser colocado contra el vidrio de un plato de vidrio-cubreobjetos-bottom y fotografiado con un estándar de 20 X lente objetiva.
    8. Utilice un objetivo de inmersión x 20 agua para visualizar el SOS con un microscopio compuesto. Después de visualización, suavemente tire la agarosa de los embriones y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) o permitir que continúen su desarrollo.

2. Protocolo 2: Whole-mount de coloración inmunofluorescente del laminin

  1. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 1
    1. Dechorionate embriones como se describe en el paso 1.2.3, si no lo ha hecho. Fijar los embriones en un tubo de microcentrífuga en el punto deseado en el recién hecho 4% PFA por 2 h en un agitador de temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
      Nota: Después de la gastrulación, embriones pueden fijar mejor después de dechorionation.
    2. Permeabilizar embriones en proteinasa de 10 mg/mL K a temperatura ambiente por 5 minutos tiempo de incubación dependerá de la etapa de desarrollo en el cual los embriones son fijos (ver Thisse y Thisse15).
    3. Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
    4. Bloque de embriones en una solución de 5% cabra suero y 2 mg/mL albúmina de suero bovino (BSA) en 1xPBST para 1-2 h en un agitador de la temperatura ambiente.
    5. Preparar solución de anticuerpo primario por diluir el anticuerpo de conejo anti-laminina en la solución de bloque en una dilución 1: 200.
    6. Incubar los embriones en el anticuerpo primario anti-laminina durante la noche en un agitador de 4 ° C.
  2. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 2
    1. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cinco veces.
    2. Preparar la solución de anticuerpo secundario por diluir el anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 en 1 x PBST a una dilución de 1: 1000.
      Nota: Es posible adaptar este paso para adaptarse a los recursos disponibles al experimentador, mediante el uso de un anticuerpo secundario diferente.
    3. Incubar los embriones en el anticuerpo secundario durante la noche en un agitador de 4 ° C. Proteger de la luz tanto como sea posible de este paso adelante.
    4. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cuatro veces. Los embriones pueden almacenarse a 4 ° C por hasta una semana, si es necesario.
  3. Disección y montaje de ojos embrionarios
    1. Si lo desea, coloque los embriones en una placa Petri pequeña y deyolk los embriones en 1 x PBST. Para ello, interrumpir la yema de huevo con unas pinzas finas y eliminar las células de la yema mediante raspado suave de la vesícula vitelina.
    2. Preparar las siguientes concentraciones de glicerol PBS serie soluciones en tubos de microcentrífuga: glicerol 30%, 50% y 70% en PBS. Transferencia de embriones en 30% glicerol/PBS, asegurándose de colocar los embriones en la parte superior la solución y la transferencia de tan poco de la solución anterior como sea posible. Espere a que los embriones a hundirse hasta el fondo del tubo.
    3. Cuando los embriones han hundido en el fondo, transferir al 50% glicerol/PBS. Repetición y transferencia a 70% glicerol/PBS.
    4. Una vez que los embriones han hundido en 70% glicerol/PBS, moverlos a un pequeño plato de plástico para disecciones.
    5. Cortar el embrión posterior al cerebelo y utilice el tejido posterior para genotipificación, si es necesario.
    6. Mover la cabeza de un portaobjetos de vidrio, transferencia como glicerol poco como sea posible. Utilice pinzas u otras herramientas de disección fina para sujetar en el extremo posterior para mantener la cabeza inmóvil. Use un alfiler fino minutien u otras herramientas de disección fina suavemente introducir en el ventrículo del cerebro anterior de la anterior y empuje hacia abajo para separar las mitades derecha e izquierdas de la cabeza de uno al otro. Repita este movimiento posteriormente a través del mesencéfalo y en el ventrículo del hindbrain, esencialmente fileting la cabeza hacia abajo de la línea media. Esto reduce al mínimo la manipulación manual del ojo y el tejido circundante, dejando intacto el SOS.
    7. Montar cada lado de la línea media cabeza hacia abajo, ojo para arriba. Cuatro entradas de grasa para vacío en las esquinas (una distancia apropiada para el cubreobjetos se utiliza) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio, presionar secuencialmente en cada post hasta el cubreobjetos en contacto con las muestras. Pipeta con glicerol al 70% en el borde del cubreobjetos para que el glicerol se tira abajo, llenando el espacio entre el cubreobjetos y la diapositiva.
    8. Muestras de la imagen dentro de un día, o un sello en el cubreobjetos con la muestra de imagen sólo después de que se haya secado el esmalte de uñas y esmalte de uñas. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C.

3. Protocolo 3: Visualización de SOS usando eGFP CAAX mRNA

  1. Síntesis de mRNA de eGFP CAAX
    1. Alinear 1 mg de plásmido pCS2-eGFP-CAAX16 con NotI en un volumen de reacción de 40 mL durante 4 horas a 37 ° C.
    2. Para detener la reacción de digestión de restricción, añadir 10 mL libre de Rnasa de agua, 2,5 mL 10% SDS y 2,0 mL 10 mg/mL de proteinasa K.
    3. Incubar 1 hora a 50 ° C.
    4. Agregue lo siguiente para la reacción (volumen total 200 mL) y proceder al siguiente paso: 50 mL libre de Rnasa de agua, 20 mL 3 M sodio acetato pH 5.2 y 75,5 mL libre de Rnasa de agua
      Nota: El agua libre de ARNasa se agrega en dos ocasiones para evitar la excesiva dilución del acetato de sodio.
  2. Purificación del ADN mediante fenol/cloroformo extracción y etanol de precipitación
    1. Añadir 200 mL de alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico y vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
    2. Transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo. Añadir un volumen igual de cloroformo al tubo de nuevo.
      Nota: La adición de cloroformo es opcional, pero se recomienda para asegurar la completa remoción del fenol de la muestra.
    3. Vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
    4. Como antes, transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo.
    5. Añadir el 1/10 volumen de 3 M sodio acetato pH 5.2.
    6. Precipitar el ADN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% libre de ARNasas y frío a-20 ° C durante 15 minutos la centrifugadora a 18.000 x g por 20 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
    7. Lavar el precipitado con 100 mL de agua fría de la Rnasa-libre etanol del 70%. Después de mezclar suavemente para romper los pellets sueltos, centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
    8. Secar el pellet por 5 min y resuspender el ADN en 7 mL de agua.
      Nota: La pastilla deba ser secada durante más de 5 min dependiendo el flujo de aire disponible.
  3. Transcripción y purificación de eGFP CAAX mRNA
    1. De una manera libre de Rnasa, preparar una reacción de transcripción en vitro con un kit de polimerasa Sp6 RNA comercialmente disponible, utilizando aproximadamente 1 mg de plásmido linearizado purificado ADN obtenido en el paso 3.2. Incubar por 2 h a 37 ° C.
      Nota: Sp6 RNA polimerasa debe usarse para la producción de mRNA tapado.
    2. Añadir 1 mL de DNasa (2 U/mL; Libre de ARNasas) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
    3. Purificar el ARNm con cualquier kit de purificación de RNA comercialmente disponible. Alícuota del mRNA para evitar la congelación y descongelación repetida y almacenar a-80 ° C.
  4. Inyección y visualización
    1. Obtener embriones en protocolo 1.1.
    2. Usar un aparato de microinyección, inyectar 300 pg de eGFP CAAX mRNA en la etapa de 1 célula.
    3. Pantalla de embriones con la brillante expresión de eGFP en los ojos utilizando un estereoscopio de fluorescencia.
    4. Imagen de los embriones como se describe en el protocolo de 1.2.
    5. Alternativamente, dechorionate y fijar los embriones en el punto deseado en el 4% PFA durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4° C. Lave los embriones en el 1 x SAFT durante 5 minutos, cuatro veces y dechorionate, si no ha hecho. Diseccionar los ojos y móntelas en las diapositivas como se describe en el protocolo 2.3.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El pez cebra SOS aparece en 20 hpf en la presunta retina dorsal8. 23 hpf el SOS las transiciones de su arquitectura inicial estrecha a una muesca amplia y 26 hpf ya no es visible8. Por lo tanto, para examinar el SOS durante el desarrollo de ojo de pez cebra normal, deben observarse los embriones entre 20-23 hpf. Durante este período, el SOS es observable mediante el microscopio de disección y a través de la proyección de imagen de DIC como u...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el SOS en el embrión de pez cebra en desarrollo. Para determinar fenotipos de retardo de cierre, los protocolos se han centrado en la capacidad de distinguir la separación de dos lóbulos discretos de los lados del ojo, similar a las técnicas utilizadas para visualizar retardo de cierre de fisura coroide nasal dorsal y dorsal-temporal fenotipos en la vista ventral.

Estas técnicas de visualización pueden utilizarse junto con u...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores tienen intereses contradictorios a declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC), Alberta Innova tecnología futuros y la mujer e Instituto de investigación de salud (WCHRI de los niños).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-fenil 2-tioureaSigma AldrichP7629-10G
Placa de Petri de 100 mmFisher ScientificFB0875713
Placa de Petri de 35 mmCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA7906-100G
Microscopio DIC/FluorescenciaZeissAxioImager Z1
Microscopio de disecciónOlympusSZX12
Cámara de microscopio de disecciónQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning Grasa de alto vacíoFisher Scientific14-635-5D
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína)Sigma AldrichA5040-25G
Cabra anti-conejo Alexa Fluor 488Abcamab150077
Suero de cabraSigma AldrichG9023
Software de captura de imágenesZeissZEN
IncubadoraVWRModelo 1545
Cubierta de vidrio para microscopio (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
Portaobjetos para microscopioFisher Scientific12-544-2
Pin de minuciedadFine Science Tools26002-10
mMessage mMachine Sp6 Kit de transcripciónInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehído ( PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico pH 6.7 +/- 0.2Fisher ScientificBP1752-100
Proteinasa KSigma AldrichP4850
Anticuerpo anti-laminina de conejoMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µ L)InvitrogenAM2238
Agarosa ultrapura de bajo punto de fusiónInvitrogen16520-100
Sulfato de dodecilo de sodio ultrapuro (SDS)Invitrogen15525017

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Embriog nesis del pez cebratinci n inmunofluorescentesobreexpresi n de ARNmcontraste de interferencia diferencialmicroscop a confocalmicroscop a de disecci ntinci n de lamininaexpresi n de GFP CAXretraso en el cierre del SOS

Artículos relacionados